CN112409368A - 一类c-4位取代香豆素类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一类c-4位取代香豆素类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从薄叶红厚壳植物的干燥茎叶中分离得到一类新的C‑4位取代香豆素类化合物及其制备方法和应用。以藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)植物薄叶红厚壳(Calophyllum membranaceum Garda.et Champ.)的干燥茎叶为原料，经提取、硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、Sephadex LH‑20、HPLC半制备等多种分离方法获得到五种新的C‑4位取代，C‑3、C‑4位间双键被还原的香豆素类化合物Ⅰ：
Figure DDA0002792418860000011
化合物Ⅱ：
Figure DDA0002792418860000012
化合物Ⅲ：
Figure DDA0002792418860000013
化合物Ⅳ
Figure DDA0002792418860000014
和化合物Ⅴ

Description

一类C-4位取代香豆素类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及从薄叶红厚壳植物的干燥茎叶中分离得到一类香豆素类化合物及其分离制备方法和应用。
背景技术
细胞色素P450 1B1(Cytochrome P450 1B1,CYP1B1)是一种催化底物环氧化及羟基化的亚铁血红素-硫醇盐单加氧酶，属于细胞色素P450超家族1系三个成员之一。近年来，围绕细胞色素P450 1B1功能和抑制剂筛选研究已经成为生物医学和药理学研究的前沿热点。研究表明，CYP1B1调控众多内源性物质包括类固醇激素、脂肪酸、褪黑素、维生素以及外源性物质如药物、前致癌物质、致畸物质的代谢，且该酶通过与核受体如过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)、视黄酸受体(RAR)、雌激素受体(ER)相互作用，共同维持体内重要生理物质的动态平衡，与人类多种代谢性疾病如肿瘤、肿瘤耐药、肥胖、高血压和动脉粥样硬化的发生与发展有着密切的关联。研究表明，CYP1B1酶正成为肿瘤预防、治疗和克服耐药研究中的一个新靶标，CYP1B1酶抑制剂的筛选将成为新型肿瘤药物发现的一个新途径，具有潜在的临床应用价值。而从传统药用植物中获得香豆素化合物很可能是获得安全有效CYP1B1酶抑制剂的来源之一。
薄叶红厚壳(Calophyllum membranaceum Garda.et Champ.)隶属于藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)，又名薄叶胡桐，跌打将军，皮子黄。在分布上，薄叶红厚壳主要在我国及索马里的北部有所分布，其茎和树皮在中国民间医学中常用于治疗风湿病，关节炎和腰痛。
发明内容
本发明对薄叶红厚壳茎叶的乙醇提取物进行了系统分离，以期获得具有较好生物活性的天然先导化合物，为薄叶红厚壳资源的开发与应用提供科学依据。
本发明具体技术方案如下：
一类C-4位取代香豆素类化合物，具有如下结构：
Figure BDA0002792418840000011
Figure BDA0002792418840000021
本发明另一目的在于提供本发明所述的C4-位取代香豆素类化合物的制备方法，以藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)植物薄叶红厚壳(Calophyllummembranaceum Garda.et Champ.)的干燥茎叶为原料，依次经硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、凝胶柱色谱、HPLC色谱法分离获得。
优选的，包括如下步骤：
(1)取薄叶红厚壳干燥茎叶，粉碎，使用水和/或醇浸提，优选使用水、甲醇、乙醇中的一种或几种，更优选使用95％乙醇水溶液浸提，浓缩；
(2)将步骤(1)所得的浓缩物用水溶解过滤后，用聚酰胺拌样，经MCI柱洗脱，以0％，10％，30％，50％，70％，95％的甲醇-水混合溶剂及丙酮依次进行梯度洗脱，每个梯度洗脱2-5个柱体积(优选3个柱体积)，并浓缩得到Fr A～F各组分；
(3)将步骤(2)中得到的Fr E，用硅胶拌样，以石油醚：乙酸乙酯(V:V，100:1,50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱2-5个柱体积(优选3个柱体积)，TLC检测合并相同组分后得到Fr 1～27共27个组分段。
(4)将步骤(3)中得到的Fr 6与Fr 7合并后经凝胶Sephadex LH-20柱色谱以甲醇做洗脱剂进行分离，洗脱1-3个柱体积(优选1个柱体积)，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 6-1～6-15各组分段；
(5)将步骤(4)中得到的Fr 6-4组分，采用85-100％的甲醇-水混合溶剂，优选90％的甲醇-水混合溶剂，经HPLC色谱得到化合物Ⅰ、化合物Ⅱ，优选色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent，9.4mm×250mL)，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅠ＝17min，tⅡ＝22min；
