CN114751912A - 一种异戊烯基取代双苯吡酮类化合物的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从滇南红厚壳植物的干燥茎叶中分离得到一种异戊烯基取代双苯吡酮类化合物的新用途。以藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)植物滇南红厚壳(Calophyllum Polyanthum Wallich ex Choisy)的干燥茎叶为原料，经浸膏提取、MCI脱色、大孔树脂脱色、硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、Sephadex LH‑20、制备薄层色谱等多种分离方法获得到一种异戊烯基取代双苯吡酮类化合物：

Description

一种异戊烯基取代双苯吡酮类化合物的新用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及从滇南红厚壳植物的干燥茎叶中分离得到一种异戊烯基取代双苯吡酮类化合物的新用途。
背景技术
细胞色素P450 1基因可被多环芳烃(PAH)类诱导剂高度诱导，其表达产物细胞色素P450 1A2(Cytochrome P450 1A2,CYP1A2)参与许多前致癌物/前诱变物的代谢，许多前致癌物如芳香胺类、杂环胺类、多环芳烃类和黄曲霉毒素B1(AFB1)均可经此酶代谢激活，使这些前致癌物转化为具有亲电子中心的近致癌物和终致癌物如8,9-外环氧化黄曲霉毒素B1(AFBO)、苯并芘环氧化物、乙酰氨基芴硫酸盐。抑制CYP1A2的活性能够降低这些前致癌物/前诱变物的致病性。研究表明，膀胱癌、结肠癌的发生与CYP1A2酶相关，例如香烟中的前致癌物4-氨基联二苯可在CYP1A2酶催化下生成4-羟基联二苯，后者被膀胱内皮细胞重吸收后可与DNA共价结合，形成芳香胺-DNA化合物，从而导致继发性膀胱癌的发生。因此，CYP1A2酶抑制剂的筛选将成为预防芳香胺类、杂环胺类等化合物引起的DNA突变和癌症的一个新途径，具有潜在的临床应用价值。从传统药用植物中获得活性天然产物，是获得有效CYP1A2酶抑制剂的来源之一。
滇南红厚壳(Calophyllum Polyanthum Wallich ex Choisy)又名云南横经席、云南胡桐，隶属藤黄科(Clusiaceae)红厚壳属(Calophyllum)植物。该植物主要分布于我国云南南部的景洪、澜沧、西双版纳、临沧等海拔600～2000m的热带山地雨林和热带雨林中，老挝、缅甸、印度等地也有分布。红厚壳属植物资源丰富，具有很高的药用价值，常作为民间药物，用于治疗如牙痛、风湿、腹泻、慢性胃溃疡、皮肤感染及创伤。
研究表明，红厚壳属植物含有丰富的异戊烯基取代双苯吡酮类化合物，这类化合物结构新颖多样，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等药理活性，是近年来天然活性产物研究的热点之一。除了双苯吡酮类化合物，红厚壳属植物还含有香豆素类、黄酮类、萜类等次生代谢产物，同样具有广泛的生物活性。
发明内容
因此为了更好的利用红厚壳属植物资源，寻找新的CYP1A2酶抑制剂，本发明对滇南红厚壳植物干燥茎叶，进行系统的化学成分和CYP1系酶活性研究。本发明从滇南红厚壳中分离得到一类异戊烯基取代双苯吡酮类化合物，具有如下结构：
Figure BDA0003481075040000021
其中，化合物Ⅱ具有靶向抑制CYP1A2酶的活性。
本发明一个目的在于提供本发明所述的异戊烯基取代双苯吡酮类化合物的制备方法，以藤黄科(Clusiaceae)红厚壳属(Calophyllum)植物滇南红厚壳(CalophyllumPolyanthum Wallich ex Choisy)的干燥茎叶为原料，经浸膏提取、MCI脱色、大孔树脂脱色、硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、薄层制备色谱分离获得。
优选的，包括如下步骤：
(1)取滇南红厚壳干燥茎叶，粉碎，使用醇或醇水溶液浸提，如水、甲醇、乙醇中的一种或几种，优选使用95％乙醇冷浸提取3次，每次24小时，浓缩；
(2)将步骤(1)所得的浓缩物用水溶解过滤后，用聚酰胺拌样，经MCI柱层析，先使用体积百分比70％甲醇-水洗脱除杂，再分别使用体积百分比85％和95％的甲醇-水溶液各洗脱2～5个柱体积(优选4个柱体积)，得到相应的两个洗脱组分Fr E和Fr F；
(3)将步骤(2)得到的Fr F，用水溶解过滤后，通过大孔吸附树脂脱色，分别以水和95％乙醇洗脱，浓缩后分别得到Fr F-1和F-2组分；
(4)将步骤(3)得到的Fr F-2与步骤(2)得到的Fr E合并，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比400:1、200:1、100:1、50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，TLC检测合并相同组分后得到Fr 1～26共26个组分；
(5)将步骤(4)得到的Fr 14组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 14-1～14-33各组分；
(6)将步骤(5)得到的Fr 14-18与Fr 14-19合并后经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱1～3个柱体积(优选2个柱体积)，待样品完全洗脱后采用TLC监测，得到化合物Ⅰ；
(7)将步骤(5)得到的Fr 14-12通过经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱1～3个柱体积(优选2个柱体积)，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 14-12-1～14-12-7各组分；
