KR101723869B1 - 디히드로이소쿠마린 유도체를 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해양진균 Aspergillus sp. SF-5974 및 SF-5976에서 분리된 항염증 효과를 갖는 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 염증반응과 관련하여, 미세아교세포에서 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 억제하고, 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현을 억제하여, IκB-α 인산화 및 NF-κB 활성을 억제하고, p38 MARK 인산화 수준을 감소시키는 효과가 있으며, 세포 독성이 없으므로 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해양진균 Aspergillus sp. SF-5974 및 SF-5976에서 분리된 항염증 효과를 갖는 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
염증 반응은 병원체에 의한 감염이나 조직의 손상과 같은 다양한 요인에 의해 일어나는 생체방어반응으로, 감염부위나 손상부위에만 피해를 국한시키기 위한 초기 보호 작용을 수행한다. 대부분의 경우, 이러한 염증반응은 내재면역의 구성 요소를 이용한 병원성 요인의 제거 및 특이적 적응면역의 유도 등으로 이어진다. 일반적으로 급성 염증반응은 빠르게 진행되고 짧은 기간 유지되며, 급성 염증에는 급성기 반응이라는 전신성 반응이 동반된다. 한편, 감염이나 자가면역질환과 같은 일부 질환과 관련하여 지속적인 면역 활성화의 결과로 만성 염증이 유발될 수 있으며, 대식세포의 축적과 활성화는 만성 염증반응의 증거가 된다.
미세아교세포(Microglia)는 다양한 자극에 의해 활성화되는, 뇌에 존재하는 대식세포이다. 미세아교세포의 지속적인 활성화는 종양괴사인자(TNF-α), 인터루킨 1β(IL-1β), 산화질소(NO), 및 프로스타그란딘(PGs)와 같은 전염증성 사이토카인 및 매개체들의 생산을 유발한다. 이 과정은 염증 반응의 중요한 특징이며(Fujihara et al., Pharmacol . Ther ., 100:171-194, 2003), 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증 및 HIV-연관 치매를 포함하는 퇴행성 신경질환의 발병에서 중요한 역할을 한다(Brown et al., Mol . Neurobiol ., 27:325-355, 2003). 따라서, 미세아교세포 활성화의 제어 및 활성화된 미세아교세포에서 전염증성 매개체와 사이토카인의 억제는 퇴행성 신경장애의 치료에 치료적 이점을 제공할 수 있다.
지난 수십 년 동안 유기합성과 조합화학에 의한 합성적 접근 방법이 생리 활성 물질 개발에 이용되었지만, 합성 화합물이 신약 후보물질이 되는 비율은 겨우 0.001%에 불과하였다. 그에 반해 천연 polyketide 화합물 중 약 0.3%가 신약 후보물질로 개발되었고, 이는 합성 화합물에 비해 굉장히 높은 확률인 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 천연물이 새로운 의약품을 개발하는데 상당한 경쟁력을 가지고 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 천연물, 천연물 유래 화합물은 의약품 개발에 있어서 현재 중요한 역할을 하고 있다. 진균의 이차대사산물은 신약 개발에 있어 생리활성을 갖는 천연물로 유망한 소재로 여겨지고 있으며, Penicillin, Cephalosporin, Griseofulvin, Cyclosporin A, Statin을 비롯한 수 많은 진균 유래 이차대사산물은 실제 임상에서 사용되고 있다. 특히, 지난 수십 년 동안 토양 유래 미생물에서 반복된 이차대사산물이 발견되고 있고, 해양 유래 진균은 새로운 활성 화합물을 발견하기 위한 새로운 소재로 주목받고 있다.
Aspergillus 속 균류는 약 180종으로 구성되어 있으며, 디케토피페라진, 알칼로이드 및 기타 질소 함유 대사산물로 시킴산(shikimate) 유도체 및 지질을 포함한 폴리케티드, 터페노이드, 펩타이드를 포함하는 생리활성 진균 대사산물의 여러 유형의 풍부한 원천으로 여겨진다(Bugni et al., Nat. Prod. Rep., 21:143-163, 2004; Rateb et al., Nat. Prod. Rep., 28:290-344, 2011; Gugnani et al., Front. Biosci., 8:s346-357, 2003). 해양유래 진균의 생리활성 이차대사산물에 대한 지속적인 검색 과정에서(Quang, et al., Bull. Korean Chem . Soc ., 34:3109-3112, 2013; Lee et al., Mar. Drugs, 11:4510-4526, 2013; Quang et al., Bioorg . Med . Chem. Lett ., 24:5787-5791, 2014), 해양유래 진균 균주 2개, 즉 Aspergillus spp. SF-5974 및 SF-5976의 세포로부터 얻어진 추출물의 화학 조성물을 조사하였으며, 상기 2개의 진균 균주의 화학 조성물은 매우 유사한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 해양 미생물로부터 생리활성 이차대사산물을 분리하고 그 효과를 검증하고자 예의 노력한 결과, 해양진균 Aspergillus sp. SF-5974 및 SF-5976에서 디히드로이소쿠마린 유도체를 분리한 후 그 구조를 밝혔으며, LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 자극된 BV2 미세아교세포에서 디히드로이소쿠마린 유도체의 항염효과, 특히 항신경염증 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 디히드로이소쿠마린 유도체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 개선용 식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체를 제공한다.
[화학식 1]
(상기 식에서, R2는 α-ribofuranose이다.)
본 발명은 또한, 하기 화학식 A로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 A]
(상기 식에서, R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시, C1-6 알킬 또는 α-ribofuranose이다.)
본 발명은 또한, (i) 화학식 A로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체 또는 (ii) 화학식 A로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체를 포함하는 해양진균 Aspergillus sp. SF-5974 또는 SF-5976의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 개선용 식품을 제공한다.
본 발명에 따른 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 염증반응과 관련하여, 미세아교세포에서 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 억제하고, 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현을 억제하여, IκB-α 인산화 및 NF-κB 활성을 억제하고, p38 MARK 인산화 수준을 감소시키는 효과가 있으며, 세포 독성이 없으므로 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 5'-hydroxyasperentin(화합물 6)의 열적 타원체를 나타낸 것이다.
