CN116813633B

CN116813633B - 一种色原酮类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116813633B
Application number: CN202310784513.5A
Authority: CN
Inventors: 杨炳友; 刘艳; 匡海学; 孙艳
Original assignee: Heilongjiang University of Chinese Medicine
Current assignee: Heilongjiang University of Chinese Medicine
Priority date: 2023-06-29
Filing date: 2023-06-29
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2043-06-29
Also published as: CN116813633A

Abstract

本发明涉及一种色原酮类化合物及其制备方法和应用。所述色原酮类化合物从防风中提取分离得到，其具有良好的抗氧化作用，可以用于预防和治疗神经退行性疾病。

Description

一种色原酮类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体而言，本发明涉及从防风中提取得到的化合物，还涉及所述化合物的制备方法和应用。

背景技术

氧化应激是指机体受到外界环境刺激(如外源性化学物质、病毒感染、电离辐射和氧化性损伤等)使体内氧化和抗氧化系统之间的动态平衡被打破，机体抗氧化能力减弱，致使活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)不能被及时清除，产生细胞毒效应并最终损伤组织器官，从而引发相关疾病。神经系统由于本身结构特点成为最易遭受ROS攻击的器官，其导致神经细胞结构和功能改变，甚至出现老化、死亡，并诱发各种神经退行性疾病，例如阿尔茨海默症等。因此，应用抗氧化剂阻止细胞内ROS形成或消除已形成ROS，促进抗氧化物质的生成，提高机体抗氧化能力，减少氧化应激对神经细胞的损伤而延缓、阻止神经细胞的退行性变，成为治疗各种神经退行性疾病的行之有效、有发展前景的途径。

近年来，我国学者通过从中草药中提取天然产物，结合大量的动物实验和细胞实验，开发出许多具有抗氧化作用的药物，如石杉碱甲、姜黄素、淫羊藿苷、银杏叶提取物、人参皂苷、黄芪等等。因此，寻找更多具有抗氧化活性的天然产物已经成为当下研究的热点。

发明内容

本发明从防风(Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schisck)中提取分离得到一类新的色原酮类化合物，并发现其具有较好的抗氧化作用。

因此，本发明提供了一种色原酮类化合物，其选自以下化合物1～化合物5：

本发明还及所述色原酮类化合物的制备方法，其包括：

1)提取步骤：将防风(Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schisck)用8-15倍质量的50-90％乙醇加热回流提取2-4次，合并提取液，去除溶剂后得到乙醇总提物；

2)分离步骤：将乙醇总提物用水溶解后，通过选自大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱、凝胶柱色谱的柱色谱及制备型HPLC进行分离，得到所述色原酮类化合物。

优选的，步骤1中乙醇的浓度为70-80％，用量为防风质量的10-12倍；提取次数为2-3次。

优选的，步骤2中所述大孔吸附树脂选自HPD-100、HP-20等。

在一个实施方案中，步骤2包括：将乙醇总提物用水溶解后，通过大孔吸附树脂柱色谱，依次用水、20％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脱2-4BV，分别收集相应的洗脱液并浓缩，将60％乙醇洗脱组分经选自硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱、凝胶柱色谱的柱色谱及制备型HPLC进行分离。