(8)将步骤(7)得到的Fr 14-12-7使用硅胶制备薄层色谱分离，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到化合物Ⅱ；
(9)将步骤(4)得到的Fr 16组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、6:1、5:1、3:1、1:1、1:2的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 16-1～16-26各组分；(10)将步骤(9)得到的Fr 16-17经ODS柱色谱，依次以体积比0:30、80:20、90:10、0:100的甲醇-水混合溶剂为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得到Fr 16-17-1～16-17-19各组分；
(11)步骤(10)得到的Fr 16-17-9组分通过凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱1～3个柱体积(优选2个柱体积)，待样品完全洗脱后采用TLC监测，得到化合物Ⅲ；
(12)将步骤(4)得到的Fr 15组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 15-1～15-31各组分；(13)将步骤(12)得到的Fr 15-17，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱1～3个柱体积(优选2个柱体积)，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 15-17-1～15-17-4各组分段；
(14)将步骤(13)得到的Fr 15-17-4通过硅胶制备薄层色谱分离，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到化合物IV。
本发明另一目的在于提供本发明所述异戊烯基取代双苯吡酮类化合物在制备CYP1A2酶抑制剂中的应用。本发明通过酶孵育反应测定本发明所述化合物对CYP1A1酶、CYP1A2酶和CYP1B1酶的抑制活性，结果显示本发明所述化合物Ⅱ能够选择性抑制CYP1A2酶的活性，而对CYP1B1酶和CYP1A1酶无抑制活性，表明本发明所述化合物Ⅱ对CYP1A2酶具有选择抑制活性，可以用于制备预防或治疗前致癌物/前诱变物经CYP1A2酶代谢激活引起的DNA突变或癌症的药物。所述前致癌物/前诱变物选自芳香胺、杂环胺类、氨基化合物、多芳环烃或黄曲霉毒素，如4-氨基联二苯、MeIQx、4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹噁啉。所述癌症包括膀胱癌、胃癌、结肠癌，可能为新药研发提供活性新化合物或者先导化合物。
本发明优点：
(1)本发明以藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)植物滇南红厚壳(Calophyllum Polyanthum Wallich ex Choisy)的干燥茎叶为原料，经浸膏提取、MCI脱色、大孔树脂脱色、硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、薄层制备色谱法分离获得一种异戊烯基取代双苯吡酮类化合物，制备方法易操作，是获得安全有效CYP1A2酶抑制剂的来源之一，可能为新药研发提供活性新化合物或者先导化合物。
(2)本发明所述化合物Ⅱ能够选择性抑制CYP1A2酶活性，而对CYP1A1酶和CYP1A2酶无抑制活性，表明本发明所述化合物Ⅱ对CYP1A2酶具有选择抑制活性，有望预防芳香胺类、杂环胺类等化合物引起的DNA突变和癌症。
附图说明
图1为化合物Ⅰ的HR-ESI-MS图。
图2为化合物Ⅰ的核磁共振1H NMR谱图。
图3为化合物Ⅰ的核磁共振13C NMR谱图。
图4为化合物Ⅰ的核磁共振1H-1H COSY谱图。
图5为化合物Ⅰ的核磁共振HSQC谱图。
图6为化合物Ⅰ的核磁共振HMBC谱图。
图7为化合物Ⅰ的核磁共振ROESY谱图。
图8为化合物Ⅱ的HR-ESI-MS图。
图9为化合物Ⅱ的核磁共振1H NMR谱图。
图10为化合物Ⅱ的核磁共振13C NMR谱图。
图11为化合物Ⅱ的核磁共振1H-1H COSY谱图。
图12为化合物Ⅱ的核磁共振HSQC谱图。
图13为化合物Ⅱ的核磁共振HMBC谱图。
图14为化合物Ⅱ的核磁共振ROESY谱图。
图15为化合物Ⅲ的HR-ESI-MS图。
图16为化合物Ⅲ的核磁共振1H NMR谱图。
图17为化合物Ⅲ的核磁共振13C NMR谱图。
图18为化合物Ⅲ的核磁共振1H-1H COSY谱图。
图19为化合物Ⅲ的核磁共振HSQC谱图。
图20为化合物Ⅲ的核磁共振HMBC谱图。
图21为化合物Ⅲ的核磁共振ROESY谱图。
图22为化合物IV的HR-ESI-MS图。
图23为化合物IV的核磁共振1H NMR谱图。
图24为化合物IV的核磁共振13C NMR谱图。
图25为化合物IV的核磁共振1H-1H COSY谱图。
图26为化合物IV的核磁共振HSQC谱图。
图27为化合物IV的核磁共振HMBC谱图。
图28为化合物IV的核磁共振ROESY谱图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。
比旋光度用JASCO P-1020型全自动数字式旋光仪测定；UV谱用Shimadzu UV-2401PC型紫外光谱仪测定；IR谱用Bruker Tensor-27傅立叶变换中红外光谱仪型红外光谱仪测定，KBr压片；HR-ESI-MS用Agilent G6230飞行时间质谱仪测定；NMR用Bruker AM-4Avance III 600型核磁共振仪测定，TMS作为内标，δ表示化学位移(单位ppm)，J表示耦合常数(单位Hz)。