도 2는 화합물 1의 선별된 HMBC(Heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy) 및 COSY(Correlation spectroscopy)의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 3은 LPS로 자극한 BV2 미세아교세포에서 산화질소(A-F) 생산에 대한 화합물 1 내지 6의 효과를 나타낸 것으로, 상기 세포는 화합물 1 내지 6의 표시된 농도로 30분 동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 자극하였다.
도 4는 LPS로 자극한 BV2 미세아교세포에서 PGE2(A-F) 생산에 대한 화합물 1 내지 6의 효과를 나타낸 것으로, 상기 세포를 표시된 농도의 화합물 1 내지 6로 30분동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 자극하였다.
도 5는 LPS로 자극한 BV2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 대한 화합물 1 내지 6의 효과를 나타낸 것으로, 상기 세포는 표시된 농도의 화합물 1 내지 6로 30분 동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 자극하였다.
도 6은 BV2 미세아교세포에서 LPS로 유도된 NF-κB 활성에 대한 화합물 1의 효과를 나타낸 것이다. (A)는 화합물 1(20, 40, 및 80 μM)로 30분 동안 전처리한 다음, 세포를 30분 동안 LPS로 처리하였다. 단백질을 획득하였으며, 웨스턴 블롯 분석은 IκB-α 및 p-IκB-α 항체를 이용하여 수행하였다. (B) 핵 및 세포질 추출물을 분리하고, 각각의 분획물에서 p65 및 p50 수치를 웨스턴 블롯으로 측정하였다. (C) 시판중인 NF-κB ELISA(Active Motif) 키트는 핵 추출물에서 NF-κB 바인딩 정도를 측정하는데 사용하였다. 밴드 감도는 농도계 및 β-actin 및 PCNA 효준화로 정량화하였다(증식세포핵항원). 값은 각 밴드 하단에 기재하였다.
도 7은 ERK, JNK, 및 p38 MARK 인산화 및 단백질 발현에 대한 화합물 1의 효과를 나타낸 것으로, 상기 세포는 화합물 1의 표시된 농도로 30분 동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 30분 동안 자극하였다. (A) 인산화-ERK(p-ERK), (B) 인산화-JNK(p-JNK), 및 (C) 인산화-p38 MARK(p-p38 MARK)의 수치는 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 밴드 감도는 농도계 및 β-actin 효준화로 정량화하였다. 값은 각 밴드 하단에 기재하였다.
도 2는 화합물 1의 선별된 HMBC(Heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy) 및 COSY(Correlation spectroscopy)의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 3은 LPS로 자극한 BV2 미세아교세포에서 산화질소(A-F) 생산에 대한 화합물 1 내지 6의 효과를 나타낸 것으로, 상기 세포는 화합물 1 내지 6의 표시된 농도로 30분 동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 자극하였다.
도 4는 LPS로 자극한 BV2 미세아교세포에서 PGE2(A-F) 생산에 대한 화합물 1 내지 6의 효과를 나타낸 것으로, 상기 세포를 표시된 농도의 화합물 1 내지 6로 30분동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 자극하였다.
도 5는 LPS로 자극한 BV2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 대한 화합물 1 내지 6의 효과를 나타낸 것으로, 상기 세포는 표시된 농도의 화합물 1 내지 6로 30분 동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 자극하였다.
도 6은 BV2 미세아교세포에서 LPS로 유도된 NF-κB 활성에 대한 화합물 1의 효과를 나타낸 것이다. (A)는 화합물 1(20, 40, 및 80 μM)로 30분 동안 전처리한 다음, 세포를 30분 동안 LPS로 처리하였다. 단백질을 획득하였으며, 웨스턴 블롯 분석은 IκB-α 및 p-IκB-α 항체를 이용하여 수행하였다. (B) 핵 및 세포질 추출물을 분리하고, 각각의 분획물에서 p65 및 p50 수치를 웨스턴 블롯으로 측정하였다. (C) 시판중인 NF-κB ELISA(Active Motif) 키트는 핵 추출물에서 NF-κB 바인딩 정도를 측정하는데 사용하였다. 밴드 감도는 농도계 및 β-actin 및 PCNA 효준화로 정량화하였다(증식세포핵항원). 값은 각 밴드 하단에 기재하였다.
도 7은 ERK, JNK, 및 p38 MARK 인산화 및 단백질 발현에 대한 화합물 1의 효과를 나타낸 것으로, 상기 세포는 화합물 1의 표시된 농도로 30분 동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 30분 동안 자극하였다. (A) 인산화-ERK(p-ERK), (B) 인산화-JNK(p-JNK), 및 (C) 인산화-p38 MARK(p-p38 MARK)의 수치는 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 밴드 감도는 농도계 및 β-actin 효준화로 정량화하였다. 값은 각 밴드 하단에 기재하였다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체적인 예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 Aspergillus sp. SF-5974 및 SF-5976의 추출물로부터 디히드로이소쿠마린 유도체를 분리하여, BV2 미세아교세포에서 산화질소 및 PGE2의 생성 억제와 iNOS 및 COX-2의 발현 억제를 확인하여 항염증 조성물로의 효과를 규명하였으며, IκB-α 인산화 및 NF-κB 활성 억제, p38 MARK 인산화 수준 감소의 효과가 있으며, 세포 독성이 없으므로 염증 질환의 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 화학식 1로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체에 관한 것이다.
[화학식 1]
(상기 식에서, R2는 α-ribofuranose이다.)
또한, 본 발명은 다른 관점에서 하기 화학식 A로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
[화학식 A]
(상기 식에서, R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시, C1-6 알킬 또는 α-ribofuranose이다.)
본 발명의 화학식 A로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체는 남극 로스해에서 분리한 Aspergillus sp. SF-5974 및 SF-5976로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로부터 분리된 항염증 활성, 특히 항신경염증 활성을 갖는 화합물이고, 화학식 1로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체는 분자량이 425.1812이고, 분자식이 C21H28O9인 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 염증 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하며, 본 발명에 있어서, 상기 염증 질환은 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 치주염, 치은염 및 퇴행성 신경염증으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 퇴행성 신경염증 치료에 특히 효과적이며, 상기 퇴행성 신경염증은 알츠하미어병, 파킨슨병, HIV-관련 치매(HAD), 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트 야콥병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화학식 A로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것이 바람직하다.
1) 산화질소(NO) 및 프로스타글라딘 E2(PGE2)의 생성 억제;
2) 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현 억제;
3) IκB-α(inhibitor kappa B-α)의 인산화 수준 감소;
4) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 활성화 억제; 및
5) p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 인산화 수준 감소.
