CN115466772A

CN115466772A - 一种麦角烷型甾体化合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN115466772A
Application number: CN202210733338.2A
Authority: CN
Inventors: 李娟�; 温会敏; 陈威仲; 丁立建; 石煜彤; 何山
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2022-12-13

Abstract

本发明公开了一种麦角烷型甾体化合物及其制备方法和用途，特点是该甾体化合物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括将保藏号为CCTCC NO:M2014086的焦曲霉通过微生物发酵培养来获取麦角烷型甾体化合物的发酵物，然后将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取得粗浸膏，将该粗浸膏经减压硅胶柱层析，中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，优点是该麦角烷型甾体化合物具有抗金黄色葡萄球菌的作用，可以用于开发预防和治疗由金黄色葡萄球菌所引起的病害和感染的药物。

Description

一种麦角烷型甾体化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种麦角烷型甾体化合物，尤其是涉及一种从海洋源真菌中提取的麦角烷型甾体化合物及其制备方法和用途。

背景技术

甾醇是生物中最重要的小分子，是真核生物质膜的组成部分，在细胞膜结构和信号传导功能中起着多种作用。其衍生物包括几十种具有生理活性的内源性物质，如脊椎动物中的甾体激素、昆虫中的蜕皮甾体和植物中的油菜素甾体，它们参与细胞增殖、组织分化和信号转导的调控。甾体类药物是第二大类药物，是目前市场上最畅销的医药产品之一，对提高生活质量、预防和治疗疾病具有重要意义。因此，甾醇及其衍生物引起了化学家和生物学家的持续关注。

真菌代谢的多样性，通常会产生具有药理活性的天然产物，而海洋作为地球上最大的生态系统，生物资源丰富，从1945在海洋源真菌中发现具有抗菌活性的头孢菌素C开始，越来越多的活性新天然产物被发现，说明海洋真菌具有无限的研究和开发的潜力。

在海洋天然产物发掘过程中，去重复化可以极大加快新天然产物的发现速度。分子网络作为一种基于化学相似性来分析MS / MS数据的技术，自其被开发以来在天然产物的研究中被应用的越来越广泛，它可以提供指导并提高新活性天然产物的发现效率。发明人在基于对一株海洋曲霉菌（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2014086）在大米发酵下的乙酸乙酯提取物的化学成分研究中，发现了一个新型的麦角烷型甾体天然产物，随后对其进行了抑菌活性评估。目前尚未见该化合物的化学结构及抑菌活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对金黄色葡萄球菌具有抑制作用的麦角烷型甾体化合物及其制备方法和用途。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种麦角烷型甾体化合物，该化合物的结构式如（I）所示；

（I）。

2、上述麦角烷型甾体化合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）发酵生产

将保藏号为CCTCC NO：M2014086的曲霉（Aspergillus ustus）在PDA固体培养基的平板上进行划线，于28 ℃培养箱中培养7天，随后挑取单菌落接种在PDB液体培养基中，于28 ℃、180 rpm/min的转速培养，培养三天后将种子液按体积比10%的接种量接种到大米培养基中，于温度28 ℃静止培养30天，最终获得发酵物；

（2）浸膏提取

在步骤（1）得到的发酵物中加入与发酵物等体积的乙酸乙酯，反复浸泡3次，再加入与发酵物等体积的由二氯甲烷和甲醇等体积混合成的混合液中反复浸泡两次，随后将乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇减压蒸馏，浓缩得到粗浸膏；

（3）化合物的分离制备

将步骤（2）得到的粗浸膏用由等体积的二氯甲烷和乙酸乙酯组成的混合液溶解后，加入1.5倍200-300目硅胶粉拌样进行VLC减压柱层析，采用体积比为（100:0）-（0:100）的石油醚/乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，按序合并相似流分，共收集得到4个组分(Fr.A–Fr.D)；将收集的第3个组分进行反向中压柱层析，采用甲醇体积比为50−100%的甲醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，按序合并相似流分，共收集得到6个组分(Fr.C.1−Fr.C.6)；将收集的第4个组分蒸干后进行半制备反相高效液相色谱分离，采用体积比60:40的乙腈/水溶液为洗脱剂，分离纯化得到麦角烷型甾体化合物，其结构如（I）所示：