优选的，步骤2包括：将60％乙醇洗脱组分经硅胶柱色谱分离，流动相采用二氯甲烷-甲醇(100：1→0：1)系统进行梯度洗脱，获得7个组分即Fr.A-Fr.G；Fr.D经正相硅胶柱色谱分离，流动相采用二氯甲烷-甲醇(1：0→0：1)系统进行梯度洗脱，得到14个组分即Fr.D1～Fr.D14，其中Fr.D9经ODS反相柱色谱分离，流动相采用甲醇-水(1：9→6：4)系统进行梯度洗脱，得到36个组分即Fr.D9-1～Fr.D9-36，Fr.D9-20经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水(50：50)等度洗脱，得到化合物1；Fr.D9-23经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水(52：48)等度洗脱，得到化合物5；Fr.E经正相硅胶柱色谱分离，流动相采用二氯甲烷-甲醇(1：0→0：1)系统进行梯度洗脱，得到10个组分即Fr.E1～Fr.E10，Fr.E6经ODS反相柱色谱分离，流动相采用甲醇-水(1：9→8：2)系统进行梯度洗脱，得到33个组分即Fr.E6-1～Fr.E6-33，Fr.E6-9经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水(43：57)等度洗脱，得到化合物3、化合物4；Fr.E8经ODS反相柱色谱分离，流动相采用甲醇-水(1：9→8：2)系统进行梯度洗脱，得到36个组分即Fr.E8-1～Fr.E8-36，Fr.E8-9经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，流动相采用纯甲醇洗脱，得到11个组分即Fr.E8-9-1～Fr.E8-9-11，Fr.E8-9-5经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水(45：55)等度洗脱，得到化合物2。

本发明中，所述乙醇浓度是指体积浓度。

本发明的另一方面在于提供所述色原酮类化合物在抗氧化方面的应用。

本发明发现，本发明所述色原酮类化合物具有良好的抗氧化作用，在实验中显示出对H₂O₂诱导的PC-12细胞损伤的有效保护作用。

因此，本发明提供了所述色原酮类化合物在制备抗氧化药物中的应用。本发明还提供了所述色原酮类化合物在制备神经细胞保护药物中的应用。

优选的，所述药物用于防治神经细胞损伤，尤其是H₂O₂诱导的神经细胞损伤。

优选的，所述药物可以预防和治疗神经退行性疾病。所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化等。

本发明的另一方面还在于提供一种包含所述色原酮类化合物的药物组合物。

考虑所有的给药方式，例如口服、直肠、肠胃外、局部、或通过静脉内、肌内、胸骨内或皮下注射、或以适于吸入的形式。只要合适，制剂可以方便地以个别剂量单位存在并可通过药学领域中熟知的任何方法进行制备。根据已知的和已确定的实践，所述化合物一般将与一种或多种药学上可接受的成分一起配制。因此，药物组合物可被配制成液体、粉末、可注射溶液、悬浮剂、栓剂等。

为此，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料，例如稀释剂(例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸)、润滑剂(例如，二氧化硅、滑石、硬脂酸盐及其镁盐或钙盐，和/或聚乙二醇)、粘结剂(硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)、崩解剂(淀粉、琼脂糖、海藻酸或其钠盐或共沸混合物)、吸附剂、着色剂、调味剂、甜味剂等。

在本发明的药物组合物中，色原酮类化合物的量占药物组合物总重量的0.01％到80％，优选0.1％到50％，更优选0.5％至10％。

本发明色原酮类化合物的有效剂量可以根据年龄、体重、性别、给药方法、健康状况和病症严重程度来确定。例如，一个体重70kg的成年人的剂量为0.1-1000mg/天，优选1-500mg/天。这样的给药可以一天一次至多次，根据医生或者药剂师的决定执行。

本发明还发现，本发明所述色原酮类化合物与白藜芦醇共同施用时，组合物对H₂O₂诱导的PC-12细胞损伤的保护效果显著提高，二者产生了协同的抗氧化效果。

因此，在一个实施方案中，本发明所述药物组合物还包含白藜芦醇，其中色原酮类化合物与白藜芦醇的摩尔比为1：1-5，优选为1：1.2-3，更优选为1：2。本发明还提供了所述药物组合物在制备抗氧化药物中的应用。

本发明还提供了所述药物组合物在制备神经细胞保护药物中的应用。

本发明中，洗脱剂的比例在没有其他说明的情况下，均指体积比。

本发明的有益效果：

本发明从防风中提取分离得到了一类新的色原酮类化合物，所述化合物具有良好的抗氧化作用，与白藜芦醇共用时显示出协同的抗氧化效果，因此可以用于预防和治疗神经退行性疾病。