(6)将步骤(3)中得到的Fr 8组分，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱以丙酮做洗脱剂进行分离，洗脱1-3个柱体积(优选1个柱体积)，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 8-1～8-8；
(7)步骤(6)中得到的Fr 8-4组分，采用80-90％，优选85％的甲醇-水混合溶剂，经HPLC色谱等度洗脱得到化合物Ⅲ、化合物Ⅳ，优选色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent，9.4mm×250mL)，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅢ＝14min，tⅣ＝25min；
(8)步骤(3)中得到的Fr 10与Fr 11、Fr 12合并后进行正向硅胶柱层析，以石油醚：二氯甲烷混合溶剂(V:V，5:1,4:1,3:1,2:1,1:1)，每个梯度洗脱5～10个柱体积(优选5个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 10-1～10-17各组分；
(9)步骤(8)中得到的Fr 10-9组分，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇混合溶剂(V:V＝3:1)做洗脱剂进行分离，等度洗脱1-3个柱体积(优选1个柱体积)，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 10-9-1～Fr 10-9-20；
(10)步骤(9)中得到的Fr 10-9-8组分，以80-90％，优选87％的甲醇-水混合溶剂，经HPLC得到化合物Ⅴ，优选色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent，9.4mm×250mL)，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅤ＝16min。
本发明另一目的在于提供本发明所述C-4位取代香豆素类化合物在制备CYP1B1酶抑制剂中的应用。本发明采用酶孵育反应测定本发明所述化合物对细胞色素P450 1系CYP1B1酶、CYP1A1酶和CYP1A2酶的抑制活性，结果显示本发明所述化合物能够选择性抑制CYP1B1酶活性，而对CYP1A1酶和CYP1A2酶的几乎无抑制活性，表明本发明所述化合物靶向性强，副作用小，具有更高的临床应用价值，可用于改善或者预防代谢性疾病如肿瘤、肿瘤耐药、肥胖、高血压和动脉粥样硬化等疾病。
本发明优点：
(1)本发明以藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)植物薄叶红厚壳(Calophyllum membranaceum Garda.et Champ.)的干燥茎叶为原料，依次经硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、凝胶柱色谱、HPLC色谱法分离获得一类C-4位取代香豆素类化合物，该类化合物是获得安全有效CYP1B1酶抑制剂的来源之一。
(2)本发明所述化合物能够选择性抑制CYP1B1酶活性，而对CYP1A1酶和CYP1A2酶的几乎无抑制活性，表明本发明所述化合物靶向性强，副作用小，具有更高的临床应用价值。
(3)本发明化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ具有强的抑制CYP1B1酶活性，可用于改善或者预防代谢性疾病如肿瘤、肿瘤耐药、高血压和动脉粥样硬化，具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为化合物Ⅰ的HR-ESI-MS图。
图2为化合物Ⅰ的核磁共振1H NMR谱图。
图3为化合物Ⅰ的核磁共振13C NMR谱图。
图4为化合物Ⅰ的核磁共振1H-1H COSY谱图
图5为化合物Ⅰ的核磁共振HSQC谱图。
图6为化合物Ⅰ的核磁共振HMBC谱图。
图7为化合物Ⅱ的HR-ESI-MS图。
图8为化合物Ⅱ的核磁共振1H NMR谱图。
图9为化合物Ⅱ的核磁共振13C NMR谱图。
图10为化合物Ⅱ的核磁共振1H-1H COSY谱图
图11为化合物Ⅱ的核磁共振HSQC谱图。
图12为化合物Ⅱ的核磁共振HMBC谱图。
图13为化合物Ⅲ的HR-ESI-MS图。
图14为化合物Ⅲ的核磁共振1H NMR谱图。
图15为化合物Ⅲ的核磁共振13C NMR谱图。
图16为化合物Ⅲ的核磁共振1H-1H COSY谱图
图17为化合物Ⅲ的核磁共振HSQC谱图。
图18为化合物Ⅲ的核磁共振HMBC谱图。
图19为化合物Ⅳ的HR-ESI-MS图。
图20为化合物Ⅳ的核磁共振1H NMR谱图。
图21为化合物Ⅳ的核磁共振13C NMR谱图。
图22为化合物Ⅳ的核磁共振1H-1H COSY谱图。
图23为化合物Ⅳ的核磁共振HSQC谱图。
图24为化合物Ⅳ的核磁共振HMBC谱图。
图25为化合物Ⅴ的HR-ESI-MS图。
图26为化合物Ⅴ的核磁共振1H NMR谱图。
图27为化合物Ⅴ的核磁共振13C NMR谱图。
图28为化合物Ⅴ的核磁共振1H-1H COSY谱图
图29为化合物Ⅴ的核磁共振HSQC谱图。