본 발명의 화합물을 함유하는 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 함유하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈,수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물을 함유하는 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화 될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 건강상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질병의 정도, 약물형태, 투여시간, 투여경로 및 투여기간에 따라 그 범위가 다양하지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 하지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 유효성분을 기준으로 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 (i) 하기 화학식 A로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체 또는 (ii) 하기 화학식 A로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체를 포함하는 해양진균 Aspergillus sp. SF-5974 또는 SF-5976의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 개선용 식품을 제공하는데 있다.
[화학식 A]
(상기 식에서, R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 하이드록시, C1-6 알킬 또는 α-ribofuranose이다.)
본 발명에 따른 식품에 의해 증상이 개선될 수 있는 염증 질환은 전술한 바와 같다. 본 발명에 따른 식품은 염증질환 중에서도 특히 퇴행성 신경염증을 치료하는데 효과적이다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 건강기능 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 디히드로이소쿠마린 유도체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 디히드로이소쿠마린 유도체를 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 건강 기능식품 또한, 식품조성물로서 기능성 식품, 영양보조제, 건강 식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 디히드로이소쿠마린 유도체를 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어류, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
본원에서 "염증"이란 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로서 각종 유해한 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어 기전이다. 염증의 자극에는 감염 혹은 화학적, 물리적 자극이 있으며, 염증의 과정은 급성과 만성 염증의 2가지로 나눌 수 있다. 급성 염증은 수일이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물 제거에 관여한다. 만성 염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 보여진다.
본원에서 "산화질소"는 세포 내 염증반응 유발시 산화질소 합성효소에 의해 생성량이 증가하므로, 염증반응의 지표가 되는 물질이다. 신경계에서 산화질소는 신경세포에 존재하는 신경계 산화질소 합성효소(NOS)에 의하여 합성된다. 상기 합성된 산화질소는 뇌세포에서 cGMP의 생성을 증가시키고, 이로 인하여 외부로부터 인지한 정보를 오랫동안 저장하는 기능을 수행한다. 산화질소(NO)는 자유 라디칼로 생리학적, 병리학적 과정에 관련된 것으로 알려져 있다. NO는 산화질소 합성효소에 의해 엘-아르기닌(L-Arginine) 산화에 의해 합성된다(Atkan, et al., 75: 639-653, 2004).
본원에서 "COX-2"는 염증반응과 관련된 단백질인 프로스타그란딘을 생성하는데 관여하는 효소로서, 세포 내 COX-2 발현 수준의 증가는 염증반응이 진행되고 있음을 나타내는 지표가 될 수 있다.
본원에서 "프로스타그란딘 E2(PGE2)"는 프로스타그란딘 엔도페록시드 합성효소라고 불리는 COX-2에 의해 염증 부위에서 생성되는 다른 염증 매개체이다. PGE2는 많은 심장혈관 질환, 관절염, 염증성 장 질환 및 만성 위궤양을 포함하는 만성 염증성 질환과 관련되어 있다(St-Onge et al., Biochim . Biophys . Acta., 1771:1235-1245, 2007; Turini et al., Annu . Rev. Med ., 53:35-57, 2002; Rocca et al., Int . Immunopharmacol., 2:603-630, 2002; Singh et al., Pharmacology, 72:77-84, 2004).
[
실시예
]
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
분석 장치
광학 회전은 JASCO P-2000 디지털 편광계를 이용하여 기록하였다. UV 스펙트럼은 베크먼 DU 800 UV-visible 분광 광도계(Beckman Coulter Inc., Fullerton, USA)로 기록하였다. FT-IR 스펙트럼은 KBr 펠렛 기술을 이용한 Perkin-Elmer FT-IR 분광계(GX 스펙트럼)을 사용하여 얻었다. NMR 스펙트럼(1D 및 2D)는 JEOL JNM ECP-400 분광 광도계(400 MHz for 1H and 100 MHz for 13C) 또는 JEOL JNM ECA-600 분광 광도계(600 MHz for 1H and 150 MHz for 13C)를 사용하여 CD3OD를 기록하였으며, 화학이동은 상응하는 잔류용매의 신호(d H 4.80 및 3.30/d C 49.0)를 기준하였다. HMQC 및 HMBC 실험은 각각 1 J CH = 140 Hz 및 n J CH = 8 Hz으로 최적화되었다. HRESIMS 데이터는 ESI Q-TOF MS/MS 시스템(AB SCIEX Triple)을 사용하여 수득하였다. TLC는 Kieselgel 60 F254(1.05715; Merck) 또는 RP-18 F254s(Merck) 기판에서 수행하였다. 상기 기판을 10% H2SO4 수용액에서 분산시킨 후 가열함으로써 스팟을 확인하였다. 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔(Kieselgel 60, 70-230 mesh 및 230-400 mesh, Merck) 및 YMC 옥타데실-기능화 실리카겔(C18)로 수행하였다. Synergi semiprep-C18 컬럼(21.2×150 mm; 4 mm particle size; 80 Å pore size, 5 mL/min)을 사용하여 화합물을 HPLC로 분리하였다. 화합물들은 210 nm 및 254 nm에서 UV 흡수 피크를 나타내었다.
시약
둘베코수정이글배지(DMEM), 소 태아혈청(FBS), 및 기타 조직배양 시약은 Gibco BRL Co.로부터 구입하였다. 다른 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich Co.사의 1차 항체(COX-2: sc-1745; iNOS: sc-650; IκB-α: sc-371; p-IκB-α: sc-8404; p50: sc-7178; p65: sc-8008, Santa Cruz Biotechnology, p-ERK: #9101; ERK: #9102; p-JNK: #9251; JNK: #9252S; p-p38: #9211; p38: 9212S, Cell Signaling Technology) 및 2차 항체(mouse: ap124p; goat: ap106p; rabbit: ap132p, Millipore)로부터 수득하였다. PGE2 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트는 R&D Systems, Inc.사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다.
