CN109734758A - 核桃青皮化学成分的提取、分离、纯化方法及其应用 - Google Patents

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CN109734758A CN201811542802.XA CN201811542802A CN109734758A CN 109734758 A CN109734758 A CN 109734758A CN 201811542802 A CN201811542802 A CN 201811542802A CN 109734758 A CN109734758 A CN 109734758A
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闫福林
李彦灵
马矜烁
詹璐璐
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Abstract

本发明公开了一种核桃青皮化学成分的提取、分离、纯化方法及其应用，该方法从核桃青皮中分离得到13种化合物，分别鉴定为：3,5‑二甲氧基‑4‑羟基‑苯甲酸‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷（1）、myricananin F（2）、β‑谷甾醇（3）、齐墩果酸（4）、核桃酮（5）、积雪草酸（6）、常春藤皂苷元（7）、β‑胡萝卜苷（8）、(4R)‑4，8‑二羟基‑α‑四氢萘酮‑4‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷（9）、3β,23‑二羟基‑12‑烯‑28‑乌苏酸（10）、熊果酸（11）、丁香酸（12）、Juglanoside B（13）。经体外抗肿瘤活性筛选，发现其中部分化合物对癌细胞具有一定的生长抑制活性，能够进一步用于制备抗癌药物。

Description

核桃青皮化学成分的提取、分离、纯化方法及其应用
技术领域
本发明属于核桃青皮化学成分的提取、分离、纯化技术领域，具体涉及一种核桃青皮化学成分的提取、分离、纯化方法及其应用。
背景技术
核桃青皮，又称青龙衣，为胡桃科植物核桃(Juglans regia L.)和核桃楸(J.mandshurica Maxim.)的未成熟果皮。我国核桃资源丰富，除河南外，在河北、山东、东北等省份都有分布。核桃青皮辛、苦、涩、有毒、微寒，具有清热、解毒、治痢、明目、抗肿瘤等作用，因而具有较大的医药应用价值。但迄今为止，国内外学者对核桃青皮有效成分的系统研究不多，往往更关注经济价值最高的果实部分，而核桃外面的果皮部分常被忽略，核桃成熟期间，大量青皮常作为垃圾被堆放在地头，造成环境污染及资源浪费。如能搞清楚核桃青皮的化学成分，并加以综合开发利用，不仅可以保护环境，还可以增加经济收入。为了进一步了解不同产地的核桃青皮的化学成分，探讨其药用价值，本实验对采自河南省洛阳市嵩县车村镇的核桃青皮的化学成分进行研究，从中提取分离得到多种化合物，并对提取分离得到的化合物进行体外抗肿瘤活性筛选，以期进一步用于制备抗癌药物。目前，尚没有该方面的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种核桃青皮化学成分的提取、分离、纯化方法及其应用，该方法从核桃青皮中分离得到13种化合物，经体外抗肿瘤活性筛选，发现其中部分化合物对癌细胞具有一定的生长抑制活性，能够进一步用于制备抗癌药物。
本发明为实现上述目的采用如下技术方案，核桃青皮化学成分的提取、分离、纯化方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：取核桃青皮阴干粉碎后，在常温下用甲醇对其进行浸泡，每次浸泡6天，总共浸泡4次，过滤，滤液进行减压浓缩得甲醇提取物浸膏，再加入60～70℃温水悬浮，分别用乙酸乙酯和正丁醇对其进行多次萃取，萃取液减压浓缩分别得到乙酸乙酯部分浸膏和正丁醇部分浸膏；
步骤S2：乙酸乙酯部分浸膏用200～300目的硅胶拌样，干法上柱进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为1:0、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将洗脱液通过薄层色谱检识合并后得到6个部分Fr.I-Fr.VI；
Fr.I：未分离；
Fr.II：通过硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为15:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，再进行重结晶最终在体积比3:1处得到化合物12；
Fr.III：通过硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯进行第一次梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，最终在石油醚与乙酸乙酯体积比5:1处由丙酮重结晶得到化合物3，在石油醚与乙酸乙酯体积比1:1处用丙酮进行重结晶得到化合物2，将第一次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后进行第二次硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为10:1、5:1、3:1、1:1，将第二次梯度洗脱得到的样品再次经过薄层色谱检识后，一部分样品通过两次凝胶柱色谱以甲醇为洗脱剂进行洗脱得到化合物4，另一部分样品进行第三次硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为5:1、3:1、1:1，最终在体积比1:1处由丙酮重结晶得到化合物5；
FrIV：先用大孔吸附树脂处理，以体积比80:20的甲醇-水作为洗脱剂进行洗脱得到的浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行第一次梯度洗脱，其中氯仿与异丙醇的梯度体积比依次为20:1、10:1、5:1、1:1、0:1，将第一次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后分为A部分和B部分，A部分再经两次硅胶柱层析，两次均以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与异丙醇的体积比均为10:1，最终在体积比10:1处得到化合物6，B部分先经一次硅胶柱层析，以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与异丙醇的梯度体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1、0:1，将洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后再分为B1部分和B2部分，B1部分经过两次硅胶柱层析，两次均以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与异丙醇的体积比均为15:1，最终得到化合物10，B2部分经过两次硅胶柱层析，两次均以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与异丙醇的体积比均为10:1，再由丙酮重结晶最终得到化合物7；