图30为化合物Ⅴ的核磁共振HMBC谱图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。
比旋光度用JASCO P-1020型全自动数字式旋光仪测定；UV谱用Shimadzu UV-2401PC型紫外光谱仪测定；IR谱用BRUKER Tensor-27傅立叶变换中红外光谱仪型红外光谱仪测定，KBr压片；ESI-MS和HRESI-MS用Agilent G6230飞行时间质谱仪测定；FAB-MS用Thermo Fisher Scientific DFS快原子轰击离子源质谱仪测定；NMR用Brucker AM-4Avance III 600型核磁共振仪测定，TMS作为内标，δ表示化学位移(单位ppm)，J表示耦合常数(单位Hz)。
HPLC分析仪器为LC-5510型分析和半制备型高效液相色谱仪(北京东西分析)及Waters1525高效液相色谱仪，色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent,9.4mm×250mL,5μm)及Waters SunFire C18反相色谱柱；薄层层析用正相硅胶板，拌样用硅胶(80～100目)和柱层析用硅胶(200～300目)均为青岛海洋化工厂生产；反相填充材料RP-18为40-60μm，Merk公司生产；大孔吸附树脂为日本三菱公司生产的D101聚苯乙烯型大孔吸附树脂；凝胶为Sephadex LH-20(GE Healthcare)；MCI填充材料为MCI-gel CHP-20P；显色剂为10％H2SO4-乙醇溶液。
实施例1
(1)取薄叶红厚壳植物干燥茎叶15.0kg，粉碎，用95％的乙醇室温浸提3次，每次48小时，合并提取液，减压蒸馏除去溶剂，回收得乙醇浸膏1.0Kg。
(2)将浓缩浸膏水溶解、过滤后，用聚酰胺拌样，使用MCI柱层析，以0％，10％，30％，50％，70％，95％甲醇-水混合溶剂及丙酮依次进行梯度洗脱，每个梯度洗脱约3个柱体积，并浓缩得到Fr A～F各组分。
(3)取Fr E，用硅胶拌样，以石油醚：乙酸乙酯(V:V，100:1,50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱约3个柱体积，TLC检测合并相同组分后得到Fr 1～27共27个组分段。
(4)取Fr 6与Fr 7合并后，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱分离，以甲醇做洗脱剂，1d/4s流速，9min接一瓶为一组分段，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr6-1～6-15各组分。
(5)将步骤(4)洗脱组分Fr 6-4组分段，采用90％的甲醇-水混合溶剂，经HPLC色谱半制备得到化合物Ⅰ、化合物Ⅱ，色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent，9.4mm×250mL)，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅠ＝17min，tⅡ＝22min。
化合物Ⅰ：
Figure BDA0002792418840000061
化合物Ⅱ：
Figure BDA0002792418840000062
(6)取步骤(3)Fr 8组分，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱以丙酮做洗脱剂进行分离，等度洗脱1个柱体积，1d/4s流速，9min接一瓶为一组分段，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 8-1～8-8。
(7)将步骤(6)的洗脱组分Fr 8-4，采用85％的甲醇-水混合溶剂，经HPLC色谱半制备得到化合物Ⅲ、化合物Ⅳ。色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent，9.4mm×250mL)，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅢ＝14min，tⅣ＝25min。
化合物Ⅲ：
Figure BDA0002792418840000063
化合物Ⅳ：
Figure BDA0002792418840000064
(8)取步骤(3)Fr 10与Fr 11、Fr 12合并后进行正向硅胶柱层析，以石油醚：二氯甲烷(V:V，5:1,4:1,3:1,2:1,1:1)，每个梯度洗脱5个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr10-1～10-17各组分。
(9)将步骤(8)得到的Fr 10-9组分，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇(v:v＝3:1)做洗脱剂进行分离，等度洗脱1个柱体积，1d/4s流速，9min接一瓶为一组分段，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 10-9-1～Fr 10-9-20。
(10)将步骤(9)Fr 10-9-8组分，以87％甲醇-水混合溶剂，经HPLC半制备得到化合物Ⅴ。色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent，9.4mm×250mL)，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅤ＝16min。
