JPH05276962A

JPH05276962A - 抗生物質ｒ１０６−ｉの製造法

Info

Publication number: JPH05276962A
Application number: JP4352897A
Authority: JP
Inventors: Yoshio Mogi; 義夫茂木
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1991-12-19
Filing date: 1992-12-14
Publication date: 1993-10-26
Also published as: EP0547484A1

Abstract

(57)【要約】【目的】真菌感染症の治療剤として有用な抗生物質Ｒ１
０６−Ｉを効率よく製造する。【構成】抗生物質Ｒ１０６−Ｉの生産能を有する菌株を
培養する際に、イソロイシンを添加した培地にて培養
し、培養物より抗生物質Ｒ１０６−Ｉを採取する醗酵法
による抗生物質Ｒ１０６−Ｉの製造法。イソロイシン
は、はじめに培地の一部として存在させてもよいし、培
養途中に連続的または間欠的に添加してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、真菌感染症の治療剤と
して有用な抗生物質Ｒ１０６−Ｉの製造法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】従来、下記構造式で示される抗生物質Ｒ
１０６−Ｉの醗酵法による製造法としては、オーレオバ
シディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属に属する
菌株例えばオーレオバシディウム・プルランス（Ａｕｒ
ｅｏｂａｓｉｄｉｕｍｐｕｌｌｕｌａｎｓ）NO.R１０
６株〔微工研条寄第１９３８号（FERM BP −１９３
８）〕を栄養源含有培地で培養し、培養物より抗生物質
Ｒ１０６−Ｉを採取する方法（特開平２−１３８２９６
号「新規抗生物質Ｒ１０６及びその製造方法並びに用
途」や特開平３−２２９９５号「新規抗生物質Ｒ１０
６」）などが知られている。しかし、これらの方法によ
る培養では、抗生物質Ｒ１０６−Ｉを生産する上で満足
のできるものではなかった。

【０００３】

【化１】（式中、ＭｅＶａｌはＮ−メチルバリン、Ｐｈｅはフェ
ニルアラニン、ＭｅＰｈｅはＮ−ルチルフェニルアラニ
ン、Ｐｒｏはプロリン、ａｌｌｏ−Ｉｌｅはアロイソロ
イシン、Ｌｅｕはロイシン、β−ＨＯＭｅＶａｌはβ−
ヒドロキシ−Ｎ−メチルバリンを表す。）

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、さらに効率
のよい抗生物質Ｒ１０６−Ｉの製造法を提供することを
目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗生物質
Ｒ１０６−Ｉ生産能を有するオーレオバシディウム属に
属する微生物を、イソロイシンを添加した栄養培地で培
養し、抗生物質Ｒ１０６−Ｉと分離困難な副産物の生成
を低下させることにより、該培養物中に蓄積した抗生物
質Ｒ１０６−Ｉを効率よく採取することを特徴とする醗
酵法による抗生物質Ｒ１０６−Ｉの製造法を見出し、本
発明を完成するに至った。

【０００６】本発明で用いられる微生物として具体的に
は、例えば前記オーレオバシディウム・プルランス（Ａ
ｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍｐｕｌｌｕｌａｎｓ）NO.R
１０６株〔微工研条寄第１９３８号（FERM BP-１９３
８）〕があげられる。また該菌株の自然的および人工的
変異株はもちろん、オーレオバシディウム属に属する菌
株で抗生物質Ｒ１０６−Ｉの生産能を有する微生物はす
べて本発明において使用することができる。

【０００７】本発明による抗生物質Ｒ１０６−Ｉの生産
は、はじめからイソロイシンを添加した培地で培養する
か途中でイソロイシンを添加する以外は、通常の培養法
で実施可能である。使用培地としては、炭素源、窒素
源、無機物その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を
ほどよく含有する通常の培地である。炭素源としては、
例えばグルコース、フラクトース、シュークロース、マ
ルトース、ラクトース、デキストリン、澱粉、水飴、糖
蜜、グリセリン、油脂類、有機酸類などが用いられる。
窒素源としては、例えば大豆粉、綿実粉、コーンスチー
プリカー、ペプトン、カゼイン、カザミノ酸、酵母エキ
ス、胚芽、肉エキス、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩
などの有機窒素化合物や無機窒素化合物が使用可能であ
る。さらに無機物としてはナトリウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩
類が単独あるいは適宜組み合わせて用いられる。さらに
必要に応じて鉄塩、銅塩、亜鉛塩、マンガン塩、コバル
ト塩などの重金属、ビオチン、ビタミンＢ₁などのビタ
ミン類を適宜添加してもよい。また、シリコーンオイ
ル、ポリアルキレングリコールエーテルなどの界面活性
剤を培地に加えてもよい。

