CN115850292B - 一类新的c-4位取代香豆素类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及一类新的C–4位取代香豆素类化合物及其制备方法和应用。以藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)植物滇南红厚壳(Calophyllum Polyanthum Wallich ex Choisy)的干燥茎叶为原料，经浸膏提取、MCI脱色、大孔树脂脱色、硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、Sephadex LH‑20、薄层制备色谱、HPLC半制备等多种分离方法获得到新的香豆素类化合物Ⅰ：化合物Ⅱ：和化合物Ⅲ：
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及从滇南红厚壳植物的干燥茎叶中分离得到一类C-4位取代香豆素类化合物及其分离制备方法和应用。
背景技术
细胞色素P450(Cytochrome P450，简称CYP450)为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族，是自然界分布最广泛、含量最丰富、底物最广的Ⅰ相代谢酶系。CYP1系酶是细胞色素P450中一个重要的亚家族，包括CYP1A1酶，CYP1A2酶和CYP1B1酶。CYP1B1酶能够催化底物环氧化及羟基化，参与多种内源性物质如类固醇激素、脂肪酸、褪黑素、维生素和外源性化合物如药物、环境化合物的代谢，且该酶通过与核受体如雌激素受体(ER)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)、视黄酸受体(RAR)相互作用，共同维持内源性物质的动态平衡。例如，17β-雌二醇(E2，1)代谢有两种常见的途径(1)经CYP1A1酶及CYP1A2酶氧化成无毒的17β-雌二醇-2,3-二酮；(2)被CYP1B1酶和过氧化酶代谢生成17β-雌二醇-3,4-二酮，该代谢产物能够和DNA发生迈克尔加成，从而导致DNA的突变，对乳腺癌和子宫内膜癌的发生发展起了促进作用。又例如乳腺癌组织中CYP1B1酶表达明显高于正常乳腺组织，而肿瘤细胞中高表达CYP1B1酶可使肿瘤细胞对多西紫杉醇的敏感性显著降低，导致肿瘤的耐药性。因此抑制CYP1系酶表达是肿瘤治疗、预防和克服肿瘤耐药的可行途径，具有潜在的广泛的临床意义。
滇南红厚壳(Calophyllum Polyanthum Wallich ex Choisy)，又名云南横经席、云南胡桐，隶属藤黄科(Clusiaceae)红厚壳属(Calophyllum)。该植物主要分布于我国云南南部的景洪、澜沧、西双版纳、临沧等海拔600～2000m的热带山地雨林和热带雨林中，老挝、缅甸、印度等地也有分布。红厚壳属植物主要含有香豆素类、双苯吡酮类、黄酮类、萜类等化合物，具有抗肿瘤、抗HIV、抗炎、抑菌、抗氧化等多种药理活性。红厚壳属植物资源丰富，具有很高的药用价值，常作为民间药物，用于治疗如牙痛、风湿、腹泻、慢性胃溃疡、皮肤感染及创伤。
发明内容
本发明从滇南红厚壳中分离得到一类C-4位取代香豆素类化合物，具有如下结构：
其中，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均具有CYP1B1酶抑制活性。
本发明一目的在于提供所述C-4位取代香豆素类化合物的制备方法，以藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)植物滇南红厚壳(Calophyllum PolyanthumWallich ex Choisy)的干燥茎叶为原料，经浸膏提取、MCI脱色、大孔树脂脱色、硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、薄层制备色谱、HPLC色谱法分离获得。
优选的，包括如下步骤：
(1)取滇南红厚壳干燥茎叶，粉碎，使用醇或醇水溶液浸提，如水、甲醇、乙醇中的一种或几种，优选使用体积百分比为95％乙醇水溶液冷浸提取3次，每次24小时，浓缩；
(2)将步骤(1)所得的浓缩物用水溶解过滤后，用聚酰胺拌样，经MCI柱层析，先使用体积百分比70％甲醇水溶液洗脱除杂，再依次使用85％和95％的甲醇水溶液各洗脱2～5个柱体积(优选4个柱体积)，得到相应的两个洗脱组分Fr E和Fr F组分；
(3)将步骤(2)得到的组分Fr F，通过大孔吸附树脂脱色，依次以水，体积百分比95％乙醇水溶液洗脱，相应的两个洗脱组分Fr F-1和F-2组分；
(4)将步骤(3)得到的Fr F-2与步骤(2)得到的Fr E合并，用硅胶拌样，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比400:1、200:1、100:1、50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得到Fr 1～26共26个组分；
(5)将步骤(4)得到的Fr 17通过ODS柱色谱，依次以体积比70:30、80:20、90:10、100:0甲醇-水混合溶剂为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得到Fr 17-1～Fr 17-24组分；