Fr.V：通过硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇为洗脱剂进行第一次梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为30:1、20:1、15:1、5:1、1:1、0:1，将第一次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后进行第二次硅胶柱色谱，同样以氯仿-甲醇为洗脱剂进行第二次梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为20:1、15:1、10:1、0:1，将第二次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识并用丙酮重结晶得到化合物8；
Fr.VI：通过硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、0:1，将洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后再经两次凝胶柱层析，两次洗脱均以甲醇为洗脱剂，最终得到化合物11；
步骤S3：正丁醇部分浸膏用200～300目的硅胶拌样，干法上柱进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将对应洗脱液通过薄层色谱检识合并后共得到4个部分Fr.A-Fr.D；
Fr.A：通过硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行第一次梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将第一次洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后进行第二次硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为10:1、8:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将第二次洗脱得到的样品再次经过薄层色谱检识后进行第三次硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比为5:1，最终得到化合物1；
Fr.B：先用氯仿-甲醇进行硅胶柱层析，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为10:1、8:1、5:1、0:1，将洗脱得到的样品经薄层色谱检识后用MCI-GEL CHP20/P120反相柱色谱，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，其中甲醇的梯度体积百分含量依次为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，同样将此次洗脱得到的样品经薄层色谱检识后用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH 20，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，其中甲醇的梯度体积百分含量依次为10％、15％、20％，将最终得到的样品经薄层色谱检识后得到化合物13；
Fr.C：通过硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的体积比依次为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、0:1，将洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后再进行两次硅胶柱色谱，均以氯仿-甲醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与甲醇的体积比为10:1，依次将两次洗脱得到的样品经过薄层色谱检识，再经两次凝胶柱层析，最终得到化合物9；
Fr.D：未分离。
本发明所述的提取方法得到的化合物4在制备抑制人肝癌细胞增殖药物中的应用。
本发明所述的提取方法得到的化合物9在制备抑制人乳腺癌细胞增殖药物中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明采用柱色谱、重结晶等方法对核桃青皮进行分离、纯化，并利用现代波谱方法确定了化合物的结构，结果从核桃青皮中分离得到13种化合物，分别鉴定为：3,5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸-7-O-β-D-葡萄糖苷(1)、myricananin F(2)、β-谷甾醇(3)、齐墩果酸(4)、核桃酮(5)、积雪草酸(6)、常春藤皂苷元(7)、β-胡萝卜苷(8)、(4R)-4，8-二羟基-α-四氢萘酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)、3β,23-二羟基-12-烯-28-乌苏酸(10)、熊果酸(11)、丁香酸(12)、Juglanoside B(13)。其中，化合物1、2、6、7、9、10为首次从该植物中分离得到，且该六种化合物也均为首次从该属植物中分离得到。经体外抗肿瘤活性筛选，发现化合物4对人肝癌细胞(HepG-2)的增殖显示了较强的生长抑制活性，化合物9对人乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖具有一定的生长抑制活性。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
为了进一步了解不同产地的核桃青皮的化学成分，探讨其药用价值，本实验对采自河南省洛阳市嵩县车村镇的核桃青皮的化学成分进行研究，从中分离得到13种化合物，分别鉴定为：3,5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸-7-O-β-D-葡萄糖苷(1)、myricananin F(2)、β-谷甾醇(3)、齐墩果酸(4)、核桃酮(5)、积雪草酸(6)、常春藤皂苷元(7)、β-胡萝卜苷(8)、(4R)-4，8-二羟基-α-四氢萘酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)、3β,23-二羟基-12-烯-28-乌苏酸(10)、熊果酸(11)、丁香酸(12)、Juglanoside B(13)。其中，化合物1、2、6、7、9、10为首次从该植物中分离得到，且该六种化合物也均为首次从该属植物中分离得到。
采用MTT染色法，将化合物1～6、9、11、13分别与人肝癌细胞(HepG2)，人食管癌细胞(Eca109)，人乳腺癌细胞(MCF-7)，人结肠癌细胞(HCT-116)进行体外肿瘤细胞抑制测试。实验结果表明：化合物4对人肝癌细胞(HepG-2)的增殖显示了较强的生长抑制活性，化合物9对人乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖具有一定的生长抑制活性。
1仪器与材料
1.1仪器
Bruker-400型核磁共振波谱仪(Bruker公司，德国)；HP-5988A GC/MS质谱仪(HP公司，美国)；X-4型数显显微熔点仪测定(北京光电设备厂)。
1.2试剂
Sephadex LH-20(Pharmacia公司，美国)；MCI GEL CHP20/P120(MitsubishiChemical公司，日本)；柱层析用硅胶(200～300目)及薄层层析用硅胶GF254(10～40μm)(青岛海洋化工厂)；所用试剂均为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)。细胞株：人肝癌细胞(HepG2)，人食管癌细胞(Eca109)，人乳腺癌细胞(MCF-7)，人结肠癌细胞(HCT-116)(中科院上海细胞库)。
1.3植物来源