（I）。

步骤（1）中所述的大米培养基的配制方法如下：将80 g大米加入到120 mL盐度为20%的海水中后，在121℃温度下保持15min进行高温灭菌。

步骤（3）中所述的石油醚/乙酸乙酯溶液梯度洗脱体积比依次为100:0，95:5,90:10，85:15，80:20，70:20，50:50，0:100。

步骤（3）中所述的反相中压柱层析中梯度洗脱剂为甲醇和水，甲醇从50~100%，洗脱时间150 min。

步骤（3）通过质谱追踪找到质荷比为473.3280 [M + H]⁺的节点。

步骤（3）所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为2.0 mL/min。

3、上述麦角烷型甾体化合物在制备金黄色葡萄球菌菌抑制药物方面的用途。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种麦角烷型甾体化合物及其制备方法和用途，通过微生物发酵培养来获取甾醇类的发酵物，然后通过将发酵物用乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇浸泡提取，得粗浸膏，然后将粗浸膏经正相硅胶柱层析，反向中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该化合物对金黄色葡萄球菌具有良好的活性，可用于抑制由金黄色葡萄球菌引起的相关疾病的药物开发等方面的用途。

上述焦曲霉（Aspergillus ustus），该菌为DJ003菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2014086，于2014年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

一种麦角烷型甾体化合物的结构式如（I）所示：

（I）。

实施例2

如实施例1结构式（I）所示的麦角烷型甾体化合物的分离制备方法，具体包括如下步骤：

（1）发酵生产

将保藏号为CCTCC NO：M2014086的曲霉（Aspergillus ustus）在PDA固体培养基的平板上进行划线，于28 ℃培养箱中培养7天，随后挑取单菌落接种在PDB液体培养基中，于28 ℃、180 rpm/min的转速培养，培养三天后将种子液按体积比10%的接种量接种到大米培养基中，于温度28 ℃静止培养30天，最终获得发酵物；其中大米培养基的配制方法如下：将80 g大米加入到120 mL盐度为20%的海水中后，在121℃温度下保持15min进行高温灭菌；

（2）浸膏提取

在步骤（1）得到的发酵物中加入与发酵物等体积的乙酸乙酯，反复浸泡3次，再加入与发酵物等体积的由二氯甲烷和甲醇等体积混合成的混合液中反复浸泡两次，随后将乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇减压蒸馏，浓缩得到粗浸膏；

（3）化合物的分离制备

取上述粗浸膏用甲醇溶解并配置成0.1 mg/mL样品进行LC-MS分析，进样量为2μL，并使用H₂O和CH₃CN（均含有0.1%的甲酸）通过以下梯度方法洗脱：10% CH₃CN/H₂O至100%CH₃CN10分钟，100% CH₃CN 5分钟，然后在5 s内将100% CH₃CN降为10％ CH₃CN/H₂O，最后以10% CH₃CN/H₂O平衡3分钟，流速为0.4 mL/min。在正离子ESI模式下记录100−1800 m/z 范围内的谱图，然后在40 ev的能量下扫描。m/z为473.3的节点，并通过下列分离纯化步骤对目标分子进行分离纯化；

首先，将步骤（2）得到的粗浸膏用由等体积的二氯甲烷和乙酸乙酯组成的混合液溶解后，加入1.5倍200-300目硅胶粉拌样进行VLC减压柱层析，采用体积比为（100:0）-（0:100）的石油醚/乙酸乙酯溶液（体积比依次为100:0，95:5,90:10，85:15，80:20，70:20，50:50，0:100）为洗脱剂进行梯度洗脱，按序合并相似流分，共收集得到4个组分(Fr.A–Fr.D)；将收集的第3个组分进行反向中压柱层析，采用甲醇体积比为50−100%的甲醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，按序合并相似流分，共收集得到6个组分(Fr.C.1−Fr.C.6)；将收集的第4个组分蒸干后进行半制备反相高效液相色谱分离，采用体积比60:40的乙腈/水溶液为洗脱剂，流速为2mL/min, 保留时间为23 min下分离纯化得到麦角烷型甾体化合物，其结构如（I）所示：