化合物Ⅴ：
Figure BDA0002792418840000065
结构鉴定：
利用包括核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)和质谱分析(HR-ESI-MS)鉴定化合物的结构。
(1)本发明化合物Ⅰ为为橙色油状物，易溶于氯仿；[α]2D5＝-103.08(c＝0.160,MeOH)；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:417.2275[M+H]+(calcd.for C24H31O6 417.2272)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，确定分子式C24H32O6，不饱和度为9。同时，通过测定二维H-C相关谱(HSQC)、H-C远程相关谱(HMBC)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13C NMR数据见表1和表2。
图1为化合物Ⅰ的HR-ESI-MS图，说明了化合物Ⅰ的分子量。图2为化合物Ⅰ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅰ结构中各氢的归属。图3为化合物Ⅰ的核磁共振13C NMR谱图，说明了化合物Ⅰ结构中各碳的归属。图4为化合物Ⅰ的核磁共振1H-1H COSY谱图，说明了化合物Ⅰ结构中相关氢归属。图5为化合物Ⅰ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅰ结构中相关的碳与氢的归属。图6为化合物Ⅰ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅰ结构中各取代基的连接位置。
(2)本发明化合物Ⅱ为黄色油状物，易溶于氯仿；[α]2 D 5＝-102.9(c＝0.140,MeOH)；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z：425.1931[M+Na]+(calcd.for C23H30NaO6425.1935)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，确定其分子式C23H30O6，不饱和度为9。同时，通过测定二维H-C相关谱(HSQC)、H-C远程相关谱(HMBC)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。1HNMR与13C NMR数据见表1和表2。
图7为化合物Ⅱ的HR-ESI-MS图，说明了化合物Ⅱ的分子量。图8为化合物Ⅱ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅱ结构中各氢的归属。图9为化合物Ⅱ的核磁共振13C NMR谱图，说明了化合物Ⅱ结构中各碳的归属。图10为化合物Ⅱ的核磁共振1H-1H COSY谱图，说明了化合物Ⅱ结构中相关氢归属。图11为化合物Ⅱ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅱ结构中相关的碳与氢的归属。图12为化合物Ⅱ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅱ结构中各取代基的连接位置。
(3)本发明化合物Ⅲ为黄色油状物，易溶于氯仿；[α]2 D 3＝-18.95(c＝0.170,MeOH)；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z：403.2132[M-H]-(calcd.for C23H31O6 403.2126)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，可推断其分子式C23H32O6，不饱和度为8。同时，通过测定二维H-C相关谱(HSQC)、H-C远程相关谱(HMBC)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13C NMR数据见表1和表2。
图13为化合物Ⅲ的HR-ESI-MS图，说明了化合物Ⅲ的分子量。图14为化合物Ⅲ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅲ结构中各氢的归属。图15为化合物Ⅲ的核磁共振13CNMR谱图，说明了化合物Ⅲ结构中各碳的归属。图16为化合物Ⅲ的核磁共振1H-1H COSY谱图，说明了化合物Ⅲ结构中相关氢归属。图17为化合物Ⅲ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅲ结构中相关的碳与氢的归属。图18为化合物Ⅲ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅲ结构中各取代基的连接位置。
(4)本发明化合物Ⅳ为黄色油状物，易溶于氯仿；[α]2D3＝-178.55(c＝0.120,MeOH)；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z：403.2132[M-H]-(calcd.for C23H31O6 403.2126)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，可推断其分子式C23H32O6，不饱和度为8。同时，通过测定二维H-C相关谱(HSQC)、H-C远程相关谱(HMBC)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13C NMR数据见表1和表2。