【０００８】培養法としては、微生物の培養により抗生
物質の生産に用いられる一般的方法が採用されるが、液
体培養法、特に振盪または深部通気攪拌培養が最適であ
る。培養温度は通常１５〜３０℃が好ましく、培養ｐＨ
は通常２〜８が好ましい。また培養日数は培養条件によ
って異なるが、通常１〜１４日である。培地に添加する
イソロイシンの量は、抗生物質Ｒ１０６−Ｉ生産株によ
り異なり、また他の培地成分をも考慮して最適量を決定
すべきであるが、通常０．０２〜２．０％濃度になるよ
うに添加するのがよく、好ましくは０．０３〜１．０
％、より好ましくは０．０５〜０．６％濃度になるよう
に添加掏るのがよい。またイソロイシンの添加時期は、
抗生物質Ｒ１０６−Ｉの培養開始時に培地の一部として
存在させてもよいし、培養中連続的または間欠的に添加
してもよい。培養中、グルコースやマルトースあるいは
シュークロースなどの炭素源またはペプトンや酵母エキ
スなどの窒素源を添加する場合、これに伴って添加して
もよい。

【０００９】培養終了後、培養物中に蓄積された抗生物
質Ｒ１０６−Ｉを培養物から採取するには抗生物質Ｒ１
０６−Ｉの理化学的性質を利用することにより行う。即
ち、抗生物質Ｒ１０６−Ｉは菌体及び培養濾液中に含ま
れるので培養物を非親水性有機溶媒、たとえばクロロホ
ルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、メチルイ
ソブチルケトンなどの有機溶媒で抽出することにより分
離し、採取することができる。また培養物を遠心分離ま
たは濾過により培養菌体と濾液とに分離してから抗生物
質Ｒ１０６−Ｉを抽出採取することもできる。培養濾液
から抗生物質Ｒ１０６−Ｉを分離採取するには、前記の
非親水性有機溶媒で抽出してもよい。また培養濾液を活
性炭、粉末セルロース、吸着性樹脂などの担体に吸着さ
せ、次いで適宜の溶媒で溶出することもできる。これら
の担体から抗生物質Ｒ１０６−Ｉを溶出するためには、
水溶性有機溶剤例えば含水アルコールや含水アセトンな
どで溶出することもできる。菌体からの抗生物質Ｒ１０
６−Ｉの分離採取はアセトン、エタノールなどの親水性
有機溶媒で抽出し、脂溶性抗生物質の通常知られた分離
精製法を用い、さらに精製することができる。例えばシ
リカゲル、活性アルミナ、吸着性樹脂などの担体を用い
るカラムクロマトグラフィーによる方法である。担体と
してシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーで
は、溶出溶媒としてクロロホルム、酢酸エチル、アセト
ン、メタノール、水などを単独あるいは適宜組み合わせ
た混合溶媒を用いて溶出することができる。また高速液
体クロマトグラフィーによる分離精製も有利に利用でき
る。用いる担体としてはシリカゲル、オクタデシル基、
アミノ基、オクチル基、などが結合した化学結合型シリ
カゲル、またはポリスチレン系ポーラスポリマーゲルな
どを用いる。移動層としてはヘキサン、イソプロピルア
ルコール、含水メタノール、含水アセトニトリルなどを
用いて溶出することができる。また液相間の分配に基づ
く分離、精製法である交流分配法も有利に利用できる。
分配液系としてはヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリ
ル系、クロロホルム−メタノール−水系などの混合溶媒
を用いることができる。