(6)将步骤(5)得到的Fr 17-9，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂洗脱1～3个柱体积(优选2个柱体积)，采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 17-9-1～Fr 17-9-11各组分；
(7)将步骤(6)得到的Fr 17-9-2与Fr 17-9-3、Fr 17-9-4合并，通过硅胶制备薄层色谱分离，以体积比1:3的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到Fr 17-9-2-1；
(8)步骤(7)得到的Fr 17-9-2-1组分，经HPLC色谱，以82％的甲醇-水混合溶剂为流动相，洗脱得到化合物Ⅰ，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅤ＝21min。
(9)将步骤(4)得到的Fr 12组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:1、7:1、5:1、3:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 12-1～Fr 12-14组分；
(10)将步骤(9)得到的Fr 12-6与Fr 12-7、Fr 12-8合并后经ODS柱色谱，依次体积比70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇-水混合溶剂为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得到Fr 12-6-1～Fr12-6-12组分；
(11)步骤(10)得到的Fr 12-6-10使用硅胶制备薄层色谱分离，以体积比1:2的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到化合物Ⅱ。
(12)将步骤(4)中得到的Fr 18组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:1、7:1、5:1、3:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相各洗脱2～6个柱体积(优选4个柱体积)，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 18-1～Fr 18-20组分；
(13)将步骤(12)中得到的Fr 18-8、Fr 18-9与Fr 18-10合并，经凝胶SephadexLH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂洗脱1～3个柱体积(优选2个柱体积)，采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 18-8-1～18-8-3各组分；
(14)步骤(13)中得到的Fr 18-8-1组分，以85％的甲醇-水混合溶剂为流动相，经HPLC色谱等度洗脱得到化合物Ⅲ，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅤ＝70min。
本发明另一目的在于提供所述C-4位取代香豆素类化合物在制备CYP1酶抑制剂中的应用，本发明通过酶孵育反应测定本发明所述化合物对CYP1系CYP1A1酶、CYP1A2酶和CYP1B1酶的抑制活性，结果显示，本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均能够选择性抑制CYP1B1酶活性，而对CYP1A1酶和CYP1A2酶几乎无抑制活性。因此，表明本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均对CYP1B1酶有高选择抑制活性，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ可用于制备CYP1B1酶抑制剂。进一步的，所述CYP1B1酶抑制剂为预防或治疗前致癌物/前诱变物经CYP1B1酶代谢激活引起的DNA突变或癌症的药物，或者为预防或治疗CYP1B1酶高表达引起的肿瘤耐药，或者为预防或治疗代谢性疾病的药物。所述前致癌物/前诱变物选自芳香胺、杂环胺类、多芳环烃、多卤代芳烃类。例如蒽、芘、菲、萘、二甲基苯并蒽、二噁英、多氯联苯。所述癌症为乳腺癌、肺癌；所述代谢性疾病选自高血压、动脉粥样硬化和肥胖。
本发明优点：
(1)本发明以藤黄科(Guttiferae)红厚壳属(Calophyllum)植物滇南红厚壳(Calophyllum Polyanthum Wallich ex Choisy)的干燥茎叶为原料，经浸膏提取、MCI脱色、大孔树脂脱色、硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、薄层制备色谱、HPLC色谱法分离获得一类C-4位取代香豆素类化合物，制备方法易操作，获得CYP1B1酶抑制剂，为新药研发提供新化合物或者先导化合物。