웨스턴
블롯
분석
BV2 미세아교세포는 채취하고 15분 동안 16,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛화하였다. 상기 세포는 PBS로 세척한 다음, 단백질 분해효소 저해제 혼합물(0.1 mM PMSF, 5 mg/mL 아프로티닌, 5 mg/mL 펩스타틴 A, 및 1 mg/mL 키모스타틴)을 함유하는 20 mM Tris-HCl 버퍼용액(pH 7.4)으로 용해시켰다. 단백질 농도는 Lowry 단백질 분석 kit(P5626; Sigma)로 측정하였다. 각 샘플에서 단백질의 동일한 양은 7.5% 및 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 분해시킨 다음, Hybond ECL(enhanced chemiluminescence) 나이트로셀룰로스 멤브레인(Bio-Red)으로 전기영동에 의해 옮겨왔다. 상기 멤브레인은 5% 무지방 우유로 오염을 방지하고, 일차 항체(Santa Cruz Biotechnology) 및 홀스래디쉬 과산화효소가 결합된 이차 항체를 순차적으로 배양하고 ECL 검출(Amersham Pharmacia Biotech)하였다.
통계 처리
모든 실험은 적어도 3회 반복해서 수행하였으며, 실험결과는 평균±표준편차로 표시하였다. 3개 이상의 그룹을 비교하기 위하여 일원변량분석(one-way analysis of the variance)을 사용한 다음, Tukey's 다중 비교 시험하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism software(version 3.03, GraphPad Software Inc)로 수행하였다.
실시예
1:
해양진균의
분리 및 확인
Aspergillus sp. SF-5974 및 Aspergillus sp. SF-5976은 2011년 2월에 남극 로스해(N 76O06.256' E 169O12.675')의 수심 300 m에서 드렛지(dredge)를 이용하여 수집한 정체불명의 붉은 해조류에서 분리하였다.
상기 분리된 홍조류의 표면을 살균하고, 샘플 1 g을 막자사발 및 막자로 분쇄한 다음, 멸균 해수(10 mL)와 혼합하였다. 상기 샘플의 일부(0.1 mL)는 부산 지역에서 수집한 멸균 해수를 함유하는 감자한천배지(PDA)에서 확산평판법(spread plate method)을 이용하여 처리하였다. 플레이트는 25℃에서 14일 동안 배양하였다. 여러 차례 분리하여 계대배양한 후, 최종 순수배양물을 선택하고 -70℃에서 보존하였다.
진균 균주 SF-5974 및 SF-5976은 이들의 리보솜 RNA(rRNA) 염기서열 분석에 기초하여 확인되었다. SF-5974(GenBank accession number KJ162245) 및 SF-5976(GenBank accession number KR150444)의 28S rRNA 유전자를 사용하여 GenBank 검색을 한 결과, Aspergillus pseudoglaucus(FR839678), Aspergillus cibarius(FR848828), 및 Aspergillus glaucus(JN938918)와 100% 유사성을 나타내었다. 따라서, 해양유래 진균 균주 SF-5974 및 SF-5976은 각각 Aspergillus sp. SF-5974 및 Aspergillus sp. SF-5976로 간주되었지만, 명확한 종은 확인되지 않았다. Aspergillus sp. SF-5974 및 SF-5976은 한국생물자원센터에 균주를 기탁하였다(기탁번호: KCTC 12949BP, KCTC 12950BP).
실시예
2:
디히드로이소쿠마린
유도체의 분리
진균 균주 SF-5974 및 SF-5976은 3% NaCl과 PDA 20 ㎖를 포함하는 각각의 100 페트리 접시(90 mm)에서 배양하였다. 플레이트는 개별적으로 진균 균주의 종자 배양물 2 ㎖을 접종하고, 25℃에서 10일 동안 배양하였다. 에틸아세테이트(2 L)와 결합된 한천배지의 추출은 SF-5974(510 mg) 및 SF-5976(629 mg)의 잔류물을 수득하여 진공 농축하여 유기상을 제공한다.
SF-5976에서 획득한 추출물은 역상 C18 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 prep. TLC, 및 semi-prep. HPLC를 포함하는 여러 단계의 크로마토그래피를 수행하여 6개의 디히드로이소쿠마린(1 내지 6)을 포함하는 8개 화합물을 수득하였다. 유사한 방법을 사용하여, SF-5974 균주에서 획득한 추출물에서 5개의 디히드로이소쿠마린(2 내지 6)을 포함하는 12개의 대사산물을 분리하였다.
2-1.
SF
-5976에서
디히드로이소쿠마린
유도체 분리
SF-5976의 건조 추출물은 C18 플래시 컬럼 크로마토그래피(5×26 cm)를 수행하여 20, 40, 60, 80, 및 100%(v/v)의 메탄올수용액(각 500 mL)으로 단계적으로 용출시켜서 분획물 5976-1-5를 각각 수득하였다. 분획물 5976-3은 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, CH2Cl2-메탄올(10:1)로 용출시켜 6개의 소분획물(5976-3-1-6)을 수득하였다. 소분획물 5976-3-1은 semi-prep. 역상 HPLC를 이용하여 추가로 정제하였으며, 70% 내지 100% 농도의 메탄올수용액으로 60분 동안 용출시켜 neoechinulin A(5 mg, t R=15.4 min), preechinulin(1.5 mg, t R=17.8 min), 및 1(2 mg, t R=18.3 min)을 수득하였다. 분획물 5976-3-3은 semi-prep. 역상 HPLC로 분리하였으며, 60 내지 100%의 메탄올수용액으로 60분 동안 농도 구배를 주어, 6개의 소분획물(5976-3-3-1-6)을 수득하였다. 소분획물 5976-3-3-2은 prep. TLC로 추가로 정제하였으며, 헥산-에틸아세테이트(1:15)를 용리액으로 이용하여 화합물 6(8 mg, Rf=0.6)을 수득하였다. 분획물 5976-4는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피로 분리하였으며, CH2Cl2-메탄올(10:1)을 용리액으로 이용하여, 2개의 소분획물(5976-4-1 및 5976-4-2)을 수득하였다. 소분획물 5976-4-1은 실리카겔 prep. TLC로 더 정제하였으며, CH2Cl2-메탄올(8:1)을 용리액으로 사용하여 3(2.0 mg, Rf=0.5)을 수득하였다. 화합물 2(15 mg)는 RP C18 컬럼 크로마토그래피로 소분획물 5976-4-2로부터 분리하였으며, 메탄올-H2O(3:1)을 용리액으로 사용하였다. 이와 유사하게, 분획물 5976-5은 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하였으며, CH2Cl2-메탄올(10:1)로 용출시켜, 6개의 소분획물(5976-5-1-6)을 수득하였다. 소분획물 5976-5-3은 RP C18 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 더 분리하였으며, 메탄올-H2O(4:1)으로 용출시켜 flavoglaucin(2.5 mg) 및 isodihydroauroglaucin(20 mg)을 수득하였다.
