CN110981935A - 一种环四肽化合物及其制备方法 - Google Patents

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叶艳青
陈彦君
董淼
陈毅坚
周敏
于红梅
孙琰奇
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Abstract

本发明公开了一种环四肽化合物(I)及其制备方法和应用。该环四肽化合物从杂色曲霉真菌(Aspergillus versicolor)代谢产物中分离得到，杂色曲霉真菌固体发酵产物以高浓度乙醇/水提取多次，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏；浸膏用硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以二氯甲烷‑甲醇溶液进行梯度洗脱；洗脱液的20:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的环四肽化合物。环四肽是一类重要的生物活性分子,其独特的刚性环状结构在药物研发中有着潜在应用，本发明通过植物内生真菌结构新颖的次生代谢产物，来实现寻找新药和新药的先导化合物这一目标。

Description

一种环四肽化合物及其制备方法
技术领域
本发明属于天然产物研究技术领域，具体涉及一种首次从杂色曲霉真菌固体发酵产物中提取分离得到的环四肽化合物；同时本发明还涉及该化合物的制备方法。
背景技术
植物内生菌是一种新型的微生物资源，是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生存于健康植物的各种组织和器官内部的微生物。这些特殊微生物与宿主植物形成了互惠互利且平衡对抗的复杂生态关系。由于其独特的生存环境造就了它们独特的代谢机制，从而决定了其次生代谢产物具有化学结构多样性和生物活性多样性。真菌次生代谢产物结构多样，种类繁多，生物活性多种多样，既含有各种毒素，也包括多种药理活性成分，次生代谢产物多为小分子化合物，但其化学结构类型多种多样，不同结构的次生代谢产物广泛具有抗炎症、抗菌、抗病毒、抗癌、扩张心血管、强心、平喘等多种生理活性，因而从微生物次生代谢中发现具有药用价值的先导性化合物得到了广泛的关注，并且药物生产已成为发酵工业的重要支柱。
环四肽是一类重要的生物活性分子,有独特的刚性环状结构,环四肽类化合物有显著的生物活性，在药物研发中有着潜在应用。例如,从瑞士乳酸杆菌中分离得到的环四肽具有抑制酪氨酸酶的活性及从根赤壳菌素中分离出的环四肽衣原体能够抑制组蛋白去乙酰化酶的活性。本发明从杂色曲霉真菌固体发酵产物中分离得到一种环四肽化合物；该化合物至今尚未见到相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的环四肽化合物。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述环四肽类化合物的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明所述的环四肽化合物是从曲霉属杂色曲霉真菌(Aspergillus versicolor)固体发酵产物中分离得到，其分子式为C36H36N4O6，具有下述结构式：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
该化合物命名为杂色曲霉四环肽A，英文名称为：aspergilpeptide A；为黄色油状化合物。
一种制备所述 生物碱类化合物的方法，以杂色曲霉菌固体发酵产物为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱、凝胶柱层析制备而成，具体包括以下步骤：
(1) 菌种筛选：该菌株从大戟科大戟属霸王鞭(Euphorbia royleana Boiss.)根部分离得到，菌株由云南民族大学陈毅坚教授鉴定曲霉属杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)，ITS 序列号为(Genbank Accession number KJ801852)。
(2) 固体发酵和浸膏提取：菌株在PDA培养基中培养7天，培养温度为28 ℃；用接种棒接种到含150 mL 马铃薯葡萄糖的250 mL锥形瓶中，在全温震荡培养箱中以28 ℃，160r/min的条件下培养10天，得到供大量发酵用的菌种。大规模固体发酵在500 mL发酵罐中进行，每个锥形瓶中含50 g 大米和50 g 珍珠岩加120 mL的水，高温消毒灭菌后将发酵液以1:10的比例接入固体培养基；每批发酵50罐，在25 ℃下发酵60天。发酵产物捣碎后用70%的乙醇提取，然后再用乙酸乙酯萃取, 乙酸乙酯萃取部分用浓缩得到浸膏40 g。
(3) 硅胶柱层析：浸膏用重量比7～10倍量的80～120目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，合并相同部分，收集各部分的洗脱液并浓缩。
(4) 高压液相色谱分离纯化：洗脱液的20:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的环四肽化合物。
高效液相色谱制备柱分离是采用21.2 mm × 250 mm，5 μm的C18色谱柱，流速为5mL/min，流动相为80%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样200 μL，收集10.7 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
高效液相色谱半制备柱纯化是采用250 mm × 10 mm，5 μm的C18色谱柱，流速为3mL/min，流动相为72%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样18 μL，收集11.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干,以进一步分离纯化。