实验用核桃青皮于2013年6月采自河南省洛阳市嵩县车村镇，由新乡医学院药学院中药学教研室吴娇副教授鉴定，样本存放于新乡医学院药学院天然药物化学研究室。
2实验内容
2.1提取与分离
核桃青皮化学成分的提取、分离、纯化方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：取核桃青皮(17kg，干重)阴干粉碎后，在常温下用甲醇对其进行浸泡，每次浸泡6天，总共浸泡4次，过滤，滤液进行减压浓缩得甲醇提取物浸膏，再加入60～70℃温水悬浮，分别用乙酸乙酯和正丁醇对其进行多次萃取，萃取液减压浓缩分别得到乙酸乙酯部分浸膏(207.7g)和正丁醇部分浸膏(82.1g)；
步骤S2：乙酸乙酯部分浸膏用200～300目的硅胶(400g)拌样，干法上柱(12×150cm，3500g，200～300目)进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为1:0、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将洗脱液通过薄层色谱检识合并后得到6个部分Fr.I-Fr.VI；
Fr.I：未分离；
Fr.II：通过硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为15:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，再进行重结晶最终在体积比3:1处得到化合物12(72mg)；
Fr.III：通过硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯进行第一次梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，最终在石油醚与乙酸乙酯体积比5:1处由丙酮重结晶得到化合物3(254mg)，在石油醚与乙酸乙酯体积比1:1处用丙酮进行重结晶得到化合物2(17mg)，将第一次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后进行第二次硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为10:1、5:1、3:1、1:1，将第二次梯度洗脱得到的样品再次经过薄层色谱检识后，一部分样品通过两次凝胶柱色谱以甲醇为洗脱剂进行洗脱得到化合物4(150mg)，另一部分样品进行第三次硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为5:1、3:1、1:1，最终在体积比1:1处由丙酮重结晶得到化合物5(105mg)；
FrIV：先用大孔吸附树脂处理，以体积比80:20的甲醇-水作为洗脱剂进行洗脱得到的浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行第一次梯度洗脱，其中氯仿与异丙醇的梯度体积比依次为20:1、10:1、5:1、1:1、0:1，将第一次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后分为A部分和B部分，A部分再经两次硅胶柱层析，两次均以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与异丙醇的体积比均为10:1，最终在体积比10:1处得到化合物6(36mg)，B部分先经一次硅胶柱层析，以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与异丙醇的梯度体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1、0:1，将洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后再分为B1部分和B2部分，B1部分经过两次硅胶柱层析，两次均以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与异丙醇的体积比均为15:1，最终得到化合物10(21mg)，B2部分经过两次硅胶柱层析，两次均以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与异丙醇的体积比均为10:1，再由丙酮重结晶最终得到化合物7(20mg)；
Fr.V：通过硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇为洗脱剂进行第一次梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为30:1、20:1、15:1、5:1、1:1、0:1，将第一次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后进行第二次硅胶柱色谱，同样以氯仿-甲醇为洗脱剂进行第二次梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为20:1、15:1、10:1、0:1，将第二次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识并用丙酮重结晶得到化合物8(245mg)；
Fr.VI：通过硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、0:1，将洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后再经两次凝胶柱层析，两次洗脱均以甲醇为洗脱剂，最终得到化合物11(34mg)；
步骤S3：正丁醇部分浸膏用200～300目的硅胶拌样，干法上柱进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将对应洗脱液通过薄层色谱检识合并后共得到4个部分Fr.A-Fr.D；
Fr.A：通过硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行第一次梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将第一次洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后进行第二次硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为10:1、8:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将第二次洗脱得到的样品再次经过薄层色谱检识后进行第三次硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比为5:1，最终得到化合物1(11mg)；
Fr.B：先用氯仿-甲醇进行硅胶柱层析，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为10:1、8:1、5:1、0:1，将洗脱得到的样品经薄层色谱检识后用MCI-GEL CHP20/P120反相柱色谱，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，其中甲醇的梯度体积百分含量依次为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，同样将此次洗脱得到的样品经薄层色谱检识后用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH 20，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，其中甲醇的梯度体积百分含量依次为10％、15％、20％，将最终得到的样品经薄层色谱检识后得到化合物13(40mg)；