（I）。

本发明化合物Ⅰ为白色粉末，正离子模式下的高分辨质谱(HR-ESI-MS)给出其准分子离子峰m/z 473.3280 [M + H]⁺。结合¹³C NMR谱确定其分子式为C₃₀H₄₈O₄，该化合物的¹H和¹³C NMR谱数据见表1：

表1. 化合物Ⅰ的1D 和2D NMR 数据 (CD₃Cl₃)

注1 ：本表信号归属基于DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC以及NOESY图谱解析结果；2：s—单重峰、d—二重峰、t—三重峰、 m—多重峰；3：¹H 在600 MHz NMR获得；¹³C 在150 MHzNMR获得。

实施例3

实施例1所述麦角烷型甾体化合物活性及应用

（1）实验样品

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物Ⅰ纯品，精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液供测试抗菌活性。该实验使用的指示菌为金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)。

（2）实验方法

96孔板抗菌测试方法：在96孔板中，终体积为100μL/孔的MH肉汤作为基本培养基，其中化合物的浓度为以二倍肉汤稀释法稀释至浓度256至1µg/mL，并以5×10⁶ CFU / mL的浊度添加细菌培养物。将板在37℃下孵育18h，然后观察板，将0.004%MTT加入孔板中，37℃孵育四小时肉眼观察每孔中的颜色变化，将没有颜色变化的最后一个孔对应的化合物浓度确定为该化合物的最低抑制浓度MIC。同时以硫酸庆大霉素作阳性对照。

（3）实验结果

在96孔板抗菌测试中，化合物Ⅰ对金黄色葡萄球菌的MIC被确定为64 ug/ml。由此可知，化合物Ⅰ对金黄色葡萄球菌具较好的抗菌活性。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种麦角烷型甾体化合物，其特征在于该麦角烷型甾体化合物的结构式如（I）所示；

（I）。

2.一种权利要求1所述的麦角烷型甾体化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）发酵生产

将保藏号为CCTCC NO：M2014086的曲霉（Aspergillus ustus）在PDA固体培养基的平板上进行划线，于28 ℃培养箱中培养7天，随后挑取单菌落接种在PDB液体培养基中，于28℃、180 rpm/min的转速培养，培养三天后将种子液按体积比10%的接种量接种到大米培养基中，于温度28 ℃静止培养30天，最终获得发酵物；

（2）浸膏提取

（3）化合物的分离制备

将步骤（2）得到的粗浸膏用由等体积的二氯甲烷和乙酸乙酯组成的混合液溶解后，加入1.5倍200-300目硅胶粉拌样进行VLC减压柱层析，采用体积比为（100:0）-（0:100）的石油醚/乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，按序合并相似流分，共收集得到4个组分；将收集的第3个组分进行反向中压柱层析，采用甲醇体积比为50−100%的甲醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，按序合并相似流分，共收集得到6个组分；将收集的第4个组分蒸干后进行半制备反相高效液相色谱分离，采用体积比60:40的乙腈/水溶液为洗脱剂，分离纯化得到麦角烷型甾体化合物，其结构如（I）所示：

（I）。

3.根据权利要求2所述的一种麦角烷型甾体化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的大米培养基的配制方法如下：将80 g大米加入到120 mL盐度为20%的海水中后，在121℃温度下保持15min进行高温灭菌。

4.根据权利要求2所述的一种麦角烷型甾体类化合物的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的石油醚/乙酸乙酯溶液梯度洗脱体积比依次为100:0，95:5,90:10，85:15，80:20，70:20，50:50，0:100。

5.根据权利要求2所述的一种麦角烷型甾体类化合物的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的反相中压柱层析中梯度洗脱剂为甲醇和水，甲醇从50~100%，洗脱时间150 min。

6.根据权利要求2所述的一种麦角烷型甾体化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为2.0 mL/min。

7.一种权利要求1-6中任一项所述麦角烷型甾体化合物的用途，其特征在于所述的麦角烷型甾体化合物制备抑制金黄色葡萄球菌药物方面的用途。