薄层层析用正相硅胶板，拌样用硅胶(80～100目)和柱层析用硅胶(200～300目)均为青岛海洋化工厂生产；反相填充材料RP-18为40～60μm，Merk公司生产；大孔吸附树脂为日本三菱公司生产的D101聚苯乙烯型大孔吸附树脂；凝胶为Sephadex LH-20(GEHealthcare)；MCI填充材料为MCI-gel CHP-20P；显色剂为10％H2SO4-乙醇溶液。
实施例1
(1)取滇南红厚壳干燥茎叶20.0kg，经粉碎用95％乙醇冷浸提取3次，每次24小时，合并提取液，减压蒸馏浓缩除去乙醇，得总浸膏1.4kg。
(2)将步骤(1)所得的浓缩物用水溶解过滤后，用聚酰胺拌样，经MCI柱层析，先使用体积百分比70％甲醇-水洗脱除杂，再分别使用体积百分比85％和95％的甲醇-水溶液各洗脱4个柱体积，并浓缩得到相应的两个洗脱组分Fr E和Fr F；
(3)将步骤(2)得到的Fr F(156.0g)，用水溶解过滤后，通过大孔吸附树脂脱色，分别以水和95％乙醇洗脱，浓缩后分别得到Fr F-1和F-2组分；
(4)将步骤(3)得到的Fr F-2(108.0g)与步骤(2)得到的Fr E(85.0g)合并，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比400:1、200:1、100:1、50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相各洗脱4个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得到Fr1～26共26个组分；
(5)将步骤(4)得到的Fr 14组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相各洗脱4个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 14-1～14-33各组分；
(6)将步骤(5)得到的Fr 14-18与Fr 14-19合并后经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱2个柱体积，流速为1d/2s，每10min接一瓶，待样品完全洗脱后采用TLC监测，得到化合物Ⅰ，
化合物Ⅰ：
Figure BDA0003481075040000061
(7)将步骤(5)得到的Fr 14-12通过经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱2个柱体积，流速为1d/2s，每10min接一瓶，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 14-12-1～14-12-7各组分段；
(8)将步骤(7)得到的Fr 14-12-7通过硅胶制备薄层色谱分离，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到化合物Ⅱ，
化合物Ⅱ：
Figure BDA0003481075040000062
(9)将步骤(4)得到的Fr 16组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、6:1、5:1、3:1、1:1、1:2的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相各洗脱4个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 16-1～16-26各组分；
(10)将步骤(9)得到的Fr 16-17经ODS柱色谱，依次以体积比0:30、80:20、90:10、0:100的甲醇-水混合溶剂为流动相各洗脱4个柱体积，TLC检测合并相同组分后得到Fr 16-17-1～16-17-19各组分；
(11)步骤(10)得到的Fr 16-17-9组分通过凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱2个柱体积，流速为1d/2s，每10min接一瓶，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到化合物Ⅲ，
化合物Ⅲ：
Figure BDA0003481075040000071
(12)将步骤(4)得到的Fr 15组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相各洗脱4个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 15-1～15-31各组分；
(13)将步骤(12)得到的Fr 15-17，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂洗脱2个柱体积，流速为1d/2s，每10min接一瓶，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 15-17-1～15-17-4各组分段；
(14)将步骤(13)得到的Fr 15-17-4通过硅胶制备薄层色谱分离，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到化合物IV，
化合物IV：
Figure BDA0003481075040000072
结构鉴定：
利用核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、ROESY)和质谱分析(HR-ESI-MS)鉴定化合物的结构。
(1)本发明化合物Ⅰ为黄色粉末；
Figure BDA0003481075040000073
HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:395.1507[M-H]-(calcd.for C23H23O6 395.1500)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，确定分子式C23H24O6，不饱和度为12。同时，通过测定二维核磁共振谱HSQC、1H-1H COSY、HMBC、ROESY，确定了所有氢原子和碳原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13CNMR数据见表1和表2。