【００１０】

【実施例】以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

【００１１】実施例１ NO.R１０６株〔微工研条寄第１９３８号（FERM BP-１９
３８）〕の斜面培養から一白金耳を１００ｍｌの液体培
地（ディフコイーストナイトロジェンベース０．６７％
（Ｗ／Ｖ）、グルコース２．０％（Ｗ／Ｖ））を入れた
５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２７℃で２日
間、振盪し、種培養液を得た。この種培養液１．０ｍｌ
を、Ｌ−イソロイシンを０．１％濃度になるように添加
した１００ｍｌの液体培地Ａ（グルコース２％、硫酸ア
ンモニウム０．５％、リン酸第１カリウム０．１５％、
硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、塩化ナトリウム
０．０１％、塩化カルシウム０．０１％（以上の濃度は
すべてＷ／Ｖ）、塩化第二鉄０．５μｇ／ｍｌ、硫酸亜
鉛０．５μｇ／ｍｌ）を入れた５００ｍｌ容の三角フラ
スコに接種し、２５℃で３日間、２１０ｒｐｍのロータ
リーシェーカー上で振盪培養を行った。この培養液にさ
らに２０ｍｌの添加用液体培地Ｂ（グルコース１０％、
硫酸アンモニウム２．５％、ポリペプトン５％、リン酸
第１カリウム０．７５％、硫酸マグネシウム７水和物
０．２５％、塩化カルシウム０．０５％、塩化ナトリウ
ム０．０５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ）、塩化第
二鉄２．５μｇ／ｍｌ、硫酸亜鉛２．５μｇ／ｍｌ）を
添加後、さらに４日間、２１０ｒｐｍのロータリーシェ
ーカー上で振盪培養を行った。

【００１２】このようにして得た培養液を５リットル集
め遠心分離し、上澄と菌体に分離した。得られた菌体に
エタノール１リットルを加え、抽出操作を行った。エタ
ノール抽出液を減圧濃縮し、エタノールを留去後、酢酸
エチル０．３リットルで２回抽出した。抽出液を減圧濃
縮、乾固させた後、残渣をクロロホルムに溶解した。こ
のクロロホルム溶液をあらかじめヘキサンで飽和、調製
したシリカゲルカラム３００ｍｌ上に注入し、ヘキサン
６００ｍｌで洗浄後、ヘキサン−イソプロパノール
（７：３）１．２リットルで展開、溶出した。溶出され
た活性画分を減圧濃縮し、得られた残渣を２０ｍｌのア
セトリトリルに溶かし１０回にわけ分取用高速液体クロ
マトグラフィー〔カラム：ソーケンパックＣ₁₈（綜研化
学製）２ｃｍ×５０ｃｍ、移動相：７０％（Ｖ／Ｖ）ア
セトニトリル水〕に付し、９５％以上の活性画分を得
た。この画分をさらに減圧濃縮することにより抗生物質
Ｒ１０６−Ｉの白色粉末０．８ｇを得た。

【００１３】実施例２実施例１と同様に調製したNO.R１０６株の種培養液１．
０ｍｌを１００ｍｌの液体培地Ａに接種し、２５℃、２
１０ｒｐｍのロータリーシェーカー上で振盪培養を行っ
た。この培養液に実施例１と同様に２０ｍｌの添加用液
体培地Ｂを添加し、さらに、１．０％のＬ−イソロイシ
ン溶液を培養３日目、４日目、５日目に各々、５ｍｌ添
加し、培養５日目よりさらに２日間、２１０ｒｐｍのロ
ータリーシェーカー上で振盪培養を行った。

【００１４】このようにして得られた培養液を５リット
ル集め実施例１と同様な分離、精製操作を実施したとこ
ろ、活性画分である抗生物質Ｒ１０６−Ｉの白色粉末
０．９ｇを得た。

【００１５】参考例１実施例１と同様に調製したNO.R１０６株の種培養液１．
０ｍｌをＬ−イソロイシンを添加しない１００ｍｌの液
体培地Ａに接種し、２５℃で３日間、２１０ｒｐｍのロ
ータリーシェーカー上で振盪培養を行った。この培養液
にさらに２０ｍｌの添加用液体培地Ｂを添加後、さらに
２５℃で４日間、２１０ｒｐｍのロータリーシェーカー
上で振盪培養を行った。このようにして得られた培養液
５リットルを実施例１と同様な分離、精製操作を行い、
活性画分である抗生物質Ｒ１０６−Ｉの白色粉末０．５
ｇを得た。

【００１６】Ｌ−イソロイシンを添加した培地による実
施例１、実施例２の採取量と対照として参考例１の採取
量を表１に示した。

【００１７】

【表１】表１ R106-1 採取量（ｇ）（純度９５％以上） ────────────────────── 実施例１０．８実施例２０．９参考例１０．５ ──────────────────────

【００１８】表１から明らかなように、本発明は対照に
比較して優れた製造法であることを示した。

【００１９】

【発明の効果】本発明によれば、真菌感染症の治療剤と
して有用な抗生物質Ｒ１０６−Ｉを、より効率的に製造
できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】オーレオバシディウム属に属し、抗生物
質Ｒ１０６−Ｉ生産能を有する菌株をイソロイシンを添
加した培地にて培養し、培養物より抗生物質Ｒ１０６−
Ｉを採取することを特徴とする醗酵法による抗生物質Ｒ
１０６−Ｉの製造法。