2-2.
SF
-5974에서
디히드로이소쿠마린
유도체 분리
SF-5974의 건조 추출물은 C18 플래시 컬럼 크로마토그래피(5×26 cm)를 수행하여 20, 40, 60, 80, 및 100%(v/v)의 메탄올수용액(각 500 mL)으로 단계적으로 용출시켜서 분획물 5974-1-5를 각각 수득하였다. 분획물 5974-3은 RP C18 컬럼 크로마토그래피를 수행하였으며, 메탄올-H2O (1:1)로 용출시켜 11개의 소분획물(5974-3-1-11)을 수득하였다. 소분획물 5974-3-2은 실리카겔 prep. TLC로 분리하였으며, 헥산-에틸아세테이트(1:9)를 용리액으로 이용하여 화합물 5(3 mg, Rf=0.5)를 수득하였다. 소분획물 5974-3-4은 semi-prep. RP HPLC를 이용하여 추가로 정제하였으며, 70 내지 100%의 메탄올수용액으로 60분 동안 농도 구배를 주어 용출시켜 화합물 6(6 mg, t R=20.3 min)을 수득하였다. Neoechinulin A(5 mg, Rf=0.6)는 실리카겔 prep. TLC로 소분획물 5974-3-7에서 분리하였으며, 헥산-에틸아세테이트(1:9)를 용리액으로 사용하였다. 소분획물 5974-3-9에서, 화합물 4(1 mg), preechinulin(1 mg), 및 questinol(2 mg)을 실리카겔 prep. TLC로 분리하였으며, 헥산-아세톤(1:5)를 용리액으로 사용하였다. 분획물 5974-4는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하였으며, CH2Cl2-메탄올(20:1)로 용출시켜 5개의 소분획물(5974-4-1-5)을 수득하였다. 소분획물 5974-4-1은 semi-prep. RP HPLC로 추가로 분리하였으며, 70 내지 100%의 메탄올수용액으로 60분 동안 농도 구배를 주어 화합물 3(8 mg, t R=33.0 min), tardioxopiperazine A(2 mg, t R=25.4 min), 및 tardioxopiperazine B(2 mg, t R=29.0 min)을 수득하였다. 동일한 방법으로, 화합물 2(15 mg, t R=21.5 min)는 소분획물 5974-4-2에서 semi-prep. RP HPLC로 정제하였으며, 메탄올 수용액(70-100 %)으로 50분 동안 구배용출(법)을 이용하였다. 분획물 5974-5는 Sephadex LH-20로 분리하였으며, CH2Cl2-메탄올(20:1)으로 용출하여 4개의 소분획물(5974-5-1-4)을 수득하였다. 소분획물 5974-5-2은 semi-prep. RP HPLC을 이용하여 추가로 정제하였으며, 메탄올 수용액(70 내지 100 %)의 구배로 용출하여 flavoglaucin(5 mg, t R=26.7 min) 및 isodihydroauroglaucin(10 mg, t R=28.8 min)을 수득하였다.
실시예
3:
디히드로이소쿠마린
유도체의 구조결정
실시예 2에서 분리한 12개의 대사산물의 NMR, MS 및 비선광도를 분석한 결과, cladosporin(2)(Jacyno et al., J. Nat. Prod., 56:1397-1401, 1993; Fujimoto et al., Chem. Pharm. Bull., 47:1426-1432, 1999), asperentin 6-O-methyl ether(3)(Scott et al., J. Antibiot., 24:747-755, 1971), cladosporin 8-O-methylether(4)(Fujimoto et al., Chem. Pharm. Bull., 47:1426-1432, 1999), 4-hydroxyasperentin(5)(Grove et al., J. Chem. Soc. Perkin 1., 22:2704-2706, 1973), 5'-hydroxyasperentin(6)(Grove et al., J. Chem. Soc. Perkin 1., 19:2400-2406, 1972), neoechinulin A(Kim et al., Molecules, 18:13245-13259, 2013), preechinulin(Wang et al., J. Nat. Prod., 70:1558-1564, 2007), tardioxopiperazine A(Fujimoto et al., Chem. Pharm. Bull., 47:1426-1432, 1999), tardioxopiperazine B(Fujimoto et al., Chem. Pharm. Bull., 47:1426-1432, 1999), flavoglaucin(Miyake et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 73:1323-1327, 2009; Kim et al., Int. J. Mol. Sci., 15:23749-23765, 2014), isodihydroauroglaucin(Miyake et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 73:1323-1327, 2009), 및 questinol(Kalidhar et al., Phytochemistry, 28:3459-3463, 1989)인 것으로 확인되었다. 참고로, 화합물 6(도 1; 30% probability of thermal ellipsoids)의 명확한 배열을 확립하기 위하여 Cu Kα 방사선을 이용한 XRD를 사용하였다.