(2)本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ能够选择性抑制CYP1B1酶活性，而对CYP1A1酶和CYP1A2酶几乎无抑制活性；表明本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对CYP1B1酶有高选择抑制性。(3)本发明化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ能够靶向抑制CYP1B1酶活性，可用于改善或者预防肿瘤、肿瘤耐药、代谢性疾病如高血压、动脉粥样硬化、肥胖等疾病，具有潜在的广泛的临床应用价值。
附图说明
图1为化合物Ⅰ的HR-ESI-MS图。
图2为化合物Ⅰ的核磁共振1H NMR谱图。
图3为化合物Ⅰ的核磁共振13C NMR谱图。
图4为化合物Ⅰ的核磁共振1H-1H COSY谱图
图5为化合物Ⅰ的核磁共振HSQC谱图。
图6为化合物Ⅰ的核磁共振HMBC谱图。
图7为化合物Ⅰ的核磁共振ROESY谱图。
图8为化合物Ⅱ的HR-ESI-MS图。
图9为化合物Ⅱ的核磁共振1H NMR谱图。
图10为化合物Ⅱ的核磁共振13C NMR谱图。
图11为化合物Ⅱ的核磁共振1H-1H COSY谱图
图12为化合物Ⅱ的核磁共振HSQC谱图。
图13为化合物Ⅱ的核磁共振HMBC谱图。
图14为化合物Ⅱ的核磁共振ROESY谱图。
图15为化合物Ⅲ的HR-ESI-MS图。
图16为化合物Ⅲ的核磁共振1H NMR谱图。
图17为化合物Ⅲ的核磁共振13C NMR谱图。
图18为化合物Ⅲ的核磁共振1H-1H COSY谱图
图19为化合物Ⅲ的核磁共振HSQC谱图。
图20为化合物Ⅲ的核磁共振HMBC谱图。
图21为化合物Ⅲ的核磁共振ROESY谱图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。
比旋光度用JASCO P-1020型全自动数字式旋光仪测定；UV谱用Shimadzu UV-2401PC型紫外光谱仪测定；IR谱用Bruker Tensor-27傅立叶变换中红外光谱仪型红外光谱仪测定，KBr压片；HR-ESI-MS用Agilent G6230飞行时间质谱仪测定；NMR用Bruker AM-4Avance III 600型核磁共振仪测定，TMS作为内标，δ表示化学位移(单位ppm)，J表示耦合常数(单位Hz)。
HPLC分析仪器为LC-5510型分析和半制备型高效液相色谱仪(北京东西分析)，色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent,9.4mm×250mL,5μm)反相色谱柱；薄层层析用正相硅胶板，拌样用硅胶(80～100目)和柱层析用硅胶(200～300目)均为青岛海洋化工厂生产；反相填充材料RP-18为40-60μm，Merk公司生产；大孔吸附树脂为日本三菱公司生产的D101聚苯乙烯型大孔吸附树脂；凝胶为Sephadex LH-20(GE Healthcare)；MCI填充材料为MCI-gelCHP-20P；显色剂为10％H2SO4-乙醇溶液。
实施例1
(1)取滇南红厚壳干燥茎叶20.0kg，经粉碎用体积百分比95％乙醇水溶液冷浸提取3次，每次24小时，合并提取液，减压蒸馏浓缩除去乙醇，得总浸膏1.4kg。
(2)将步骤(1)所得的浓缩物用水溶解过滤后，用聚酰胺拌样，经MCI柱层析，先使用体积百分比70％甲醇水溶液洗脱除杂，再依次使用体积百分比85％和95％的甲醇水溶液各洗脱4个柱体积，得到相应的两个洗脱组分Fr E和Fr F组分；
(3)将步骤(2)得到的Fr F(156.0g)，用水溶解过滤后，通过大孔吸附树脂脱色，依次以水，体积百分比95％乙醇水溶液洗脱，浓缩后得到相应的两个洗脱组分Fr F-1～F-2；
(4)将步骤(3)得到的Fr F-2(108.0g)与步骤(2)得到的Fr E(85.0g)合并，用硅胶拌样，进行正向硅胶柱层析，依次以石油醚-乙酸乙酯(v:v，400:1、200:1、100:1、50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1)为流动相各洗脱4个柱体积，TLC检测合并相同组分后得到Fr 1～26共26个组分段；
(5)将步骤(4)中得到的Fr 17通过ODS柱色谱，依次以甲醇-水混合溶剂(v:v，70:30、80:20、90:10、100:0)为流动相各洗脱4个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得到Fr17-1～17-24各组分；
(6)将步骤(5)中得到的Fr 17-9，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比1:3的二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂洗脱2个柱体积，流速为1d/2s，每10min接一瓶，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 17-9-1～17-9-11各组分段；
(7)将步骤(6)中得到的Fr 17-9-2与Fr 17-9-3、Fr 17-9-4合并通过硅胶制备薄层色谱分离，以石油醚-二氯甲烷混合溶剂(v:v＝1:3)进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到Fr 17-9-2-1；