图19为化合物Ⅳ的HR-ESI-MS图，说明了化合物Ⅳ的分子量。图20为化合物Ⅳ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅳ结构中各氢的归属。图21为化合物Ⅳ的核磁共振13CNMR谱图，说明了化合物Ⅳ结构中各碳的归属。图22为化合物Ⅳ的核磁共振1H-1H COSY谱图，说明了化合物Ⅳ结构中相关氢归属。图23为化合物Ⅳ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅳ结构中相关的碳与氢的归属。图24为化合物Ⅳ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅳ结构中各取代基的连接位置。
(5)本发明化合物Ⅴ为无色结晶，易溶于氯仿；[α]2 D 5＝-64.17(c＝0.180,MeOH)；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z：437.1979[M-H]-(calcd.for C26H29O6 437.1970)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，可推断其分子式C26H30O6，不饱和度为12。同时，通过测定二维H-C相关谱(HSQC)、H-C远程相关谱(HMBC)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13C NMR数据见表1和表2。
图25为化合物Ⅴ的HR-ESI-MS图，说明了化合物Ⅴ的分子量。图26为化合物Ⅴ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅴ结构中各氢的归属。图27为化合物Ⅴ的核磁共振13CNMR谱图，说明了化合物Ⅴ结构中各碳的归属。图28为化合物Ⅴ的核磁共振1H-1H COSY谱图，说明了化合物Ⅴ结构中相关氢归属。图29为化合物Ⅴ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅴ结构中相关的碳与氢的归属。图30为化合物Ⅴ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅴ结构中各取代基的连接位置。
表1化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的1H NMR数据(Acetone-d6)
Figure BDA0002792418840000091
备注：δin ppm,J in Hz.1H-NMR:600MHz。
表2化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的13C NMR数据(CDCl3)
Figure BDA0002792418840000101
备注：δin ppm,13C-NMR:150MHz。
实施例2本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅳ抑制CYP1B1酶活性筛选
1.实验材料
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，小鼠肝微粒体(MLM)，β-雌二醇，白藜芦醇，乙腈。
2.实验方法
2.1实验反应体系
反应体系包含β-雌二醇(20.0uM)，白藜芦醇(10.0uM)或待测化合物(化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，10.0μM)，MLM(0.5mg/mL)，缓冲液(PBS，pH＝7.4)。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式三份。①阳性对照组：同时有白藜芦醇和雌二醇。②阴性对照组：没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有雌二醇和待测化合物。④空白组：只有雌二醇。
2.2 UPLC-ESI-QTOFMS分析
所有微粒体样品的分析在配备有1290四元泵(Agilent,Santa Clara,CA)的Agilent 1290系列UPLC系统上进行，药物代谢物通过XDB-C18柱(2.1×100mm，1.8mm，Agilent,Santa Clara,CA)检测。液体流量0.3mL/min。A相是0.01％甲酸水溶液，B相是含0.01％甲酸的乙腈。洗脱梯度如下：0-12min，2-98％B；12-14min，98％B；14-16min，98％A。柱温45℃。数据采用正离子模式。碰撞气体和干燥气体流量为9L/min。毛细管电压为3.5kV，温度为350℃，雾化器压力为35psi。扫描的目标离子为273.1849和289.1798。
2.3多变量数据分析和统计分析
使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件(Agilent,Santa Clara,CA,USA)进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。按下列计算目标化合物的酶活性抑制率。