3-1. 화합물
1
의 구조결정
화합물 1은 흰색 무정형 분말로 분리되었으며, 1H 및 13C NMR 결과와 양이온 방식 HRESIMS 스펙트럼에서 m/z 425.1812에서 [M+H]+ 이온의 관찰을 통해 분자식이 C21H28O9인 것을 밝혀내었다. 1H NMR 스펙트럼은 1,2,3,5-사치환된 벤젠고리의 존재를 암시하는, δ H 6.56 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5) 및 6.58 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-7)에서 2개의 meta-coupled 방향족 양성자에 대한 신호를 포함한다. 1H NMR 스펙트럼은 10 지방족 양성자, δ H 5.71 (1H, d, J = 4.4 Hz, H-1')에서 하나의 아노머 프로톤과 δ H 1.18 (3H, d, J = 6.8 Hz, H3-15)에서 하나의 2차 메틸기를 포함하는 9 산소 양성자에 대한 신호를 더 보여주었다. 13C NMR 및 DEPT 스펙트럼은 하나의 메틸, 6개의 메틸렌, 2개의 sp2 메틴, 7개의 sp3 메틴 및 5개의 sp2 비양성자 탄소(하나의 sp2 카보닐 탄소를 포함)를 포함하는 21개의 탄소 신호를 보여주었다. 13C NMR 스펙트럼은 하나의 락톤 카보닐 탄소(δ C 171.1, C-1), 2개의 산소 방향족 비양자성 탄소[δ C 164.9 (C-6) 및 165.1 (C-8)], 2개의 방향족 비양자성 탄소[δ C 143.1 (C-4a) 및 103.5 (C-8a)], 및 2개의 방향족 메틴(methine) 탄소[δ C 108.7 (C-5) 및 103.6 (C-7)]에 대한 공명을 보여주었으며, 이는 화합물 1이 디히드로이소쿠마린 골격을 포함하는 것을 암시한다. 화합물 1의 13C NMR 결과와 공지된 디히드로이소쿠마린 클라도스포린에 대한 비교는 화합물 1의 13C NMR 스펙트럼에서 δ C 101.5 (C-1), 73.4 (C-2'), 71.0 (C-3'), 및 88.1 (C-4')에서 4개의 옥시메틴기와 δ C 63.1 (C-5')에서 하나의 옥시메틸렌기를 나타내는 추가 신호를 제외하고는 광범위한 유사성을 보였다(Sharma et al., Bioorg. Med. Chem., 20:6821-6830, 2012; Du et al., J. Nat. Prod., 71:1837-1842, 2008). 이러한 추가 13C NMR 신호는 O-aryl ribofuranosides((Sharma et al., Bioorg. Med. Chem., 20:6821-6830, 2012) 및 isotorachrysone-6-O-α-D-ribofuranoside(Du et al., J. Nat. Prod., 71:1837-1842, 2008)와 같은 몇몇의 보고된 furanosides와 데이터를 비교하여 ribofuranosyl moiety에 할당되었다. ribofuranose의 아노머 위치 배열은 보고된 값과 비교하여 C-1 [δH 5.71 (d, J 1',2' = 4.4 Hz) 및 δC 101.5]에서 화학이동(chemical shift) 및 결합상수(coupling constant)를 토대로 α-배열에 할당되었다(Sharma et al., Bioorg. Med. Chem., 20:6821-6830, 2012; Du et al., J. Nat. Prod., 71:1837-1842, 2008). 하지만, 샘플의 한계는 화합물 1에서 α-ribofuranoside의 완벽한 배열에 대한 추가 연구를 배제하였다. δC 165.1 (C-8)와 δH 5.71 (H-1')의 HMBC 상관관계는 C-8에서 ribofuranosyl 잔기를 찾는데 사용하였다(도 2). 또한, 클라도스포린에서 8-OH와 C-1 카보닐 산소 사이에서 분자내 수소 결합에 해당하는 1H NMR 신호는 δH 11.08로 보고되었지만, C-8에서 ribofuranosyl 잔기의 위치를 지지하는 DMSO-d 6에서 획득한 화합물 1의 1H NMR 스펙트럼에서는 발견되지 않았다(Fujimoto et al., Chem. Pharm. Bull., 47:1426-1432, 1999). 화합물 1의 나머지 부분의 상대적 배열은 6의 NOESY data 분석 및 X-ray 모델과 비교로 설명하였다. NOESY 스펙트럼에서 H-10은 H3-15 (δH 1.18) 및 H-11a (δH 1.72)와는 NOE 상관관계를 보이지만, H-11b(δH 1.39)와는 상관관계를 보이지 않았다. 상기 관찰은 H-11b은 반대쪽에 위치하는 반면, H-10 및 H-11a은 화합물 1의 같은 쪽에 위치하는 것으로 나타났다. 결과적으로, H-13a(δH 1.67)와 H-11b 및 H-14(δH 3.91)와 H-13a의 NOE 상관관계는 테트라히드로피란 고리의 같은 면에 이 양성자가 위치하는 것을 알려준다. NOESY 상관관계에 기초해서, 화합물 1에서 C-10 및 C-14에 상대적인 배열은 화합물 6과 동일한 것으로 제안되었다. 5'-hydroxyasperentin(6)의 완전한 배열은 XRD 분석(도 1)로 확인되었기 때문에, 화합물 1의 배열은 presumed biosynthetic analogy(추정 생합성 아날로지)을 기반으로 3R,10R,14S로 제안될 수 있다. 상기 배치는 클라도스포린(cladosporin)의 배열과도 일치하였다(Zheng et al., J. Org. Chem., 77:5656-5663, 2012). 결국, 화합물 1의 전체 구조는 cladosporin 8-O-α-ribofuranoside로 확인되었다.
Cladosporin 8-O-α- ribofuranoside (1): 흰색, 무정형 분말; [a]D 16 +152 (c = 0.19, 메탄올); UV (메탄올) lmax (log e) 306 (2.76), 265 (3.14), 217 (3.37); IR (KBr) n max 3432, 2934, 2816, 2780, 1600, 1354, 1249, 1042, 767, 611 cm-1; 1H (CD3OD, 600 MHz) 및 13C NMR data (CD3OD, 150 MHz), 표 1 참조; HRESIMS m/z: 425.1812 [M+H]+ (calcd. for C21H29O9, 425.1812).
Cladosporin (2): 흰색 고체; [a]D 16 -20 (c = 0.62, 에탄올) [lit.(20) [a]D 20 -14.0 (c = 0.1, 에탄올)].
Asperentin 6-O-methyl ether (3): [a]D 16 -22 (c = 0.56, CHCl3).
Cladosporin 8-O-methylether (4): [a]D 16 +22 (c = 0.56, CHCl3) [lit.(10) [a]D 19 +71 (c = 0.33, CHCl3)].
4'-hydroxyasperentin (5): [a]D 16 -90 (c = 0.37, 메탄올).
5'-hydroxyasperentin (6): [a]D 16 -32 (c = 0.25, 메탄올).