Fr.C：通过硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的体积比依次为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、0:1，将洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后再进行两次硅胶柱色谱，均以氯仿-甲醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与甲醇的体积比为10:1，依次将两次洗脱得到的样品经过薄层色谱检识，再经两次凝胶柱层析，最终得到化合物9(34mg)；
Fr.D：未分离。
2.2体外抗肿瘤活性测定
采用MTT法对人肝癌细胞(HepG2),人食管癌细胞(Eca109),人乳腺癌细胞(MCF-7),人结肠癌细胞(HCT-116)进行化合物体外肿瘤细胞抑制测试。将HepG2,Eca109,MCF-7,HCT116细胞培养于含有10wt％胎牛血清的1640培养基，在37℃、体积分数5％CO2条件下培养24h。各细胞均按每1mL 1×104个铺于96孔板。实验组细胞分别用不同浓度的不同化合物处理(150μL/孔)，而对照组只用DEME培养基处理(150μL/孔)。每孔加入5mg/mL的MTT溶液15μL，继续孵育4h，弃去培养基，每孔加入DMSO 150μL，振荡10min，于490nm处测定OD值，计算IC50值。
3实验结果
3.1结构鉴定
化合物1：无色针状晶体(CH3OH)，分子式C15H20O10，mp.160–161℃；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:7.38(2H,s,H-2,6),3.87(6H,s,3,5-OMe),5.66(1H,d,J＝7.74Hz,H-1'),3.36～3.50(4H,m,H-2'～5'),3.83(1H,dd,J＝12.0,2.3Hz,H-6'a),3.66(1H,dd,J＝12.0,4.3Hz,H-6'b)；13C-NMR(100MHz,CD3OD)δ:120.7(C-1),108.6(C-2),148.9(C-3),142.4(C-4),148.9(C-5),108.6(C-6),166.7(C-7),96.2(C-1’),74.1(C-2’),78.9(C-3’),71.4(C-4’),78.1(C-5’),62.3(C-6’),56.9(3,5×-OMe)。以上数据与文献报道基本一致(Su DM(苏东敏),Tang WZ(唐文照),Yu SS(庾石山),et al.Water-soluble constituents from rootsof Capparis tenera[J].Chin J Nat Med(中国中药杂志),2008,33:1021-1023.)，可以鉴定该化合物为3,5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸-7-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物2：白色无定形粉末，分子式C20H24O4，mp.196–198℃；HR-ESI-MS:m/z351.1568[M+Na]+(calculated for 351.1567)；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.67(1H,s,H-5),2.90～2.97(1H,m,Ha-7),2.47～2.54(1H,m,Hb-7),1.83～2.01(1H,m,Ha-8),1.83～2.01(1H,m,Hb-8),1.66～1.73(1H,m,Ha-9),1.53～1.59(1H,m,Hb-9),4.11(1H,t,J＝9.6Hz,H-10),1.83～2.01(1H,m,Ha-11),1.53～1.59(1H,m,Hb-11),2.90～2.97(1H,m,Ha-12),2.90～2.97(1H,m,Hb-12),2.28～2.35(1H,m,Ha-13),1.66～1.73(1H,m,Hb-13),7.10(1H,d,J＝8.3Hz,H-15),6.91(1H,d,J＝8.3Hz,H-16),7.19(1H,s,H-18),6.81(1H,s,H-19),3.92(MeO-,s,C-4)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:124.7(C-1),125.1(C-2),139.2(C-3),146.8(C-4),110.4(C-5),131.6(C-6),30.7(C-7),26.8(C-8),23.0(C-9),69.0(C-10),39.7(C-11),27.2(C-12),35.1(C-13),131.0(C-14),130.3(C-15),117.3(C-16),151.8(C-17),133.7(C-18),126.4(C-19),56.5(MeO-,C-4)。以上数据与文献报道基本一致(WangJF,Zhang CL,Lu Q,et al.Three new diarylheptanoids from Myrica nana[J].Helvetica Chimica Acta.2009,92:1594-1599.)，可以鉴定该化合物为myricananin F。
化合物3：无色针状结晶(石油醚)，mp.139–140℃,分子式C29H50O；Liebermann-Burchard反应呈现阳性,Molish反应呈现阴性；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.36(1H,d,J＝5.2Hz,H-6),3.55(1H,m,H-3),1.02(3H,s,Me-19),0.93(3H,d,J＝6.3Hz,Me-21),0.85(3H,d,J＝2.0Hz,Me-29),0.83(3H,d,J＝6.6Hz,Me-27),0.83(3H,s,Me-26),0.69(3H,s,Me-18)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:37.6(C-1),32.1(C-2),72.4(C-3),42.7(C-4),141.0(C-5),121.9(C-6),32.0(C-7),32.1(C-8),50.4(C-9),37.0(C-10),21.5(C-11),40.0(C-12),42.4(C-13),57.0(C-14),24.6(C-15),28.5(C-16),56.4(C-17),12.3(C-18),19.2(C-19),36.4(C-20),19.5(C-21),34.2(C-22),26.3(C-23),46.0(C-24),29.5(C-25),19.0(C-26),19.8(C-27),23.3(C-28),12.3(C-29)。以上数据与文献报道基本一致(Wei XH,Yang SJ,Liang N,et al.Chemical constituents of Caesalpinia decapetala(Roth)Alston[J].Molecules,2013,18:1325-1336.)，因此鉴定该化合物为β-谷甾醇。
