CN111617067B - 一种紫檀烷类化合物的应用及其制备方法 - Google Patents

一种紫檀烷类化合物的应用及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种紫檀烷类化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用，该紫檀烷类化合物的结构式如下：
Figure DDA0002560653550000011
其中R1、R2分别为‑OH或‑OMe，R1、R2为不同基团；其中R3、R4分别为‑H或‑OMe，R3、R4为不同基团，或者R3和R4共为‑OCH2O‑。本发明还公开了优选化合物的制备方法。本发明首次发现了紫檀烷类化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的活性，可用于制备抗类风湿关节炎的药物。

Description

一种紫檀烷类化合物的应用及其制备方法
技术领域
本发明涉及植物化学技术领域，具体涉及一种紫檀烷类化合物的应用及其制备方法。
背景技术
天堂瓜馥木(Fissistigma tientangense Tsiang et P.T.Li)，是番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木属植物。该植物可做药用，茎、叶可以治骨折水肿，全株可以治疗风湿骨痛、手足麻木等。天堂瓜馥木中含有大量化合物，急需提取出具有显著药效的化合物，充分发挥天堂瓜馥木药用价值。从天堂瓜馥木分离得到的紫檀烷类化合物未见报道，也未见该类化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的应用中的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种紫檀烷类化合物新用途。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种紫檀烷类化合物在制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖药物中的应用，该紫檀烷类化合物的结构通式如下：
Figure BDA0002560653530000011
其中R1、R2分别为-OH或-OMe，R1、R2为不同基团；
其中R3、R4分别为-H或-OMe，R3、R4为不同基团，或者R3和R4共为-OCH2O-。
上述紫檀烷类化合物在制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖药物中的应用也在本发明的保护范围之类。其中，所述的滑膜细胞为原代大鼠滑膜细胞。
上述紫檀烷类化合物，优选结构式如下：
Figure BDA0002560653530000021
上述优选紫檀烷类化合物的制备方法，它包括如下步骤：
(1)制备天堂瓜馥木提取物
将天堂瓜馥木干燥的茎用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为天堂瓜馥木提取物；
(2)分离纯化
将上述天堂瓜馥木提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析、高效液相分离得到这两个化合物，即4-羟基-3-二甲氧基-8,9-亚基二氧基紫檀烷和3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷。
进一步的，步骤(1)、步骤(2)中，所述减压浓缩，温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa，优选温度为40～55℃，优选压力为-0.09～-0.1MPa，更优选温度为45℃，优选压力为-0.095MPa。
进一步的，步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积浓度为70～80％。
进一步的，步骤(2)中，所述柱层析的条件为：用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为30％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂。
进一步的，步骤(2)中，所述薄层层析条件为：以甲醇体积百分数为10％的甲醇-氯仿混合溶剂为展开剂。
进一步的，步骤(2)中，所述分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。
进一步的，步骤(2)中，所述高效液相的洗脱剂为体积配比为40:60的乙腈和水。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次发现了紫檀烷类化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的活性，可用于制备抗类风湿关节炎的药物。并从天堂瓜馥木中提取分离出该紫檀烷类化合物。
附图说明
图1为本发明实施例1紫檀烷类化合物4-羟基-3-二甲氧基-8,9-亚基二氧基紫檀烷(1)的氢谱图；
图2为本发明实施例1紫檀烷类化合物4-羟基-3-二甲氧基-8,9-亚基二氧基紫檀烷(1)的碳谱图；
图3为本发明实施例1紫檀烷类化合物3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷(2)的氢谱图；
图4为本发明实施例1紫檀烷类化合物3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷(2)的碳谱图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一种紫檀烷类化合物，其结构通式如下：
Figure BDA0002560653530000041
其中R1、R2分别为-OH或-OMe，R1、R2为不同基团；
其中R3、R4分别为-H或-OMe，R3、R4为不同基团，或者R3和R4共为-OCH2O-。上述结构化合物可通过有机合成获得。本发明通过从天堂瓜馥木中提取分离获得以下结构的紫檀烷类化合物，它们的结构式如下：
Figure BDA0002560653530000042
实施例1：紫檀烷类化合物的制备。
(1)天堂瓜馥木干燥的茎10Kg按常规用75％v/v的乙醇溶液浸提3次每次7天，得到提取液，将提取液减压浓缩成膏状，浓缩温度约为45℃、压力为-0.095MPa，得到天堂瓜馥木提取物1000g。
(2)将天堂瓜馥木提取物用蒸馏水(3L)稀释成悬浮液，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯萃取(3L×3次)，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏(约256g)，浓缩温度约为45℃、压力为-0.095MPa，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(100:0―0:100,V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0―0:100,V/V)按极性递增进行硅胶柱层析，并按每次约400mL收集馏分。通过TLC检测合并相似流分分成9个组分，即Fr.1―9。
(3)Fr.4用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为30％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，以以甲醇体积百分数为10％的甲醇-氯仿混合溶剂为展开剂进行薄层层析，根据层析效果合并流分得到3个组分Fr.4-1,Fr.4-2以及Fr.4-3。
(4)Fr.4-2以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行分子筛Sephadex LH-20柱层析除去色素后得到组分Fr.4-2-1，Fr.4-2-1用高效液相进行分析制备，洗脱剂为乙腈和水其体积配比为40:60得到紫檀烷类化合物4-羟基-3-二甲氧基-8,9-亚基二氧基紫檀烷(1)以及3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷(2)。