图1为化合物Ⅰ的高分辨质谱图，说明了化合物Ⅰ的分子量。图2为化合物Ⅰ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅰ结构中氢原子的归属。图3为化合物Ⅰ的核磁共振13C NMR谱图，说明了化合物Ⅰ结构中碳原子的归属。图4为化合物Ⅰ的核磁共振1H-1H COSY谱图，说明了化合物Ⅰ结构中相关氢原子的结构片段。图5为化合物Ⅰ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅰ结构中相关的碳原子与氢原子的归属。图6为化合物Ⅰ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅰ结构中各取代基的连接位置。图7为化合物Ⅰ的核磁共振ROESY谱图，进一步说明了化合物Ⅰ的连接方式。
(2)本发明化合物Ⅱ为黄色粉末；
Figure BDA0003481075040000081
HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:393.1353[M-H]-(calcd.for C23H21O6 393.1344)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，确定分子式C23H22O6，不饱和度为13。同时，通过测定二维核磁共振谱HSQC、1H-1H COSY、HMBC、ROESY，确定了所有氢原子和碳原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13CNMR数据见表1和表2。
图8为化合物Ⅱ的高分辨质谱图，说明了化合物Ⅱ的分子量。图9为化合物Ⅱ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅱ结构中氢原子的归属。图10为化合物Ⅱ的核磁共振13CNMR谱图，说明了化合物Ⅱ结构中碳原子的归属。图11为化合物Ⅱ的核磁共振1H-1H COSY谱图，说明了化合物Ⅱ结构中相关氢原子的结构片段。图12为化合物Ⅱ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅱ结构中相关的碳原子与氢原子的归属。图13为化合物Ⅱ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅱ结构中各取代基的连接位置。图14为化合物Ⅱ的核磁共振ROESY谱图，进一步说明了化合物Ⅱ的连接方式。
(3)本发明化合物Ⅲ为黄色粉末；
Figure BDA0003481075040000082
HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:309.0778[M-H]-(calcd.for C18H13O5 309.0768)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，确定分子式C18H14O5，不饱和度为12。同时，通过测定二维核磁共振谱HSQC、1H-1H COSY、HMBC、ROESY，确定了所有氢原子和碳原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13CNMR数据见表1和表2。
图15为化合物Ⅲ的高分辨质谱图，说明了化合物Ⅲ的分子量。图16为化合物Ⅲ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅲ结构中氢原子的归属。图17为化合物Ⅲ的核磁共振13C NMR谱图，说明了化合物Ⅲ结构中碳原子的归属。图18为化合物Ⅲ的核磁共振1H-1HCOSY谱图，说明了化合物Ⅲ结构中相关氢原子的结构片段。图19为化合物Ⅲ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅲ结构中相关的碳原子与氢原子的归属。图20为化合物Ⅲ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅲ结构中各取代基的连接位置。图21为化合物Ⅲ的核磁共振ROESY谱图，进一步说明了化合物Ⅲ的连接方式。
(4)本发明化合物IV为黄色粉末；
Figure BDA0003481075040000083
HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:309.0771[M-H]-(calcd.for C18H13O5 309.0768)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，确定分子式C18H14O5，不饱和度为12。同时，通过测定二维核磁共振谱HSQC、1H-1H COSY、HMBC、ROESY，确定了所有氢原子和碳原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13CNMR数据见表1和表2。
图22为化合物IV的高分辨质谱图，说明了化合物IV的分子量。图23为化合物IV的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物IV结构中氢原子的归属。图24为化合物IV的核磁共振13C NMR谱图，说明了化合物IV结构中碳原子的归属。图25为化合物IV的核磁共振1H-1HCOSY谱图，说明了化合物IV结构中相关氢原子的结构片段。图26为化合物IV的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物IV结构中相关的碳原子与氢原子的归属。图27为化合物IV的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物IV结构中各取代基的连接位置。图28为化合物IV的核磁共振ROESY谱图，进一步说明了化合物IV的连接方式。