(8)步骤(7)中得到的Fr 17-9-2-1组分，经HPLC色谱以82％的甲醇-水混合溶剂为流动相，洗脱得到化合物Ⅰ，优选色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent，9.4mm×250mL)，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅤ＝21min，
化合物Ⅰ：
(9)将步骤(4)得到的Fr 12组分，进行正向硅胶柱层析，依次以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(v:v，100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:1、7:1、5:1、3:1、1:1)为流动相各洗脱4个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 12-1～12-14各组分；
(10)将步骤(9)得到的Fr 12-6与Fr 12-7、Fr 12-8合并后经ODS柱色谱，以甲醇-水混合溶剂(v:v，70:30、80:20、90:10、100:0)为流动相各洗脱4个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得到Fr 12-6-1～12-6-12各组分；
(11)步骤(10)得到的Fr 12-6-10组分，使用硅胶制备薄层色谱分离，以体积比1:2的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到化合物Ⅱ。
化合物Ⅱ：
(12)将步骤(4)中得到的Fr 18组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:1、7:1、5:1、3:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相各洗脱4个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 18-1～Fr 18-20组分；
(13)将步骤(12)中得到的Fr 18-8、Fr 18-9与Fr 18-10合并，经凝胶SephadexLH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂洗脱2个柱体积，流速为1d/2s，每10min接一瓶，待样品完全洗脱后采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 18-8-1～18-8-3各组分；
(14)步骤(13)中得到的Fr 18-8-1组分，以85％的甲醇-水混合溶剂为流动相，经HPLC色谱等度洗脱得到化合物Ⅲ，流速v＝2mL/min，检测波长λ＝210nm，出峰时间tⅤ＝70min，
化合物Ⅲ：
(1)本发明化合物Ⅰ为无色油状；(c＝0.120,MeOH)；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:469.1625[M+Na]+(calcd.for C27H26O6Na 469.1622)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，确定分子式C27H26O6，不饱和度为15。同时，通过测定二维核磁共振谱1H-1H COSY、HSQC、HMBC、ROESY，确定了所有氢原子和碳原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13C NMR数据见表1和表2。
图1为化合物Ⅰ的高分辨质谱图，说明了化合物Ⅰ的分子量。图2为化合物Ⅰ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅰ结构中氢原子的归属。图3为化合物Ⅰ的核磁共振13C NMR谱图，说明了化合物Ⅰ结构中碳原子的归属。图4为化合物Ⅰ的核磁共振1H-1H COSY谱图，说明了化合物Ⅰ结构中相关氢原子结构片段。图5为化合物Ⅰ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅰ结构中相关的碳原子与氢原子的归属。图6为化合物Ⅰ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅰ结构中各取代基的连接位置。图7为化合物Ⅰ的核磁共振ROESY谱图，进一步说明了化合物Ⅰ的连接方式。
(2)本发明化合物Ⅱ为无色油状；(c＝0.190,MeOH)；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:475.2479[M+H]+(calcd.for C30H35O5 475.2479)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，确定分子式C30H34O5，不饱和度为14。同时，通过测定二维核磁共振谱1H-1H COSY、HSQC、HMBC、ROESY，确定了所有氢原子和碳原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13CNMR数据见表1和表2。