3-2. 화합물
6
의 구조결정(X-ray 결정학적 분석)
증기 확산법을 이용하여 아세톤 결정화시에 무색 결정인 화합물 6을 수득하였다. 상기 결정(0.20×0.10×0.03 mm)은 샘플로부터 분리되고, 글래스 파이버 위에 부착되었다. X-ray data는 흑연-단색화 Cu Kα 방사(λ = 1.5418 at 100(2) K)와 Agilent CrysAlisPro software(Version 1.171.35.11)을 사용하여 수집하였다. Crystal data는 C16H20O6, M = 308.32, 사방정계 공간군, P 21 21 21; 단위 세포 규격 a = 7.3761(2) , b = 8.0325 (5) , c = 24.6298 (14) , V = 1459.27 (13) 3, Z = 4, D calcd = 1.403 mg/m3, μ = 0.898 mm-1, F(000) = 656이다. 구조는 SHELXL-2014을 사용하여 직접적인 방법에 의해 해결하고 전체-매트릭스 최소 제곱 차이 푸리에 기법(Fourier techniques)을 사용하여 정제하였다(Sheldrick et al., Acta. Cryst., A64:112-122, 2008). 모든 비수소 원자는 이방성 치환 파라미터로 정제하고, 모든 수소 원자는 이상적인 위치에 배치하고 riding 원자로서 상대적인 등방성 파라미터로 정제하였다. 흡수 보정은 SCALE3 ABSPACK 확장 알고리즘으로 구현한 구면 고조파(spherical harmonics)를 이용하여 수행하였다. 2697 측정은 동등한 데이터를 평균을 낸 후에 2540 독립적인 반영하여 산출하고, 로렌츠 및 편광 보정이 적용되었다. 최종 refinement은 R 1 = 0.0347 및 wR 2 = 0.0870 [I > 2σ(I)]을 수득하였다. Flack 파라미터는 [0.13(11)]로 측정되었다.
실시예
4:
디히드로이소쿠마린
유도체의 세포독성 확인
본 실시예에서는 디히드로이소쿠마린 유도체가 세포독성에 미치는 영향을 MTT 분석법을 이용하여 BV2 미세아교세포에서 확인하였다.
BV2 미세아교세포는 원광대학교(익산, 한국) 의과대학 박 현 교수로부터 입수하였다. 상기 세포는 10% 열-비활성화 FBS, 페니실린 G(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 mg/L), 및 L-글루타민(2 mM)로 보충한 DMEM 배지에서 5×105 cells/mL로 유지시키고, 5% CO2를 함유하는 대기하에 37℃에서 배양하였다. 세포 생존율은 1 mL 세포 현탁액(1×105 cells per 1 mL in 96-well plates)에 100 mg/mL 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT)를 첨가하여 측정하였으며, 30분동안 배양하였다. 포르마잔 형성은 산성 2-프로판올에 용해시키고, 광학 밀도는 540 nm에서 측정하였다.
그 결과, BV2 세포의 생존력은 10 μM 내지 80 μM 범위에서 디히드로이소쿠마린 유도체인 화합물 1 내지 6에 의해 크게 영향을 받지 않았으며, 이는 상기 화합물이 시험 농도에서 세포주에 유독하지 않음을 암시한다. 따라서, 모든 실시예에서 세포 실험은 화합물 1 내지 6 농도를 10 μM 내지 80 μM 범위 내에서 실시하였다.
실시예
5:
디히드로이소쿠마린
유도체가 NO 및
PGE
2
생성에 미치는 영향
활성화된 대식세포를 유발하는 전염증성 매개체(예: NO 및 PGE2)의 과잉생산은 염증 후 패혈증 및 조직 손상을 포함하는 다양한 염증성 질환의 병리에 관여한다. 따라서, Aspergillus spp. SF-5974 및 SF-5976에서 분리된 화합물이 LPS로 자극한 BV2 미세아교세포에서 NO 및 PGE2의 생성을 억제하는 효과에 대하여 조사하였다.
5-1.
디히드로이소쿠마린
유도체의 산화질소(NO) 억제 효과
배지에서 산화질소(NO) 생성의 지표인 NO 농도는 Griess 반응으로 측정하였다. 각 상청액(100 μL)은 Griess 시약(Solution A: 222488; Solution B: S438081, Sigma)과 동등한 부피로 혼합하고, 혼합물의 흡광도는 525 nm에서 ELISA plate reader을 사용하여 측정하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, LPS로 자극한 세포는 자극하지 않은 그룹에 비해, 배양 배지에서 아질산염(nitrite)의 농도가 약 8배 증가하였다. 하지만, 세포를 30분간 화합물 1 내지 6으로 전처리한 결과, 아질산염의 농도로 나타낸 바와 같이, 농도에 의존적으로 NO의 생성이 감소하였다(IC50은 각각 33±2; 24±1; 21±1; 28±1; 65±3, 및 20±1 μM).
5-2.
디히드로이소쿠마린
유도체의 프로스타글란딘 E
2
(
PGE
2
) 억제 효과
BV2 미세아교세포를 24-well plates에 상이한 농도의 화합물 1 내지 6으로 30분동안 사전 배양시킨 다음, LPS(Sigma-Aldrich Co.)로 24시간동안 자극하였다. 배양 상청액(100 μL)은 ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 PGE2 농도를 측정하였다.
도 4에서 나타낸 바와 같이, LPS 자극은 자극하지 않은 그룹에 비해, 배양 배지에서 PGE2 농도가 약 6배 증가하였다. 세포를 30분간 화합물 1 내지 6으로 전처리한 결과, 농도에 의존적으로 PGE2의 생성이 감소하였다(IC50은 각각 34±2; 27±1; 21±1; 30±2; 61±3 및 23±1 μM).
상기 결과로부터, 화합물 1 내지 6이 전염증성 매개체인 산화질소(NO)의 생성을 억제할 뿐만 아니라 LPS로 인한 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 억제하는 것을 확인하였다.
실시예
6:
디히드로이소쿠마린
유도체가
iNOS
및 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향
본 실시예에서는 디히드로이소쿠마린 유도체가 전염증성 효소인 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다.
LPS는 TLR-4(toll-like receptor 4) 발현을 유발하고 iNOS(Heo et al., Immunol. Lett., 120:57-64, 2008) 및 COX-2(Minghetti et al., Neuropathol. Exp. Neurol., 63:901-910, 2004; Kim et al., Biol. Pharm. Bull., 30:2345-2351, 2007)을 통하여 전염증성 매개체의 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있기 때문에, LPS로 인한 iNOS 및 COX-2 발현에 대한 화합물 1 내지 6의 효과는 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다(도 5). 미세아교세포는 비-세포독성 농도 범위(20 내지 80 μM)에서 화합물 1 내지 6의 존재 또는 부재하에 LPS(1 μg/mL)로 자극하였다.