化合物4：白色粉末，mp.279–280℃，分子式C30H48O3；Liebermann-Burchard反应呈现阳性；1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ:0.91,0.93,1.06,1.07,1.08,1.15,1.29(each 3H,s,7-CH3),3.38(1H,dd,J＝10.6,4.0Hz,H-3),5.44(1H,m,H-12),2.98(1H,dd,J＝13.6,4.0Hz,H-18)；13C-NMR(100MHz,C5D5N)δ:38.9(C-1),28.0(C-2),78.1(C-3),39.3(C-4),55.8(C-5),18.7(C-6),33.2(C-7),39.7(C-8),48.1(C-9),37.3(C-10),23.7(C-11),122.5(C-12),144.8(C-13),42.1(C-14),28.3(C-15),23.7(C-16),46.6(C-17),42.0(C-18),46.4(C-19),30.9(C-20),34.2(C-21),33.2(C-22),28.7(C-23),16.5(C-24),15.5(C-25),17.4(C-26),26.1(C-27),180.2(C-28),33.2(C-29),23.8(C-30)。以上波谱数据与文献报道基本一致(Liu SX(刘书霞),Li ZL(李振麟),Lan TJ(兰太进),et al.Chemical constituentsfrom leaves of Adinandra nitida[J].China Tradit Herbal Drugs(中草药),2016,47:2436-2440.)，因此鉴定该化合物为齐墩果酸。
化合物5：无色针状结晶(CHCl3),紫外光365nm下有荧光斑点，mp.73-74℃，分子式C10H10O3。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:12.5(1H,s,OH-8),7.48(1H,t,J＝8.0,H-6),7.01(1H,d,J＝7.6Hz,H-5),6.90(1H,d,J＝8.4Hz,H-7),4.89(1H,dd,J＝7.2,4.0Hz),2.98(1H,ddd,J＝18.0,8.3,4.8Hz,H-2a),2.64(1H,ddd,J＝18.0,8.3,4.8Hz,H-2b),2.33(1H,m,H-3a),2.16(1H,m,H-3b)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:204.6(C-1),34.7(C-2),31.4(C-3),67.8(C-4),117.6(C-5),137.2(C-6),117.9(C-7),162.8(C-8),146.1(C-9),115.4(C-10)。以上波谱数据与文献报道基本一致(Liu JX,Di DL,Li C,et al.Regiolone from the pericarpsof Juglans regia L[J].Acta Cryst.(E),2007,63：02713-02714.)，因此鉴定该化合物为核桃酮。
化合物6：白色粉末，mp.327–328℃，分子式C30H48O5；Liebermann-Burchard反应呈现阳性；1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ:5.49(1H,t,J＝4.0Hz,H-12),4.26(1H,d,J＝4.0Hz,H-2),4.26(1H,d,J＝4.0Hz,H-3),4.22(1H,d,J＝10.6Hz,Ha-23),3.72(1H,d,J＝10.6Hz,Hb-23),1.16(3H,s,Me-25),1.10(3H,s,Me-24),1.09(3H,s,Me-26),1.08(3H,s,Me-27),0.99(3H,d,J＝6.2Hz,H-30),0.97(3H,d,J＝6.2Hz,H-29)；13C-NMR(100MHz,C5D5N)δ:48.2(C-1),66.7(C-2),78.5(C-3),44.0(C-4),48.3(C-5),18.8(C-6),33.5(C-7),40.4(C-8),48.2(C-9),38.6(C-10),24.2(C-11),125.9(C-12),139.6(C-13),42.9(C-14),29.0(C-15),25.2(C-16),48.4(C-17),53.8(C-18),39.8(C-19),39.7(C-20),31.4(C-21),37.8(C-22),69.2(C-23),14.8(C-24),17.9(C-25),17.8(C-26),24.1(C-27),180.3(C-28),17.8(C-29),21.7(C-30)。以上波谱数据与文献报道基本一致(He WN,Dai JG,Ye M,et al.Microbialtransformation of asiatic acid by Alternaria longipes[J].Journal of AsianNatural Products Research,2010,12:760-764.)，因此鉴定该化合物为积雪草酸。
化合物7：白色无定形粉末，分子式C30H48O4，mp.331–333℃；Liebermann-Burchard反应呈现阳性；1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ:4.25(1H,d,J＝10.5Hz,H-3),3.31(1H,dd,J＝13.0,3.9Hz,H-5),5.49(1H,brs,H-12),3.30(1H,dd,J＝13.1,4.2Hz,H-18),4.25(1H,d,J＝10.3Hz,H-23α),3.73(1H,d,J＝10.3Hz,H-23β),1.25(3H,s,H-24),1.05(3H,s,H-25),1.03(3H,s,H-26),1.02(3H,s,H-27),1.00(3H,s,H-29),0.94(3H,s,H-30)；13C-NMR(100MHz,C5D5N)δ:39.1(C-1),28.0(C-2),73.7(C-3),43.2(C-4),48.9(C-5),18.9(C-6),33.6(C-7),40.1(C-8),48.5(C-9),37.6(C-10),24.2(C-11),122.9(C-12),145.2(C-13),42.5(C-14),28.7(C-15),24.1(C-16),47.0(C-17),42.3(C-18),46.8(C-19),31.3(C-20),34.5(C-21),33.5(C-22),68.2(C-23),13.5(C-24),16.3(C-25),17.8(C-26),26.5(C-27),180.6(C-28),33.3(C-29),24.0(C-30)。以上数据与文献报道基本一致(Wei Q(卫强),QiuZ(邱振),Xu F(徐飞),et al.Chemical components from leaves of Futsia japonicaand Their Anti tumor Activities in vitro[J].Chin Med Matl(中药材),2015,38:745-750.)，故鉴定此化合物为常春藤皂苷元。