图8为化合物Ⅱ的高分辨质谱图，说明了化合物Ⅱ的分子量。图9为化合物Ⅱ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅱ结构中氢原子的归属。图10为化合物Ⅱ的核磁共振13C-NMR谱图，说明了化合物Ⅱ结构中碳原子的归属。图11为化合物Ⅱ的核磁共振1H-1H COSY谱图，说明了化合物Ⅱ结构中相关氢原子结构片段。图12为化合物Ⅱ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅱ结构中相关的碳原子与氢原子的归属。图13为化合物Ⅱ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅱ结构中各取代基的连接位置。图14为化合物Ⅱ的核磁共振ROESY谱图，进一步说明了化合物Ⅱ的连接方式。
(3)本发明化合物Ⅲ为无色油状；(c＝0.120,MeOH)；HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:611.3351[M+Na]+(calcd.for C37H48O6Na 611.3343)；结合1H-NMR谱，13C-NMR谱，确定分子式C37H48O6，不饱和度为14。同时，通过测定二维核磁共振谱1H-1H COSY、HSQC、HMBC、ROESY，确定了所有氢原子和碳原子的信号归属及该化合物的化学结构。1H NMR与13C NMR数据见表1和表2。
图15为化合物Ⅲ的高分辨质谱图，说明了化合物Ⅲ的分子量。图16为化合物Ⅲ的核磁共振1H NMR谱图，说明了化合物Ⅲ结构中氢原子的归属。图17为化合物Ⅲ的核磁共振13C-NMR谱图，说明了化合物Ⅲ结构中碳原子的归属。图18为化合物Ⅲ的核磁共振1H-1HCOSY谱图，说明了化合物Ⅲ结构中相关氢原子结构片段。图19为化合物Ⅲ的核磁共振HSQC谱图，说明了化合物Ⅲ结构中相关的碳原子与氢原子的归属。图20为化合物Ⅲ的核磁共振HMBC谱图，说明了化合物Ⅲ结构中各取代基的连接位置。图21为化合物Ⅲ的核磁共振ROESY谱图，进一步说明了化合物Ⅲ的连接方式。
表1化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的1H NMR数据(CDCl3)
备注：δin ppm,J in Hz.1H-NMR:600MHz。
表2化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的13C NMR数据(CDCl3)
备注：δin ppm,13C-NMR:150MHz。
实施例2考察本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ抑制CYP1A1酶活性
1.实验材料
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，小鼠肝微粒体(MLM)，格拉司琼，α-萘黄酮，乙腈。
2.实验方法
2.1实验反应体系
反应体系包含格拉司琼(0.2μM)，α-萘黄酮(10μM)或化合物(Ⅰ、Ⅱ，10μM)，MLM(0.5mg/mL)，缓冲液(PBS，pH＝7.4)。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式三份。①阳性对照组：同时有格拉司琼和α-萘黄酮。②阴性对照组：没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有格拉司琼和待测化合物。④空白组：只有格拉司琼。
2.2UPLC-ESI-QTOFMS分析
所有微粒体样品的分析在配备有1290四元泵(Agilent,Santa Clara,CA)的Agilent 1290系列UPLC系统上进行，药物代谢物通过XDB-C18柱(2.1×100mm，1.8mm，Agilent,Santa Clara,CA)检测。液体流量0.3mL/min。A相是0.01％甲酸水溶液，B相是含0.01％甲酸的乙腈。洗脱梯度如下：0-12min，2-98％B；12-14min，98％B；14-16min，98％A。柱温45℃。数据采用正离子模式。碰撞气体和干燥气体流量为9L/min。毛细管电压为3.5kv，温度为350℃，雾化器压力为35psi。扫描的目标离子为273.1849和289.1798。
2.3多变量数据分析和统计分析
使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件(Agilent,Santa Clara,CA,USA)进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。
3.实验结果
实验结果如表3所示，结果显示，化合物Ⅰ对CYP1A1酶的抑制率为-13.30％、化合物Ⅱ对CYP1A1酶的抑制率为20.98％，阳性对照α-萘黄酮对CYP1A1酶的抑制率为41.68％。实施例3考察本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ抑制CYP1A2酶活性
1.实验材料
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，小鼠肝微粒体(MLM)，非那西丁，α-萘黄酮，乙腈。
2.实验方法
2.1实验反应体系