本发明的环四肽化合物的结构通过以下方法测定。该化合物为黄色油状物；比旋光度值 [α]25 D -62.0 (c 0.26, 甲醇); 紫外光谱 (甲醇) λ max (log ε): λ max (log ε):211 (2.57), 314 (3.52) nm nm; 电喷雾质谱(正离子模式) m/z 643 [M + Na]+; 高分辨电喷雾质谱(正离子模式) m/z 643.2524 [M + Na]+ (计算值643.2527),结合13C 和1HNMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式为C36H36N4O6。1H NMR（CD3OD，400MHz）和13C NMR（CD3OD，100 MHz）数据，见表1。
Aspergilpeptide A 的1H NMR谱(图2) 显示2个氮甲基、2个三取代苯环信号、2个1取代苯环信号和两个甲氧基信号。结合13C NMR谱(图1) 由酰胺N-Me（δ H 2.91，s；3.06，s和δ C 39.8；29.6）和氨基酸质子（δ H 4.29，dd, 7.0, 10.4）和（δ H 4.42, t, 7.6）的存在推断出化合物具有环肽性质。根据碳个数判断化合物为四环肽，包括两个苯丙氨酸（Phe）和两个2-氨基苯甲酸残基，与已知化合物penicopeptide A非常相似，比已知化合物多出两个甲氧基信号。通过HMBC谱和1H-1H COSY中给出两个甲氧基OMe-18和OMe-36分别连接于两个氨基苯甲酸的C-15和C-33上，从而确定该化合物为环四肽化合物aspergilpeptide A。
表-1.化合物的1H NMR 和13C NMR 数据 (CD3OD)
Figure DEST_PATH_IMAGE003
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明化合物系首次从杂色曲霉菌固体发酵产物中分离得到的，并通过核磁共振、紫外,旋光等数据确定化合物的结构。
附图说明
图1为本发明化合物的核磁共振碳谱；
图2为本发化合物的核磁共振氢谱；
图3为本发明化合物的HSQC谱；
图4为本发明化合物的HMBC相关谱；
图5为本发明化合物的1H-1H COSY相关谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
实施例1
------固体发酵和浸膏提取：
菌株在PDA培养基中培养7天，培养温度为28 ℃；用接种棒接种到含150 mL 马铃薯葡萄糖的250 mL锥形瓶中，在全温震荡培养箱中以28 ℃，160 r/min的条件下培养10天，得到供大量发酵用的菌种。大规模固体发酵在500 mL发酵罐中进行，每个锥形瓶中含50 g 大米和50 g 珍珠岩加120 mL的水，高温消毒灭菌后将发酵液以1:10的比例接入固体培养基；每批发酵50罐，在25 ℃下发酵60天。发酵产物捣碎后用70%的乙醇提取，然后再用乙酸乙酯萃取, 乙酸乙酯萃取部分用浓缩得到浸膏40 g。
实施例2
------化合物分离
浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用80 g的120目粗硅胶拌样，650 g 的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，HPLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为20:1的二氯甲烷-甲醇洗脱部分用安捷伦1100制备高效液相色谱分离，以80％的甲醇为流动相，21.2 mm ×250 mm，5 μm的C18色谱柱，流速为5 mL/min，流动相为80%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样200 μL，收集10.7 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，用安捷伦1260半制备高效液相色谱分离，采用250 mm × 10 mm，5 μm的C18色谱柱，流速为3 mL/min，流动相为72%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样18 μL，收集11.2 min的色谱峰进一步纯化,即得该新化合物。
实施例3
-------化合物的鉴定
本发明的环四肽化合物的结构通过以下方法测定。该化合物为黄色油状物；比旋光度值 [α]25 D -62.0 (c 0.26, 甲醇); 紫外光谱 (甲醇) λ max (log ε): λ max (log ε): 211(2.57), 314 (3.52) nm nm; 电喷雾质谱(正离子模式) m/z 643 [M + Na]+; 高分辨电喷雾质谱(正离子模式) m/z 643.2524 [M + Na]+ (计算值643.2527),结合13C 和1H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式为C36H36N4O6。1H NMR（CD3OD，400 MHz）和13C NMR（CD3OD，100 MHz）数据，见表1。
Aspergilpeptide A 的1H NMR谱(图2) 显示2个氮甲基、2个三取代苯环信号、2个1取代苯环信号和两个甲氧基信号。结合13C NMR谱(图1) 由酰胺N-Me（δ H 2.91，s；3.06，s和δ C 39.8；29.6）和氨基酸质子（δ H 4.29，dd, 7.0, 10.4）和（δ H 4.42, t, 7.6）的存在推断出化合物具有环肽性质。根据碳个数判断化合物为四环肽，包括两个苯丙氨酸（Phe）和两个2-氨基苯甲酸残基，与已知化合物penicopeptide A非常相似，比已知化合物多出两个甲氧基信号。通过HMBC谱和1H-1H COSY中给出两个甲氧基OMe-18和OMe-36分别连接于两个氨基苯甲酸的C-15和C-33上，从而确定该化合物为环四肽化合物aspergilpeptide A。所测试的波谱数据可为今后类似化合物的结构鉴定提供依据。