化合物8：白色粉末，分子式C35H60O6，mp.295–296℃；Liebermann-Burchard反应呈现阳性；1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ:5.33(1H,t,J＝2.6Hz,H-6),5.07(1H,d,J＝7.8Hz,H-1'),4.56(2H,dd,J＝2.5,11.6Hz,H-6'),4.40(1H,dd,J＝5.5,12.0Hz,H-4'),0.96(3H,d,J＝6.6Hz,CH3-21),0.92(3H,s,CH3-18),0.88(6H,d,J＝1.9Hz,CH3-26,27),0.86(3H,t,J＝6.9Hz,CH3-29),0.67(3H,s,CH3-19)；13C-NMR(100MHz,C5D5N)δ:38.0(C-1),30.9(C-2),79.0(C-3),40.5(C-4),141.4(C-5),122.5(C-6),32.8(C-7),32.8(C-8),50.9(C-9),37.5(C-10),21.9(C-11),40.5(C-12),42.9(C-13),57.3(C-14),25.1(C-15),28.9(C-16),56.9(C-17),19.5(C-18),12.5(C-19),36.9(C-20),19.9(C-21),34.9(C-22),27.0(C-23),46.5(C-24),29.9(C-25),20.5(C-26),19.9(C-27),23.9(C-28),12.8(C-29),103.2(C-1'),75.8(C-2'),79.1(C-3'),72.2(C-4'),78.6(C-5'),63.3(C-6')。以上数据与文献报道基本一致(Tang WX(唐万侠),Wu XF(吴晓峰),Zhao M(赵明),et al.Chemical constituents frominflorescence bracts of Arctii Fructus[J].China Tradit Herbal Drugs(中草药),2015,46:958-961.)，故鉴定此化合物为β-胡萝卜苷。
化合物9：白色粉末,紫外光365nm下有荧光斑点，分子式C16H20O8，mp.120–122℃；HR-ESI-MS m/z:363.1060[M+Na]+(calculated for 363.1050[M+Na]+)；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:3.02(1H,m,Hβ-2),2.54(1H,m,Hα-2),2.32(2H,m,H-3),5.13(1H,m,H-4),7.48(1H,d,J＝7.4Hz,H-5),7.42(1H,t,J＝8.0Hz,H-6),7.00(1H,dd,J＝8.3,1.0Hz,H-7),5.00(1H,d,J＝7.8Hz,H-1'),4.08(1H,m,H-2'),4.24(1H,m,H-3'),4.24(1H,m,H-4'),4.00(1H,m,H-5'),4.29(2H,d,J＝7.4Hz,H-6'),12.80(br s,-OH)；13C-NMR(100MHz,C5D5N)δ:205.3(C-1),34.7(C-2),30.4(C-3),73.8(C-4),119.7(C-5),136.8(C-6),117.8(C-7),163.1(C-8),143.9(C-4a),116.2(C-8a),103.5(C-1'),75.3(C-2'),78.6(C-3'),71.6(C-4'),78.6(C-5'),62.8(C-6')。以上数据与文献报道基本一致(Wang YF,Cao J,Thomas E,etal.Cytotoxic and new Tetralone Derivatives from Berchemia floribunda(WALL.)BRONGN[J].Chemistry&Biodiversity,2006,3:646-653.)，故鉴定此化合物为(4R)-4,8-二羟基-α-四氢萘酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物10：白色粉末，分子式C30H48O4，mp.283–285℃；Liebermann-Burchard反应呈现阳性；1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ:5.35(1H,t,J＝3.5Hz,H-12),4.02(1H,d,J＝10.6Hz,Ha-23),3.60(1H,d,J＝10.6Hz,Hb-23),3.59(1H,m,H-3),1.40,1.35,1.15,1.13(each 3H,s,4×-Me),1.08(3H,d,J＝2.8Hz,H-30),1.06(3H,d,J＝6.5Hz,H-29)；13C-NMR(100MHz,C5D5N)δ:39.3(C-1),26.5(C-2),73.7(C-3),43.9(C-4),48.4(C-5),18.8(C-6),33.3(C-7),40.3(C-8),48.9(C-9),37.5(C-10),24.3(C-11),126.0(C-12),139.6(C-13),43.2(C-14),27.9(C-15),24.3(C-16),48.4(C-17),53.9(C-18),39.3(C-19),31.3(C-20),37.5(C-21),33.3(C-22),65.2(C-23),13.5(C-24),16.5(C-25),17.8(C-26),24.3(C-27),180.3(C-28),17.8(C-29),21.8(C-30)。以上数据与文献报道基本一致(Shu JC(舒积成),Chou GX(侴桂新),Wang ZT(王铮涛).Triterpenoids constituents in fruits of Psidium guajavaLinn[J].Chin J Nat Med(中国中药杂志),2009,34:3047-3050.)，故鉴定此化合物为3β,23-二羟基-12-烯-28-乌苏酸。
化合物11：无色针晶(CH3OH)，分子式C30H48O3，mp.258–260℃；Liebermann-Burchard反应呈现阳性；1H-NMR(400MHz,C5D5N)δ:3.36(1H,dd,J＝10.6,5.6Hz,H-3),5.45(1H,brs,H-12),1.02(3H,s,H-23),0.85(3H,s,H-24),0.88(3H,s,H-25),1.16(3H,s,H-26),1.30(3H,s,H-27),0.92(3H,s,H-29),1.01(3H,s,H-30)；13C-NMR(100MHz,C5D5N)δ:39.4(C-1),28.5(C-2),78.9(C-3),39.4(C-4),55.5(C-5),18.5(C-6),33.5(C-7),40.2(C-8),47.8(C-9),39.0(C-10),23.3(C-11),125.5(C-12),138.7(C-13),42.2(C-14),28.5(C-15),24.3(C-16),48.0(C-17),53.0(C-18),40.9(C-19),38.9(C-20),31.0(C-21),37.1(C-22),28.5(C-23),15.6(C-24),16.1(C-25),17.3(C-26),23.6(C-27),180.3(C-28),17.3(C-29),21.5(C-30)。以上数据与文献报道基本一致(Liu JX,Di DL,Shi YP,etal.Diversity of Chemical Constituents from Saxifraga montana H.[J].J.Chin.Chem.Soc.,2008,55:863-870；Li HY(李火云),Jiao K(焦珂),Zhang P(张鹏),etal.Chemical constituents from Isodon excisoides[J].China Tradit Herbal Drugs(中草药),2014,45:154-160.)，故鉴定此化合物为熊果酸。
化合物12：无色针状结晶(CO(CH3)2),紫外光365nm下有荧光斑点，分子式C9H10O5，mp.207–208℃；1H-NMR(400MHz,CO(CD3)2)δ:8.02(4-OH),7.30(2H,s,H-2,6),3.87(6H,s,3,5-OMe)；13C-NMR(100MHz,CO(CD3)2)δ:121.0(C-1),107.6(C-2,6),148.0(C-3,5),141.1(C-4),167.2(-COOH),56.3(3,5-OMe)。以上数据与文献报道基本一致(Wang CW(王呈文),ChenGY(陈光英),Song XP(宋小平),et al.Chemical constituents from roots ofMillettia speciosa[J].China Tradit Herbal Drugs(中草药),2014,45:1515-1520.)，故鉴定此化合物为丁香酸。