表1化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV的1H NMR数据(CDCl3/Acetone-d6)
Figure BDA0003481075040000091
备注：δin ppm,J in Hz.1H-NMR:600MHz。
表2化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV的13C NMR数据(CDCl3/Acetone-d6)
Figure BDA0003481075040000101
备注：δin ppm,13C-NMR:150MHz。
实施例2考察本发明所述化合物Ⅱ、Ⅲ、IV抑制CYP1A1酶活性
1.实验材料
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，小鼠肝微粒体(MLM)，格拉司琼，α-萘黄酮，乙腈。
2.实验方法
2.1实验反应体系
反应体系包含格拉司琼(0.2μM)，α-萘黄酮(10μM)或化合物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，10μM)，MLM(0.5mg/mL)，缓冲液(PBS，PH＝7.4)。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式三份。①阳性对照组：同时有格拉司琼和α-萘黄酮。②阴性对照组：没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有格拉司琼和待测化合物。④空白组：只有格拉司琼。
2.2UPLC-ESI-QTOFMS分析
所有微粒体样品的分析在配备有1290四元泵(Agilent,Santa Clara,CA)的Agilent 1290系列UPLC系统上进行，药物代谢物通过XDB-C18柱(2.1×100mm，1.8mm，Agilent,Santa Clara,CA)检测。液体流量0.3mL/min。A相是0.01％甲酸水溶液，B相是含0.01％甲酸的乙腈。洗脱梯度如下：0-12min，2-98％B；12-14min，98％B；14-16min，98％A。柱温45℃。数据采用正离子模式。碰撞气体和干燥气体流量为9L/min。毛细管电压为3.5kv，温度为350℃，雾化器压力为35psi。扫描的目标离子为273.1849和289.1798。
2.3多变量数据分析和统计分析
使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件(Agilent,Santa Clara,CA,USA)进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。
3.实验结果
实验结果如表3所示，结果显示，化合物Ⅱ的CYP1A1酶抑制率为-9.90％、Ⅲ的CYP1A1酶抑制率为-26.20％，IV的CYP1A1酶抑制率为-0.710％、阳性对照α-萘黄酮的CYP1A1酶抑制率为41.68％。
实施例3考察本发明所述化合物Ⅱ、Ⅲ抑制CYP1A2酶活性
1.实验材料
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，小鼠肝微粒体(MLM)，非那西丁，α-萘黄酮，乙腈。
2.实验方法
2.1实验反应体系
反应体系包含非那西丁(0.2μM)，α-萘黄酮(1μM)或化合物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，10μM)，MLM(0.5mg/mL)，缓冲液(PBS,PH＝7.4)。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式三份。①阳性对照组：同时有α-萘黄酮和非那西丁。②阴性对照组：只有MLM，没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有非那西丁和待测化合物。④空白组：只有非那西丁。
2.2UPLC-ESI-QTOFMS分析
所有微粒体样品的分析在配备有1290四元泵(Agilent,Santa Clara,CA)的Agilent 1290系列UPLC系统上进行，药物代谢物通过XDB-C18柱(2.1×100mm，1.8mm，Agilent,Santa Clara,CA)检测。液体流量0.3mL/min。A相是0.01％甲酸水溶液，B相是含0.01％甲酸的乙腈。洗脱梯度如下：0-12min，2-98％B；12-14min，98％B；14-16min，98％B。柱温45℃。数据采用正离子模式。碰撞气体和干燥气体流量为9L/min。毛细管电压为3.5kv，温度为350℃，雾化器压力为35psi。扫描的目标离子为273.1849和289.1798。
2.3多变量数据分析和统计分析
使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件(Agilent,Santa Clara,CA,USA)进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。
3.实验结果
实验结果如表3所示，结果显示，化合物Ⅱ的CYP1A2酶抑制率为30.89％、化合物Ⅲ的CYP1A2酶抑制率为-8.30％、阳性对照α-萘黄酮的CYP1A2酶抑制率为42.30％。
实施例4考察本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、IV抑制CYP1B1酶活性
1.实验材料
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，小鼠肝微粒体(MLM)，β-雌二醇，白藜芦醇，乙腈。