反应体系包含非那西丁(0.2μM)，α-萘黄酮(1μM)或化合物(Ⅰ、Ⅱ，10μM)，MLM(0.5mg/mL)，缓冲液(PBS,pH＝7.4)。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式三份。①阳性对照组：同时有α-萘黄酮和非那西丁。②阴性对照组：只有MLM，没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有非那西丁和待测化合物。④空白组：只有非那西丁。
2.2UPLC-ESI-QTOFMS分析
所有微粒体样品的分析在配备有1290四元泵(Agilent,Santa Clara,CA)的Agilent 1290系列UPLC系统上进行，药物代谢物通过XDB-C18柱(2.1×100mm，1.8mm，Agilent,Santa Clara,CA)检测。液体流量0.3mL/min。A相是0.01％甲酸水溶液，B相是含0.01％甲酸的乙腈。洗脱梯度如下：0-12min，2-98％B；12-14min，98％B；14-16min，98％B。柱温45℃。数据采用正离子模式。碰撞气体和干燥气体流量为9L/min。毛细管电压为3.5kv，温度为350℃，雾化器压力为35psi。扫描的目标离子为273.1849和289.1798。
2.3多变量数据分析和统计分析
使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件(Agilent,Santa Clara,CA,USA)进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。
3.实验结果
实验结果如表3所示，结果显示，化合物Ⅰ对CYP1A2酶的抑制率为-24.90％，化合物Ⅱ对CYP1A2酶的抑制率为-18.80％，阳性对照α-萘黄酮对CYP1A2酶的抑制率为42.30％。实施例4考察本发明所述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ抑制CYP1B1酶活性
1.实验材料
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，小鼠肝微粒体(MLM)，β-雌二醇，白藜芦醇，乙腈。
2.实验方法
2.1实验反应体系
反应体系包含β-雌二醇(20μM)，白藜芦醇(10μM)或待测化合物(化合物Ⅰ、Ⅱ10μM)，MLM(0.5mg/mL)，缓冲液(PBS,pH＝7.4)。反应体系孵育后，加入NADPH进行反应，终止反应后离心，取上清液待测。孵育体系一式三份。①阳性对照组：同时有白藜芦醇和雌二醇。②阴性对照组：没有NADPH，用等体积PBS代替。③实验组：同时有雌二醇和待测化合物。④空白组：只有雌二醇。
2.2UPLC-ESI-QTOFMS分析
UPLC-ESI-QTOFMS分析：所有微粒体样品的分析在配备有1290四元泵(Agilent,Santa Clara,CA)的Agilent 1290系列UPLC系统上进行，药物代谢物通过XDB-C18柱(2.1×100mm，1.8mm，Agilent,Santa Clara,CA)检测。液体流量0.3mL/min。A相是0.01％甲酸水溶液，B相是含0.01％甲酸的乙腈。洗脱梯度如下：0-12min，2-98％B；12-14min，98％B；14-16min，98％A。柱温45℃。数据采用正离子模式。碰撞气体和干燥气体流量为9L/min。毛细管电压为3.5kv，温度为350℃，雾化器压力为35psi。扫描的目标离子为273.1849和289.1798。
2.3多变量数据分析和统计分析
使用Mass Hunter Workststion数据软件采集软件(Agilent,Santa Clara,CA,USA)进行色谱和光谱数据分析。所有值均以均值表示，应用Prism v.6进行统计分析。
3.实验结果
实验结果如表3所示，结果显示，化合物Ⅰ对CYP1B1酶的抑制率为14.33％，化合物Ⅱ对CYP1B1酶的抑制率为54.69％，化合物Ⅲ对CYP1B1酶的抑制率为64.75％，阳性对照白藜芦醇对CYP1B1酶的抑制率为41.73％。
上述CYP1系酶活性抑制实验结果显示，化合物Ⅰ的CYP1B1酶抑制率为14.33％，而其CYP1A1和CYP1A2酶抑制率分别为-13.30％、-24.90％，化合物Ⅱ的CYP1B1酶抑制率为54.69％，而其CYP1A1和CYP1A2酶抑制率分别为20.98％、-18.80％，化合物Ⅲ的CYP1B1酶抑制率为64.75％，因此香豆素类化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对CYP1B1具有靶向性，可以选择性抑制CYP1B1酶。
表3化合物抑制CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1酶活性
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Claims (9)
1.一类C-4位取代香豆素类化合物，其特征在于具有如下结构式：
。
2.如权利要求1所述的C-4位取代香豆素类化合物的制备方法，其特征在于以滇南红厚壳干燥茎叶为原料，依次经浸膏提取、MCI脱色、大孔树脂脱色、硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、Sephadex LH-20、薄层制备色谱、HPLC半制备色谱法分离获得，包括如下步骤：