CYP1B1酶活性抑制率＝(阳性对照组或实验组-空白组)/(阴性对照组-空白组)×100％
3.实验结果
实验结果如表3所示。结果显示，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ均具有CYP1B1酶抑制活性，化合物Ⅰ的抑制率为38.04％、化合物Ⅳ的抑制率为19.37％，化合物Ⅱ的抑制率为43.20％与阳性对照白藜芦醇(抑制率为43.84％)相当，化合物Ⅲ的抑制率为49.72％、化合物Ⅴ的抑制率为47.00％，优于白藜芦醇。
实施例3本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ抑制CYP1A1酶活性筛选
1.实验材料
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，小鼠肝微粒体(MLM)，格拉司琼，α-萘黄酮，乙腈。
2.实验方法
2.1实验反应体系
反应体系包含格拉司琼(20.0uM)，α-萘黄酮(1.0μM)或化合物(本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ，10μM)，MLM(0.5mg/mL)，缓冲液(PBS，pH＝7.4)。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式三份。①阳性对照组：同时有格拉司琼和α-萘黄酮。②阴性对照组：没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有格拉司琼和待测化合物(化合物1或化合物3)。④空白组：只有格拉司琼。
2.2 UPLC-ESI-QTOFMS分析
所有微粒体样品的分析在配备有1290四元泵(Agilent,Santa Clara,CA)的Agilent 1290系列UPLC系统上进行，药物代谢物通过XDB-C18柱(2.1×100mm，1.8mm，Agilent,Santa Clara,CA)检测。液体流量0.3mL/min。A相是0.01％甲酸水溶液，B相是含0.01％甲酸的乙腈。洗脱梯度如下：0-12min，2-98％B；12-14min，98％B；14-16min，98％A。柱温45℃。数据采用正离子模式。碰撞气体和干燥气体流量为9L/min。毛细管电压为3.5kV，温度为350℃，雾化器压力为35psi。扫描的目标离子为273.1849和289.1798。
2.3多变量数据分析和统计分析
使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件(Agilent,Santa Clara,CA,USA)进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。按下列计算目标化合物的酶活性抑制率。
CYP1A1酶活性抑制率＝(阳性对照组或实验组-空白组)/(阴性对照组-空白组)×100％
3.实验结果
实验结果如表3所示，结果显示，阳性对照α-萘黄酮的抑制率为14.85％，化合物Ⅰ(抑制率10.97％)、Ⅱ(抑制率-4.20％)、Ⅲ(抑制率1.23％)、Ⅴ(抑制率-23.00％)对CYP1A1酶抑制率明显低于对CYP1B1的酶抑制率，说明化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ对CYP1B1具有更高的靶向性，可以选择性抑制CYP1B1酶。
实施例4本发明所述化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ抑制CYP1A2酶活性筛选
1.实验材料
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，小鼠肝微粒体(MLM)，非那西丁，α-萘黄酮，乙腈。
2.实验方法
2.1实验反应体系
反应体系包含非那西丁(20.0μM)，α-萘黄酮(1.0uM)或化合物(本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ，10.0μM)，MLM(0.5mg/mL)，缓冲液(PBS，pH＝7.4)。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式三份。①阳性对照组：同时有α-萘黄酮和非那西丁。②阴性对照组：只有HLM，没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有非那西丁和待测化合物。④空白组：只有非那西丁。
2.2 UPLC-ESI-QTOFMS分析
所有微粒体样品的分析在配备有1290四元泵(Agilent,Santa Clara,CA)的Agilent 1290系列UPLC系统上进行，药物代谢物通过XDB-C18柱(2.1×100mm，1.8mm，Agilent,Santa Clara,CA)检测。液体流量0.3mL/min。A相是0.01％甲酸水溶液，B相是含0.01％甲酸的乙腈。洗脱梯度如下：0-12min，2-98％B；12-14min，98％B；14-16min，98％B。柱温45℃。数据采用正离子模式。碰撞气体和干燥气体流量为9L/min。毛细管电压为3.5kV，温度为350℃，雾化器压力为35psi。扫描的目标离子为273.1849和289.1798。
2.3多变量数据分析和统计分析
使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件(Agilent,Santa Clara,CA,USA)进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。按下列计算目标化合物的酶活性抑制率。
