JPH06225793A - 6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオンの新規製造法 - Google Patents
6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオンの新規製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】マイロセシウム属に属し、4−アンドロステン
−3,17−ジオンを水酸化し、6β,14α−ジヒド
ロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオンを生産
する能力を有する微生物を4−アンドロステン−3,1
7−ジオンを含む培地にて培養し、培養物より6β,1
4α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−
ジオンを採取することを特徴とする。 【効果】本発明の方法を用いることにより、6β,14
α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジ
オン及び14α−ヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,6,17−トリオンを高収率で製造することができ
る。
−3,17−ジオンを水酸化し、6β,14α−ジヒド
ロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオンを生産
する能力を有する微生物を4−アンドロステン−3,1
7−ジオンを含む培地にて培養し、培養物より6β,1
4α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−
ジオンを採取することを特徴とする。 【効果】本発明の方法を用いることにより、6β,14
α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジ
オン及び14α−ヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,6,17−トリオンを高収率で製造することができ
る。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、アンドロジェン活性、
アロマテース活性阻害作用、ヒト乳癌細胞に対する細胞
増殖阻害作用等を有することが知られているアンドロス
テン誘導体、6β, 14α −ジヒドロキシ−4−アン
ドロステン−3,17−ジオン及び14α−ヒドロキシ
−4−アンドロステン−3,6,17−トリオンの新規
製造法に関する。
アロマテース活性阻害作用、ヒト乳癌細胞に対する細胞
増殖阻害作用等を有することが知られているアンドロス
テン誘導体、6β, 14α −ジヒドロキシ−4−アン
ドロステン−3,17−ジオン及び14α−ヒドロキシ
−4−アンドロステン−3,6,17−トリオンの新規
製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】従来、下記構造式で示される6β, 14
α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジ
オンの製造法としては、アクレモニウム(Acremo
nium)属に属する菌株、例えばアクレモニウム・ス
トリクタム(Acremonium strictu
m)を栄養源含有培地で培養し、培養物より 6β, 1
4α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−
ジオンを採取する方法(特開昭63−192796号
「6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,17−ジオン」)が知られている。しかし、この方
法によると、6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンド
ロステン−3,17−ジオンの収量が低く、同時に生成
する副生成物の為精製収率が低い等の問題がある。
α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジ
オンの製造法としては、アクレモニウム(Acremo
nium)属に属する菌株、例えばアクレモニウム・ス
トリクタム(Acremonium strictu
m)を栄養源含有培地で培養し、培養物より 6β, 1
4α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−
ジオンを採取する方法(特開昭63−192796号
「6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,17−ジオン」)が知られている。しかし、この方
法によると、6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンド
ロステン−3,17−ジオンの収量が低く、同時に生成
する副生成物の為精製収率が低い等の問題がある。
【0003】
【化1】
【0004】また、アクレモニウム(Acremonium) 属に
属する特定の菌株、アクレモニウム・ストリクタム(Ac
remonium Strictum)(前述)を栄養源含有培地で培養
し、培養物より採取した6β,14α−ジヒドロキシ−
4−アンドロステン−3,17−ジオンを酸化して、制
癌剤として開発が期待されている14α−ヒドロキシ−
4−アンドロステン−3,6,17−トリオンとするこ
とが知られている。(特公平1−32236)。しか
し、この方法によっても、14α−ヒドロキシ−4−ア
ンドロステン−3,6,17−トリオンの収量が低い問
題がある。
属する特定の菌株、アクレモニウム・ストリクタム(Ac
remonium Strictum)(前述)を栄養源含有培地で培養
し、培養物より採取した6β,14α−ジヒドロキシ−
4−アンドロステン−3,17−ジオンを酸化して、制
癌剤として開発が期待されている14α−ヒドロキシ−
4−アンドロステン−3,6,17−トリオンとするこ
とが知られている。(特公平1−32236)。しか
し、この方法によっても、14α−ヒドロキシ−4−ア
ンドロステン−3,6,17−トリオンの収量が低い問
題がある。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題を
改善し、さらに効率のよい6β, 14α−ジヒドロキシ
−4−アンドロステン−3,17−ジオン及び14α−