（1）取滇南红厚壳干燥茎叶，粉碎，使用醇或醇的水溶液浸提，浓缩；
（2）将步骤（1）所得的浓缩物用水溶解过滤后，用聚酰胺拌样，经MCI柱层析，先使用体积百分比70%甲醇水溶液洗脱除杂，再依次使用体积百分比85%和95%的甲醇水溶液各洗脱2~5个柱体积，得到相应的两个洗脱组分Fr E和Fr F组分；
（3）将步骤（2）得到的组分Fr F，通过大孔吸附树脂脱色，依次以水，体积百分比95%乙醇水溶液洗脱，得到相应的两个洗脱组分Fr F-1和F-2；
（4）将步骤（3）得到的Fr F-2与步骤（2）得到的Fr E合并，用硅胶拌样，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比400:1、200:1、100:1、50:1、30:1、15:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯为流动相各洗脱2~6个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得到Fr 1~26共26个组分；
（5）将步骤（4）得到的Fr 12组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:1、7:1、5:1、3:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相各洗脱2~6个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 12-1~Fr 12-14组分；
（6）将步骤（5）得到的Fr 12-6与Fr 12-7、Fr 12-8合并后经ODS柱色谱，依次体积比70:30、80:20、90:10、0:100的甲醇-水混合溶剂为流动相各洗脱2~6个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得到Fr 12-6-1~Fr12-6-12组分；
（7）步骤（6）得到的Fr 12-6-10使用硅胶制备薄层色谱分离，以体积比1:2的石油醚-二氯甲烷混合溶剂进行展开，采用TLC监测并刮取主要成分斑点，使用二氯甲烷洗脱硅胶斑点组分，得到权利要求1所述的化合物Ⅱ；
（8）将步骤（4）中得到的Fr 18组分，进行正向硅胶柱层析，依次以体积比100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:1、7:1、5:1、3:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相各洗脱2~6个柱体积，同步TLC检测，合并相同组分后得Fr 18-1~Fr 18-20组分；
（9）将步骤（8）中得到的Fr 18-8、Fr 18-9与Fr 18-10合并，经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以体积比3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂为洗脱剂洗脱1~3个柱体积，采用TLC监测，合并相同组分得到Fr 18-8-1~18-8-3各组分；
（10）步骤（9）中得到的Fr 18-8-1组分，以85%的甲醇-水混合溶剂为流动相，经HPLC色谱等度洗脱得到化合物Ⅲ，流速v = 2 mL/min，检测波长λ = 210 nm，出峰时间tⅤ = 70min。
3.如权利要求2所述的C-4位取代香豆素类化合物的制备方法，其特征在于：
步骤（1）使用体积百分比95%乙醇水溶液冷浸提取，浓缩；
步骤（2）每个梯度洗脱4个柱体积；
步骤（4）每个梯度洗脱4个柱体积；
步骤（5）每个梯度洗脱4个柱体积；
步骤（6）每个梯度洗脱4个柱体积；
步骤（8）每个梯度洗脱4个柱体积；
步骤（9）洗脱2个柱体积。
4.如权利要求1所述C-4位取代香豆素类化合物在制备CYP1 B1酶抑制剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述CYP1B1酶抑制剂为预防或治疗癌症或代谢性疾病的药物。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述癌症为前致癌物/前诱变物经CYP1B1酶代谢激活引起的DNA突变或癌症，或者为CYP1B1酶高表达引起的肿瘤耐药。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述前致癌物/前诱变物选自芳香胺、杂环胺类、多芳环烃、多卤代芳烃类化合物。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述前致癌物/前诱变物选自蒽、芘、菲、萘、二甲基苯并蒽、二噁英、多氯联苯中的一种或几种。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述癌症为乳腺癌或肺癌；所述代谢性疾病选自肥胖、高血压或动脉粥样硬化。
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