CYP1A2酶活性抑制率＝(阳性对照组或实验组-空白组)/(阴性对照组-空白组)×100％
3.实验结果
实验结果如表3所示，结果显示，阳性对照α-萘黄酮的抑制率为50.13％，化合物Ⅰ(抑制率-2.507％)、Ⅲ(抑制率-3.50％)、Ⅴ(抑制率6.84％)对CYP1A2酶抑制率明显低于对CYP1B1的酶抑制率，说明化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ对CYP1B1具有更高的靶向性，可以选择性抑制CYP1B1酶。
表3化合物抑制CYP1B1、CYP1A1、CYP1A2酶活性
Figure BDA0002792418840000131

Claims (7)

1.一类C-4位取代香豆素类化合物，具有如下结构：
Figure FDA0002792418830000011
2.如权利要求1所述的C4-位取代香豆素类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取薄叶红厚壳干燥茎叶，粉碎，使用水和/或醇浸提，浓缩；
(2)将步骤(1)所得的浓缩物用水溶解过滤后，用聚酰胺拌样，经MCI柱洗脱，以0％，10％，30％，50％，70％，95％的甲醇-水混合溶剂及丙酮依次进行梯度洗脱，每个梯度洗脱2-5个柱体积，并浓缩得到Fr A～F各组分；
(3)将步骤(2)中得到的Fr E，用硅胶拌样，以石油醚：乙酸乙酯，V:V，100:1,50:1,30:1,15:1,8:1,4:1,2:1,1:1,0:1，进行梯度洗脱，每个梯度洗脱2-5个柱体积，TLC检测合并相同组分后得到Fr 1～27共27个组分段；
(4)将步骤(3)中得到的Fr 6与Fr 7合并后经凝胶Sephadex LH-20柱色谱以甲醇做洗脱剂进行分离，洗脱1-3个柱体积，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr6-1～6-15各组分段；
(5)将步骤(4)中得到的Fr 6-4组分，采用85-100％的甲醇-水混合溶剂作为洗脱剂，经HPLC色谱得到化合物Ⅰ、化合物Ⅱ，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅠ＝17min，tⅡ＝22min；
(6)将步骤(3)中得到的Fr 8组分，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱以丙酮做洗脱剂进行分离，洗脱1-3个柱体积，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 8-1～8-8；
(7)步骤(6)中得到的Fr 8-4组分，采用80-90％的甲醇-水混合溶剂，经HPLC色谱等度洗脱得到化合物Ⅲ、化合物Ⅳ，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅢ＝14min，tⅣ＝25min；
(8)步骤(3)中得到的Fr 10与Fr 11、Fr 12合并后进行正向硅胶柱层析，以石油醚：二氯甲烷混合溶剂，V:V，5:1,4:1,3:1,2:1,1:1，每个梯度洗脱5～10个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 10-1～10-17各组分；
(9)步骤(8)中得到的Fr 10-9组分，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇混合溶剂，v:v＝3:1，做洗脱剂进行分离，等度洗脱1-3个柱体积，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 10-9-1～Fr 10-9-20；
(10)步骤(9)中得到的Fr 10-9-8组分，以80-90％的甲醇-水混合溶剂，经HPLC得到化合物Ⅴ，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅤ＝16min。
3.如权利要求2所述的C4-位取代香豆素类化合物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)使用95％乙醇水溶液浸提，浓缩；
步骤(2)每个梯度洗脱3个柱体积；
步骤(3)每个梯度洗脱3个柱体积；
步骤(4)洗脱1个柱体积；
步骤(5)采用90％的甲醇-水混合溶剂洗脱；
步骤(6)洗脱1个柱体积；
步骤(7)采用85％的甲醇-水混合溶剂洗脱；
步骤(8)每个梯度洗脱5个柱体积；
步骤(9)等度洗脱1个柱体积；
步骤(10)以87％的甲醇-水混合溶剂洗脱。
4.如权利要求1所述C-4位取代香豆素类化合物在制备CYP1B1酶抑制剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述CYP1B1酶抑制剂为预防或治疗代谢性疾病的药物。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述代谢性疾病选自肿瘤、肥胖、高血压和动脉粥样硬化。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述肿瘤包括耐药性肿瘤。
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