化合物13：白色无定形粉末,紫外光365nm下有荧光斑点；分子式C16H20O8,mp.157–158℃；1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:3.14(1H,m,Ha-2),2.49(1H,m,Hb-2),2.20(1H,m,Ha-3),2.57(1H,m,Hb-3),5.42(1H,t,J＝3.2Hz,H-4),7.11(1H,dd,J＝7.9,1.1Hz,H-6),7.29(1H,t,J＝7.9Hz,H-7),7.49(1H,dd,J＝7.9,1.1Hz,H-8),4.62(1H,d,J＝7.9Hz,H-1'),3.20(1H,dd,J＝8.7,7.9Hz,H-2'),3.36(1H,H-3'),3.37(1H,H-4'),3.36(1H,H-5'),3.72(1H,dd,J＝12.2,2.9Hz,Ha-6'),3.93(1H,d,J＝11.9Hz,Hb-6')；13C-NMR(100MHz,CD3OD)δ:201.1(C-1),34.1(C-2),30.2(C-3),69.9(C-4),157.1(C-5),122.1(C-6),130.6(C-7),119.0(C-8),134.6(C-9),129.9(C-10),104.0(C-1'),75.5(C-2'),78.2(C-3'),71.7(C-4'),78.2(C-5'),62.8(C-6')。以上数据与文献报道基本一致(Liu LJ,Li W,Kazuo Koike,etal.Newɑ-Tetralonly Glucosides from the fruit of Juglansmandshurica[J],Chem.Pharm.Bull,2004,52:566-569.)，故鉴定此化合物为Juglanoside B。
表1 核桃青皮的化学成分及结构式
3.2体外抗肿瘤活性结果
由表2可知，化合物4对人肝癌细胞(HepG2)的增殖显示了较强的生长抑制活性，化合物9对人乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖具有一定的生长抑制活性，其它化合物则无明显的细胞毒性。
表2 化合物的抗肿瘤活性(IC50)
综上所述，本研究采用柱色谱、重结晶等方法对核桃青皮进行分离、纯化，并利用现代波谱方法确定了化合物的结构，结果从核桃青皮中分离得到13种化合物，分别鉴定为：3,5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸-7-O-β-D-葡萄糖苷(1)、myricananin F(2)、β-谷甾醇(3)、齐墩果酸(4)、核桃酮(5)、积雪草酸(6)、常春藤皂苷元(7)、β-胡萝卜苷(8)、(4R)-4，8-二羟基-α-四氢萘酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)、3β,23-二羟基-12-烯-28-乌苏酸(10)、熊果酸(11)、丁香酸(12)、Juglanoside B(13)。其中，化合物1、2、6、7、9、10为首次从该植物中分离得到，且该六种化合物也均为首次从该属植物中分离得到。经体外抗肿瘤活性筛选，发现化合物4对人肝癌细胞(HepG-2)的增殖显示了较强的生长抑制活性，化合物9对人乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖具有一定的生长抑制活性。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (3)

1.核桃青皮化学成分的提取、分离、纯化方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：取核桃青皮阴干粉碎后，在常温下用甲醇对其进行浸泡，每次浸泡6天，总共浸泡4次，过滤，滤液进行减压浓缩得甲醇提取物浸膏，再加入60~70℃温水悬浮，分别用乙酸乙酯和正丁醇对其进行多次萃取，萃取液减压浓缩分别得到乙酸乙酯部分浸膏和正丁醇部分浸膏；
步骤S2：乙酸乙酯部分浸膏用200~300目的硅胶拌样，干法上柱进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为1:0、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将洗脱液通过薄层色谱检识合并后得到6个部分Fr.-Fr.VI；
Fr.I：未分离；
Fr.II：通过硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为15:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，再进行重结晶最终在体积比3:1处得到化合物12；
Fr.III：通过硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯进行第一次梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，最终在石油醚与乙酸乙酯体积比5:1处由丙酮重结晶得到化合物3，在石油醚与乙酸乙酯体积比1:1处用丙酮进行重结晶得到化合物2，将第一次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后进行第二次硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为10:1、5:1、3:1、1:1，将第二次梯度洗脱得到的样品再次经过薄层色谱检识后，一部分样品通过两次凝胶柱色谱以甲醇为洗脱剂进行洗脱得到化合物4，另一部分样品进行第三次硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，其中石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为5:1、3:1、1:1，最终在体积比1:1处由丙酮重结晶得到化合物5；
FrIV：先用大孔吸附树脂处理，以体积比80:20的甲醇-水作为洗脱剂进行洗脱得到的浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行第一次梯度洗脱，其中氯仿与异丙醇的梯度体积比依次为20:1、10:1、5:1、1:1、0:1，将第一次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后分为A部分和B部分，A部分再经两次硅胶柱层析，两次均以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与异丙醇的体积比均为10:1，最终在体积比10:1处得到化合物6，B部分先经一次硅胶柱层析，以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与异丙醇的梯度体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1、0:1，将洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后再分为B1部分和B2部分，B1部分经过两次硅胶柱层析，两次均以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与异丙醇的体积比均为15:1，最终得到化合物10，B2部分经过两次硅胶柱层析，两次均以氯仿-异丙醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与异丙醇的体积比均为10:1，再由丙酮重结晶最终得到化合物7；