4-羟基-3-二甲氧基-8,9-亚基二氧基紫檀烷(1)的结构鉴定结果如下：
4-羟基-3-二甲氧基-8,9-亚基二氧基紫檀烷：为白色粉末。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.04,7.02,6.73,6.67,6.65,6.43,5.92,5.91,5.89,5.88,5.52,5.50,4.94,4.93,4.80,4.80,4.35,4.33,4.32,4.31,3.89,3.71,3.69,3.66,3.60,3.59,3.57,3.56；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ154.19,148.13,147.46,143.34,141.75,134.06,120.99,117.72,113.98,105.47,104.78,101.29,93.81,78.91,78.42,66.85,49.53。确证该化合物为4-羟基-3-二甲氧基-8,9-亚基二氧基紫檀烷。
3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷(2)的结构鉴定结果如下：
3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷：为白色粉末。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.15,7.13,7.06,7.04,6.68,6.66,6.46,6.44,5.55,5.53,4.36,4.35,4.34,4.32,3.90,3.76,3.70,3.67,3.64,3.60,3.59,3.58,3.57,3.56；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.17,160.65,147.43,143.37,134.04,124.82,121.11,118.92,114.00,106.45,105.47,96.95,78.49,66.96,56.35,55.51,39.64。确证该化合物为3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀烷。
实施例2
本实施例与实施例1区别在于，步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积浓度为30％；步骤(1)、步骤(2)中，所述浓缩的温度约为35℃，压力为-0.15MPa。获得产物结构与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1区别在于，步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积浓度为95％；步骤(1)、步骤(2)中，所述浓缩的温度约为65℃，压力为-0.06MPa。获得产物结构与实施例1相同。
实施例4-药理活性实验
实验材料
细胞：滑膜细胞(原代大鼠滑膜细胞)。
细胞培养液：原代大鼠滑膜细胞培养基。
试剂：噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide，MTT，Sigma生产)。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(购自碧云天公司)。甲氨蝶呤(methot rexate，MTX，上海信宜药厂有限公司)。1.4仪器：96孔细胞培养板；infinite 200Pro多功能酶标仪。
实验方法
MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用
取对数期的滑膜细胞接种至96孔培养板(1×104个细胞/孔)，设置为空白组(不给予药物)、甲氨蝶呤组(给予1μg/mL的甲氨蝶呤)、给药组(给予10、50、100μg/mL浓度的药物)，培养孵育过夜后用于实验。细胞给予不同浓度的药物培养48h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL MTT，继续培养4h后，小心吸弃培养上清液，每孔加入100μL的DMSO溶解甲瓒结晶，室温震摇5min，完全溶解后，用酶标仪在570nm处检测光密度(OD值)。根据OD值计算细胞存活率。
Figure BDA0002560653530000071
LDH活性检测法测药物对滑膜细胞细胞活力的影响
取对数期的滑膜细胞接种至96孔培养板(1×104个细胞/孔)，设置为空白组(不给予药物)、甲氨蝶呤组(给予1μg/mL的甲氨蝶呤)、给药组(给予10、50、100μg/mL浓度的药物)，培养孵育过夜，各组细胞培养结束后，取细胞上清液，LDH检测试剂盒检测LDH活性。LDH的活力按照下述公式计算。
Figure BDA0002560653530000072
统计方法
采用SPSS 22.0统计软件分析实验数据。结果用均数±标准差
Figure BDA0002560653530000074
表示，用单因素方差(one-way ANOVA)分析组间差异。以P<0.05认为具有统计学差异。所测试样品的IC50值是通过SPSS 22.0统计软件分析实验数据得到的。
实验结果
(1)MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用
使用不同浓度药物培养48h后，MTT法检测细胞增殖作用。检测样品的IC50值如下：
Figure BDA0002560653530000073
Figure BDA0002560653530000081
化合物1和2的IC50值分别为12.18μM和15.15μM，阳性对照(甲氨蝶呤)的IC50值为1.2μM。结果表明化合物1和2均对滑膜细胞具有很好的抑制作用。
(2)LDH活性检测法测药物对滑膜细胞细胞活力的影响
使用不同浓度药物培养48h后，LDH活性检测法检测细胞活力。结果显示不同浓度的药物处理后，细胞培养液中LDH活性均无明显变化。
以上结果表明紫檀烷类化合物1和2对滑膜细胞具有很好的抑制效果，并对细胞培养液中LDH活性影响可以忽略。实验表明紫檀烷类化合物具有良好的抗类风湿关节炎药效，可以用于抗类风湿关节炎药物的制备。

Claims (6)

1.一种用于制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖药物的紫檀烷类化合物的制备方法，其特征在于，所述紫檀烷类化合物的结构式如下：
Figure FDA0003352443980000011
所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备天堂瓜馥木提取物
将天堂瓜馥木干燥的茎用30～95％v/v的乙醇溶液冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为天堂瓜馥木提取物；
(2)分离纯化
将上述天堂瓜馥木提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析、高效液相分离得到目标化合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)中，所述减压浓缩，温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述柱层析的条件为：用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为30％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂；
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述薄层层析条件为：以甲醇体积百分数为10％的甲醇-氯仿混合溶剂为展开剂。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述高效液相的洗脱剂为体积配比为40:60的乙腈和水。
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