附图说明

图1为色原酮组分的总离子流图；

图2为化合物1的¹H-¹H COSY谱；

图3为化合物1的HSQC谱；

图4为化合物1的HMBC谱；

图5为化合物2的¹H-¹H COSY谱；

图6为化合物2的HSQC谱；

图7为化合物2的HMBC谱；

图8为化合物3的¹H-¹H COSY谱；

图9为化合物3的HSQC谱；

图10为化合物3的HMBC谱；

图11为化合物4的¹H-¹H COSY谱；

图12为化合物4的HSQC谱；

图13为化合物4的HMBC谱；

图14为化合物5的¹H-¹H COSY谱；

图15为化合物5的HSQC谱；

图16为化合物5的HMBC谱；

图17为化合物1-5在H₂O₂诱导PC-12细胞损伤中的保护效果；

图18为色原酮类化合物与白藜芦醇的协同保护效果。

具体实施方式

以下将对发明的优选实例进行详细描述。所举实例是为了更好地对发明内容进行，并不是发明内容仅限于实例。根据发明内容对实施方案的非本质的改进和调整，仍属于发明范畴。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。

实施例1：化合物1-5的制备

1.1色原酮组分的提取

1.1.1材料和仪器:

材料和试剂

HPD-100型大孔吸附树脂宝恩吸附材料科技有限公司

乙腈-色谱级默克公司

甲酸-色谱级 Fisher公司

乙醇-分析级天津试剂一厂

仪器

UPLC-H-ClassPLUS超高效液相色谱系统 Waters公司

SYNAPT G2-Si Q-TOF质谱系统 Waters公司

2695-2998分析型HPLC Waters公司

ELSD-2414蒸发光检测器 Waters公司

515-2414制备型HPLC Waters公司

Bruker-600超导核磁共振光谱仪 Bruker公司

1.1.2实验方法

称取干燥防风(Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schisck)2kg，以20kg的70％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂得到70％乙醇总提物251.2g。防风总提物用水溶解后，通过HPD-100大孔吸附树脂，以1BV·h-1流速进行柱色谱洗脱，洗脱剂依次为水(2BV)、20％乙醇(2BV)、60％乙醇(4BV)、95％乙醇(2BV)，分别收集相应的洗脱液并减压浓缩，并经超高效液相色谱系统分离鉴定，色谱柱：WatersACQUITYUPLCCSH C18 column(2.1×100mm,1.7μm)，流动相：乙腈-水(溶剂中包含0.1％的甲酸，v/v)，梯度洗脱条件：流动相为0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱0～2min，5％A；2～32min，5％→100％A；32～33min，100％A；柱温为35℃；流速为0.3mL/min；进样量为3μL。

表1UPLC的梯度洗脱条件

质谱条件为：离子化模式：ESI源；毛细管电压：3000V；锥孔电压：40V；源缺省电压：80V；源温：100℃；脱溶剂气温度：400℃；锥孔气流速：50L/h；脱溶剂气流速：800L/h；采集范围：m/z 100-1500。

结果表明，60％乙醇洗脱组分为色原酮组分，其总离子流图见图1。

1.2化合物1-5的分离

1.2.1材料和仪器:

材料和试剂

prep T3(19×250mm,10μm) Waters公司

薄层色谱反相板(Rp-18) Merck公司

薄层色谱硅胶板(SilicaGel GF254) Merck公司

甲醇(色谱级) 百灵威科技有限公司

超纯水屈臣氏集团

SunFire C₁₈(4.6×150mm,5μm) Waters公司

柱色谱用硅胶(80～100,200～300目) 青岛海洋化工厂

柱色谱用化学试剂(分析级) 天津富宇精细化工有限公司

柱色谱用ODS(ODS-A-HG,50μm) YMC公司

柱色谱用凝胶Sephadex LH-20 Merck公司

氘代试剂美国剑桥CIL公司

显色剂 10％的H₂SO₄乙醇溶液

实验仪器

2424-2998型分析HPLC Waters公司

515-2414型制备HPLC Waters公司

Bruker-600超导核磁共振光谱仪 Bruker公司

TripleTOF^TM 5600高分辨质谱仪 AB SCIEX公司

1.2.2实验方法

取累积得到的323g的60％乙醇洗脱组分经硅胶柱色谱分离，流动相采用二氯甲烷-甲醇(100：1→0：1)系统进行梯度洗脱。经反复的TLC检识后合并相同组分，最终共获得7个组分即Fr.A-Fr.G。Fr.D(37.6g)经正相硅胶柱色谱分离，流动相采用二氯甲烷-甲醇(1：0→0：1)系统进行梯度洗脱，得到14个组分即Fr.D1～Fr.D14，其中Fr.D9(6.0g)经ODS反相柱色谱分离，流动相采用甲醇-水(1：9→6：4)系统进行梯度洗脱，得到36个组分即Fr.D9-1～Fr.D9-36，Fr.D9-20经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水(50：50)等度洗脱，流速5ml/min，得到化合物1(2.0mg,Rt＝25.0min)；Fr.D9-23经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水(52：48)等度洗脱，流速5ml/min，得到化合物5(1.5mg,Rt＝26.5min)。Fr.E(53.6g)经正相硅胶柱色谱分离，流动相采用二氯甲烷-甲醇(1：0→0：1)系统进行梯度洗脱，得到10个组分即Fr.E1～Fr.E10，Fr.E6(5.0g)经ODS反相柱色谱分离，流动相采用甲醇-水(1：9→8：2)系统进行梯度洗脱，得到33个组分即Fr.E6-1～Fr.E6-33，Fr.E6-9经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水(43：57)等度洗脱，流速6ml/min，得到化合物3(2.0mg,Rt＝25.0min)、4(3.7mg,Rt＝27.0min)。Fr.E8(7.5g)经ODS反相柱色谱分离，流动相采用甲醇-水(1：9→8：2)系统进行梯度洗脱，得到36个组分即Fr.E8-1～Fr.E8-36，Fr.E8-9经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，流动相采用纯甲醇洗脱，得到11个组分即Fr.E8-9-1～Fr.E8-9-11，Fr.E8-9-5经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水(45：55)等度洗脱，流速6ml/min，得到化合物2(1.1mg,Rt＝15.0min)。

1.3化合物1-5的表征

化合物1-5的理化常数如下：

化合物1

白色不定型粉末，HRESIMS m/z307.1192[M+H]⁺。

化合物2

白色不定型粉末，HRESIMS m/z323.1121[M+H]⁺。

化合物3

白色不定型粉末，HRESIMS m/z323.1118[M+H]⁺。

化合物4

白色不定型粉末，HRESIMS m/z323.1119[M+H]⁺。

化合物5

白色不定型粉末，HRESIMS m/z374.1604[M+H]⁺。

其2D-NMR见图2-16，¹H NMR和¹³C NMR数据见表2和表3：

表2化合物1-5的¹H-NMR数据(600MHz,δin ppm)

表3化合物1-5的¹³C-NMR数据(150MHz,δin ppm)