Fr.V：通过硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇为洗脱剂进行第一次梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为30:1、20:1、15:1、5:1、1:1、0:1，将第一次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后进行第二次硅胶柱色谱，同样以氯仿-甲醇为洗脱剂进行第二次梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为20:1、15:1、10:1、0:1，将第二次梯度洗脱得到的样品经过薄层色谱检识并用丙酮重结晶得到化合物8；
Fr.VI：通过硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、0:1，将洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后再经两次凝胶柱层析，两次洗脱均以甲醇为洗脱剂，最终得到化合物11；
步骤S3：正丁醇部分浸膏用200~300目的硅胶拌样，干法上柱进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将对应洗脱液通过薄层色谱检识合并后共得到4个部分Fr.A-Fr.D；
Fr.A：通过硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行第一次梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将第一次洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后进行第二次硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为10:1、8:1、5:1、3:1、1:1、0:1，将第二次洗脱得到的样品再次经过薄层色谱检识后进行第三次硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与甲醇的梯度体积比为5:1，最终得到化合物1；
Fr.B：先用氯仿-甲醇进行硅胶柱层析，其中氯仿与甲醇的梯度体积比依次为10:1、8:1、5:1、0:1，将洗脱得到的样品经薄层色谱检识后用MCI-GEL CHP20/P120反相柱色谱，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，其中甲醇的梯度体积百分含量依次为10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，同样将此次洗脱得到的样品经薄层色谱检识后用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH20，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，其中甲醇的梯度体积百分含量依次为10%、15%、20%，将最终得到的样品经薄层色谱检识后得到化合物13；
Fr.C：通过硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，其中氯仿与甲醇的体积比依次为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、0:1，将洗脱得到的样品经过薄层色谱检识后再进行两次硅胶柱色谱，均以氯仿-甲醇为洗脱剂进行等度洗脱，其中氯仿与甲醇的体积比为10:1，依次将两次洗脱得到的样品经过薄层色谱检识，再经两次凝胶柱层析，最终得到化合物9；
Fr.D：未分离。
2.根据权利要求1所述的提取、分离、纯化方法得到的化合物4在制备抑制人肝癌细胞增殖药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的提取、分离、纯化方法得到的化合物9在制备抑制人乳腺癌细胞增殖药物中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110563686A (zh) * 2019-09-17 2019-12-13 西北大学 一种软枣猕猴桃根提取物、提取分离方法及其应用
CN110563779A (zh) * 2019-09-17 2019-12-13 西北大学 一种枣核提取物及其提取分离方法和应用
CN111087441A (zh) * 2020-01-08 2020-05-01 黑龙江中医药大学 核桃青皮中一种新的三萜化合物的制备方法和应用
CN111349134A (zh) * 2020-04-23 2020-06-30 黑龙江中医药大学 核桃青皮中一种达玛烷型三萜化合物及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102106860A (zh) * 2010-09-27 2011-06-29 林秀坤 齐墩果酸的抗肝癌作用及其药物制剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102106860A (zh) * 2010-09-27 2011-06-29 林秀坤 齐墩果酸的抗肝癌作用及其药物制剂

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WANG, YI-FEN等: "Cytotoxic and new tetralone derivatives from Berchemia floribunda (Wall.) Brongn", 《CHEMISTRY & BIODIVERSITY》 *
殷田田等: "核桃青皮化学成分及其抗肿瘤活性研究", 《河南省化学会2018年学术年会》 *
苗俊秋等: "齐墩果酸诱导人肝癌HepG2 细胞凋亡及其作用机制研究", 《现代药物与临床》 *
赵李剑等: "川东獐芽菜主要成分齐墩果酸的提取及其对肿瘤细胞的影响", 《湖南中医杂志》 *
黄成钢等: "青龙衣的化学成分和抗肿瘤活性研究", 《哈尔滨商业大学学报( 自然科学版)》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110563686A (zh) * 2019-09-17 2019-12-13 西北大学 一种软枣猕猴桃根提取物、提取分离方法及其应用
CN110563779A (zh) * 2019-09-17 2019-12-13 西北大学 一种枣核提取物及其提取分离方法和应用
CN111087441A (zh) * 2020-01-08 2020-05-01 黑龙江中医药大学 核桃青皮中一种新的三萜化合物的制备方法和应用
CN111087441B (zh) * 2020-01-08 2021-06-22 黑龙江中医药大学 核桃青皮中一种三萜化合物的制备方法和应用
CN111349134A (zh) * 2020-04-23 2020-06-30 黑龙江中医药大学 核桃青皮中一种达玛烷型三萜化合物及其制备方法和应用
CN111349134B (zh) * 2020-04-23 2021-08-20 黑龙江中医药大学 核桃青皮中一种达玛烷型三萜化合物的制备方法

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