Claims (7)

1.一种具有下述结构式的环四肽化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
该化合物命名为：aspergilpeptide A（杂色曲霉环四肽 A）。
2.一种制备权利要求1所述环四肽化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(1) 菌种筛选：该菌株从大戟科大戟属霸王鞭(Euphorbia royleana Boiss.)根部分离得到，菌株由云南民族大学陈毅坚教授鉴定曲霉属杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)，ITS 序列号为(Genbank Accession number KJ801852)。
(2) 固体发酵和浸膏提取：菌株在PDA培养基中培养7天，培养温度为28 ℃；用接种棒接种到含150 mL 马铃薯葡萄糖的250 mL锥形瓶中，在全温震荡培养箱中以28 ℃，160 r/min的条件下培养10天，得到供大量发酵用的菌种。大规模固体发酵在500 mL发酵罐中进行，每个锥形瓶中含50 g 大米和50 g 珍珠岩加120 mL的水，高温消毒灭菌后将发酵液以1:10的比例接入固体培养基；每批发酵50罐，在25 ℃下发酵60天。发酵产物捣碎后用70%的乙醇提取，然后再用乙酸乙酯萃取, 乙酸乙酯萃取部分用浓缩得到浸膏40 g。
(3) 硅胶柱层析：浸膏用重量比7～10倍量的80～120目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，合并相同部分，收集各部分的洗脱液并浓缩；
(4) 高压液相色谱分离纯化：洗脱液的20:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的环四肽化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述高效液相色谱制备柱分离后，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以72%甲醇水溶液为流动相，用高效液相色谱半制备柱分离，以进一步分离纯化。
4.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于：步骤(4)的高效液相色谱制备柱分离纯化是采用21.2 mm × 250 mm，5 μm的C18色谱柱，流速为5 mL/min，流动相为80%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样200 μL，收集10.7 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
5.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于：步骤(4)的高效液相色谱半制备柱分离纯化是采用250 mm × 10 mm，5 μm的C18色谱柱，流速为3 mL/min，流动相为72%的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样18 μL，收集11.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
6.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用重量比1.5～3倍量的纯甲醇溶解后，用重量比1.5～2.0倍的80～120目硅胶拌样。
7.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的梯度洗脱，二氯甲烷-甲醇溶液体积配比为1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1。
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