化合物1-5的结构解析如下：

实施例2：化合物1-5对H₂O₂诱导PC-12细胞损伤的保护活性检测

2.1实验材料与仪器

2.1.1材料与试剂

RPIM-1640培养基 ThermoFisher公司

胎牛血清 ThermoFisher公司

PC-12细胞上海细胞库

3％过氧化氢 MERCK公司

CCK-8试剂盒 ApexBio公司

2.1.2仪器

CO₂培养箱 ThermoFisher公司

酶标仪 BioTek公司

生物安全柜北京东联哈尔仪器制造有限公司

2.2检测方法

2.2.1化合物的配制

将分离得到化合物1-5用RPIM-1640培养基配制成100mM的母液备用。

2.2.2实验方法

将对数生长期的PC-12细胞以1×10⁴个/孔接种96孔板，24h后，用含500μM H₂O₂的完全培养基稀释待检测的化合物(100、20、4μM)，同时设置未加H₂O₂(CT)组、未加药物组(NT)以及阳性药物组(2mM NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸))，每孔100μL加入到待检测的细胞中。于实验终点(24h)前2h每孔加入10μLCCK-8，并用酶标仪检测每孔的OD₄₅₀值。

相对生存率(％)＝(OD450_{待检测药物组}/OD450_{未加H2O2组})×100％。

2.3检测结果

结果如图17所示。化合物1-5对H₂O₂诱导的PC-12细胞损伤均具有保护活性，且呈剂量依赖性。其中化合物5的保护活性最高，可以保护29％的细胞免于H₂O₂诱导的细胞损伤。

实施例3：色原酮类化合物与白藜芦醇的协同保护活性检测

实验方法同实施例2，区别在于设置未加H₂O₂(CT)组、未加药物组(NT)、化合物5组(4μM)、白藜芦醇(RSV)组(8μM)、化合物5+白藜芦醇(4μM+8μM)。

结果如图18所示，化合物5保护9％的细胞免于H₂O₂诱导的细胞损伤，白藜芦醇保护14％，而化合物5+白藜芦醇则能够保护43％，这提示色原酮类化合物与白藜芦醇之间的协同效果。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种色原酮类化合物，其选自以下化合物5：

2.一种色原酮类化合物的制备方法，其包括：

2)分离步骤：将乙醇总提物用水溶解后，通过大孔吸附树脂柱色谱HPD-100，依次用水、20％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脱2-4BV，分别收集相应的洗脱液并浓缩，将60％乙醇洗脱组分经硅胶柱色谱分离，流动相采用二氯甲烷-甲醇100：1→0：1系统进行梯度洗脱，获得7个组分即Fr.A-Fr.G；Fr.D经正相硅胶柱色谱分离，流动相采用二氯甲烷-甲醇1：0→0：1系统进行梯度洗脱，得到14个组分即Fr.D1～Fr.D14，其中Fr.D9经ODS反相柱色谱分离，流动相采用甲醇-水1：9→6：4系统进行梯度洗脱，得到36个组分即Fr.D9-1～Fr.D9-36，Fr.D9-20经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水50：50等度洗脱，得到化合物1；Fr.D9-23经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水52：48等度洗脱，得到化合物5；Fr.E经正相硅胶柱色谱分离，流动相采用二氯甲烷-甲醇1：0→0：1系统进行梯度洗脱，得到10个组分即Fr.E1～Fr.E10，Fr.E6经ODS反相柱色谱分离，流动相采用甲醇-水1：9→8：2系统进行梯度洗脱，得到33个组分即Fr.E6-1～Fr.E6-33，Fr.E6-9经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水43：57等度洗脱，得到化合物3、化合物4；Fr.E8经ODS反相柱色谱分离，流动相采用甲醇-水1：9→8：2系统进行梯度洗脱，得到36个组分即Fr.E8-1～Fr.E8-36，Fr.E8-9经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，流动相采用纯甲醇洗脱，得到11个组分即Fr.E8-9-1～Fr.E8-9-11，Fr.E8-9-5经制备型HPLC分离，流动相采用甲醇-水45：55等度洗脱，得到化合物2；

其中，所述色原酮类化合物以下化合物1～化合物5：

3.根据权利要求1所述的色原酮类化合物在制备抗氧化药物或神经细胞保护药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物用于预防和治疗神经退行性疾病。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化。

6.一种包含根据权利要求1所述的色原酮类化合物的药物组合物。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含白藜芦醇，其中色原酮类化合物与白藜芦醇的摩尔比为1：2。