그 결과, 상기 각각의 화합물은 용량에 의존적으로 LPS로 인한 iNOS 및 COX-2 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
실시예
7:
디히드로이소쿠마린
유도체가
IκB
-α 인산화 및
NF
-
κB
활성에 미치는 영향
NF-κB는 iNOS, COX-2, 및 염증성 사이토카인의 발현에 필수적인 것으로 알려져 있는 중요한 전사 인자이다(Kim et al., Biol. Pharm. Bull., 30:2345-2351, 2007). 따라서, 상기 NF-κB 경로에서 디히드로이소쿠마린 대사산물의 효과를 조사하기 위해 본 실시예에서는 화합물 1을 조사대상으로 선택하였다. NF-κB는 저해 단백질 IκB-α와 결합된 비활성 헤테로다이머로 세포기질에서 나타나는 두개의 서브유닛(p65 및 p50)으로 구성되어 있다(Gomez et al., J. Immunol., 175:6924-6930, 2005). 전염증성 자극(e.g., LPS)으로 자극시, IκB-α은 표적 유전자의 전사를 조절하는 핵으로 NF-κB의 전좌를 가능하게 하여, 인산화 및 단백질 가수 분해가 저하된다(Strayhorn et al., Arch. Biochem. Biophys., 400:76-84, 2002). 따라서, 화합물 1은 LPS에 의해 유도된 전염증성 효소 및 매개체의 생성을 억제하는 경로를 억제할 것으로 가정하였다.
BV2 미세아교세포는 새로 추가된 단백질 분해효소 저해제 cocktail I(EMD Biosciences) 및 1 mM 페닐메틸설포닐플로라이드(PMSF)을 함유하는 PER-Mammalian 단백질 추출 버퍼용액(1:20, w/v)(Pierce Biotechnology)에서 균질화하였다. 세포의 세포기질 분획은 4℃에서 5분 동안 16,000×g 원심분리에 의해 제조하였다. 핵 및 세포질의 세포 추출물은 각각 NE-PER 핵 및 세포질의 추출 시약으로 제조하였다.
대식세포에서 IκB-α은 LPS를 처리(1 μg/mL)한 다음 인산화되고 저하되는 것으로 나타났다. 하지만, 20 내지 80 μM의 농도 범위에서 30분 동안 화합물 1로 전처리한 것은 LPS로 인한 IκB-α의 인산화(phosphorylation) 및 저하(phosphorylation)뿐만 아니라(도 6A), 용량에 의존적으로 핵 세포기질에서 p65 및 p50의 전좌(도 6B)를 현저하게 억제하였다.
또한, NF-κB의 DNA 결합 활성 측정에서 미세아교세포는 화합물 1의 표시 농도에서 30분 동안 전처리하고, LPS(1 μg/mL)로 30분 동안 자극하였다. 핵 추출물에서 NF-κB의 DNA 결합 활성은 제조업체의 지시에 따라 TransAM 키트(Active Motif)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 화합물 1로 전처리한 것은 LPS로 자극된 BV2 미세아교세포에서 얻은 핵 추출물 NF-κB의 DNA 결합 활성도 억제하였다. 도 6C에 나타난 바와 같이, LPS로 자극된 세포는 NF-κB 결합 활성(약 10배)이 현저하게 증가하였지만, 화합물 1은 용량에 의존적으로 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, 디히드로이소쿠마린 유도체인 화합물 1의 항신경염증 효과는 NF-κB 활성 억제와 적어도 부분적으로는 연관되어 있음을 알 수 있다.
실시예
8:
디히드로이소쿠마린
유도체가 MARK 인산화에 미치는 영향
MAPK 신호전달경로는 염증반응 시 합성 및 활성화된 대식세포에 의한 전염증성 매개체의 배출을 조절한다(Bondeson., Gen. Pharmacol., 29:127-150, 1997). MAPK 경로에서 화합물 1의 영향을 조사하기 위하여, BV2 미세아교세포에서 ERK, JNK 및 p38의 LPS로 인한 인산화에 대하여 화합물 1의 효과를 확인하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, LPS 자극 30분 후 ERK, JNK 및 p38의 인산화 수치는 현저하게 증가하였다. 화합물 1로 30분 동안 전처리된 세포는 용량에 의존적으로 p38의 LPS로 인한 인산화를 현저하게 억제하였지만(도 7C), ERK 및 JNK의 인산화에는 영향이 없었다. LPS와 화합물 1은 BV2 미세아교세포내에서 ERK, JNK, 및 p38의 발현에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌으며, 특히 화합물 1이 p38 신호전달경로를 억제하여 염증(반응)을 조절한다는 것을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (10)
- 하기 화학식 1로 표시되는 디히드로이소쿠마린 유도체:
[화학식 1]
상기 식에서, R2는 α-ribofuranose이다.
- 제1항에 있어서, 상기 디히드로이소쿠마린 유도체는 해양진균 Aspergillus sp. SF-5974 및 SF-5976로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 유도체.
- 제1항의 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 디히드로이소쿠마린 유도체는 해양진균 Aspergillus sp. SF-5974 및 SF-5976로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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- 제1항의 디히드로이소쿠마린 유도체를 유효성분으로 함유하는 염증 질환 개선용 식품.
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Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160009313A KR101723869B1 (ko) | 2016-01-26 | 2016-01-26 | 디히드로이소쿠마린 유도체를 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160009313A KR101723869B1 (ko) | 2016-01-26 | 2016-01-26 | 디히드로이소쿠마린 유도체를 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
Publications (1)
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| KR101723869B1 true KR101723869B1 (ko) | 2017-04-07 |
Family
ID=58583307
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| KR1020160009313A KR101723869B1 (ko) | 2016-01-26 | 2016-01-26 | 디히드로이소쿠마린 유도체를 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
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|---|---|
| KR (1) | KR101723869B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107400108A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-11-28 | 华南农业大学 | 一种双香豆素衍生物及其制备方法与应用 |
-
2016
- 2016-01-26 KR KR1020160009313A patent/KR101723869B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Cell Host & Microbe. 2012. Vol. 11, pp. 654-663* |
| Cell Host & Microbe. 2012. Vol. 11, pp. 654-663* * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107400108A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-11-28 | 华南农业大学 | 一种双香豆素衍生物及其制备方法与应用 |
| CN107400108B (zh) * | 2017-08-09 | 2019-08-13 | 华南农业大学 | 一种双香豆素衍生物及其制备方法与应用 |
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