2.实验方法
2.1实验反应体系
反应体系包含β-雌二醇(20μM)，白藜芦醇(10μM)或待测化合物(化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，10μM)，MLM(0.5mg/mL)，缓冲液(PBS,PH＝7.4)。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式三份。①阳性对照组：同时有白藜芦醇和雌二醇。②阴性对照组：没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有雌二醇和待测化合物。④空白组：只有雌二醇。
2.2UPLC-ESI-QTOFMS分析
UPLC-ESI-QTOFMS分析：所有微粒体样品的分析在配备有1290四元泵(Agilent,Santa Clara,CA)的Agilent 1290系列UPLC系统上进行，药物代谢物通过XDB-C18柱(2.1×100mm，1.8mm，Agilent,Santa Clara,CA)检测。液体流量0.3mL/min。A相是0.01％甲酸水溶液，B相是含0.01％甲酸的乙腈。洗脱梯度如下：0-12min，2-98％B；12-14min，98％B；14-16min，98％A。柱温45℃。数据采用正离子模式。碰撞气体和干燥气体流量为9L/min。毛细管电压为3.5kv，温度为350℃，雾化器压力为35psi。扫描的目标离子为273.1849和289.1798。
2.3多变量数据分析和统计分析
使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件(Agilent,Santa Clara,CA,USA)进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。
3.实验结果
实验结果如表3所示，结果显示，化合物Ⅰ的CYP1B1酶抑制率为6.70％、Ⅱ的CYP1B1酶抑制率为-33.20％、Ⅲ的CYP1B1酶抑制率为-42.10％，IV的CYP1B1酶抑制率为-32.90％、阳性对照白藜芦醇的CYP1B1酶抑制率为41.73％。
上述CYP1系酶活性抑制实验结果显示，化合物Ⅱ的CYP1A2酶抑制率为30.89％，而其CYP1B1和CYP1A1酶抑制率分别为-33.20％、-9.90％，因此双苯吡酮类化合物Ⅱ对CYP1A2具有靶向性，可以选择性抑制CYP1A2酶。
表3化合物抑制CYP1B1、CYP1A1、CYP1A2酶活性
Figure BDA0003481075040000131

Claims (5)

1.一种异戊烯基取代双苯吡酮类化合物在制备CYP1A2酶抑制剂中的应用，所述化合物具有如下结构：
Figure RE-FDA0003649388160000011
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述CYP1A2酶抑制剂为预防或治疗癌症的药物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述癌症包括膀胱癌、结肠癌、胃癌。
4.如权利要求1所述的异戊烯基取代双苯吡酮类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取滇南红厚壳干燥茎叶，粉碎，使用醇或醇的水溶液浸提，浓缩；
(2)将步骤(1)所得的浓缩物用水溶解过滤后，用聚酰胺拌样，经MCI柱层析，先使用体积百分比70％甲醇-水洗脱除杂，再分别使用体积百分比85％和95％的甲醇-水混合溶剂各洗脱2～5个柱体积，得到相应的两个洗脱组分Fr E和Fr F；
(3)将步骤(2)得到的组分Fr F，通过大孔吸附树脂脱色，分别以水，95％乙醇洗脱得到相应的两个洗脱组分Fr F-1和F-2组分；
(4)将步骤(3)得到的Fr F-2与步骤(2)得到的Fr E合并，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比400:1、200:1、100:1、50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相各洗脱2～6个柱体积，TLC检测合并相同组分后得到Fr 1～26共26个组分；
(5)将步骤(4)得到的Fr 14组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1、1:1石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相各洗脱2～6个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 14-1～14-33组分；
(6)将步骤(5)得到的Fr 14-12经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱1～3个柱体积，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 14-12-1～14-12-7各组分；
(7)将步骤(6)得到的Fr 14-12-7使用硅胶制备薄层色谱分离，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到权利要求1所述的异戊烯基取代双苯吡酮类化合物。
5.如权利要求4所述的异戊烯基取代双苯吡酮类化合物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)使用95％乙醇溶液冷浸提取3次，每次24小时，浓缩；
步骤(2)每个梯度洗脱4个柱体积；
步骤(4)每个梯度洗脱4个柱体积；
步骤(5)每个梯度洗脱4个柱体积；
步骤(6)洗脱2个柱体积。
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