ヒドロキシ−4−アンドロステン−3,6,17−トリ
オンの製造法を提供することを課題とする。
改善し、さらに効率のよい6β, 14α−ジヒドロキシ
−4−アンドロステン−3,17−ジオン及び14α−
ヒドロキシ−4−アンドロステン−3,6,17−トリ
オンの製造法を提供することを課題とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率の良
い6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,17−ジオンの製造法を目的として多数の微生物を
土壌中より分離し、その生成効率を調べたところ、マイ
ロセシウム(Myrothecium)属に属する微生
物が、副生物の生成も少なく,効率良く6β, 14α−
ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオン
を生産していることを見出した。
い6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,17−ジオンの製造法を目的として多数の微生物を
土壌中より分離し、その生成効率を調べたところ、マイ
ロセシウム(Myrothecium)属に属する微生
物が、副生物の生成も少なく,効率良く6β, 14α−
ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオン
を生産していることを見出した。
【0007】本発明を概説すれば、本発明の第1の発明
は、マイロセシウム(Myrothecium)属に属
し、4−アンドロステン−3,17−ジオンを水酸化し
6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,17−ジオンを生成する能力を有する微生物を4−
アンドロステン−3,17−ジオンを含有する培地にて
培養し、培養物より6β, 14α−ジヒドロキシ−4−
アンドロステン−3,17−ジオンを採取することを特
徴とする。
は、マイロセシウム(Myrothecium)属に属
し、4−アンドロステン−3,17−ジオンを水酸化し
6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,17−ジオンを生成する能力を有する微生物を4−
アンドロステン−3,17−ジオンを含有する培地にて
培養し、培養物より6β, 14α−ジヒドロキシ−4−
アンドロステン−3,17−ジオンを採取することを特
徴とする。
【0008】また、本発明の第2の発明は、マイロセシ
ウム(Myrothecium)属に属し、4−アンド
ロステン−3,17−ジオンを水酸化し、6β, 14α
−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオ
ンを生成する能力を有する微生物に関する。
ウム(Myrothecium)属に属し、4−アンド
ロステン−3,17−ジオンを水酸化し、6β, 14α
−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオ
ンを生成する能力を有する微生物に関する。
【0009】また、本発明の第3の発明は、4−アンド
ロステン−3,17−ジオンを、微生物で、水酸化し、
6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,17−ジオンとした後、酸化して14α−ヒドロキ
シ−4−アンドロステン−3,6,17−トリオンを製
造する方法において、マイロセシウム(Myrothe
cium)属に属し、4−アンドロステン−3,17−
ジオンを水酸化し6β,14α−ジヒドロキシ−4−ア
ンドロステン−3,17−ジオンを生成する能力を有す
る微生物を4−アンドロステン−3,17−ジオンを含
有する培地にて培養し、培養物より6β,14α−ジヒ
ドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオンを採
取する工程を含むことを特徴とする14α−ヒドロキシ
−4−アンドロステン−3,6,17−トリオンの製造
方法に関する。
ロステン−3,17−ジオンを、微生物で、水酸化し、
6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−
3,17−ジオンとした後、酸化して14α−ヒドロキ
シ−4−アンドロステン−3,6,17−トリオンを製
造する方法において、マイロセシウム(Myrothe
cium)属に属し、4−アンドロステン−3,17−
ジオンを水酸化し6β,14α−ジヒドロキシ−4−ア
ンドロステン−3,17−ジオンを生成する能力を有す
る微生物を4−アンドロステン−3,17−ジオンを含
有する培地にて培養し、培養物より6β,14α−ジヒ
ドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオンを採
取する工程を含むことを特徴とする14α−ヒドロキシ
−4−アンドロステン−3,6,17−トリオンの製造
方法に関する。
【0010】前記培養物から培養生産物を単離し、理化
学的性質を調べた結果、6β, 14α−ジヒドロキシ−
4−アンドロステン−3,17−ジオンの標準品と一致
した。
学的性質を調べた結果、6β, 14α−ジヒドロキシ−
4−アンドロステン−3,17−ジオンの標準品と一致
した。
【0011】即ち培養生産物の理化学的性質は次の通り
である。 外観 白色粉末 分子量 318 分子式 C19H26O4 融点 256〜257 ℃ 紫外部吸収スペクトル 極大吸収 236 nm(中性、メ
タノール中) E1マススペクトル m/z=318 赤外吸収スペクトル (KBr 法)3460,2960,1748,168
2,1650cm-1
である。 外観 白色粉末 分子量 318 分子式 C19H26O4 融点 256〜257 ℃ 紫外部吸収スペクトル 極大吸収 236 nm(中性、メ
タノール中) E1マススペクトル m/z=318 赤外吸収スペクトル (KBr 法)3460,2960,1748,168
2,1650cm-1
【0012】プロトン核磁気共鳴スペクトル(CDC
l3 ) δppm;18−H:1.08(3H,s) 19−H:1.42(3H,s) 6−H:4.49(1H,t) 4−H:5.83(1H,s)13 C−核磁気共鳴スペクトル(CDCl3 ) δppm;C−1:34.3,C−2:32.6, C−3:200.4,C−4:126.8, C−5:167.4,C−6:73.0, C−7:37.3,C−8:32.6, C−9:47.0,C−10:38.5, C−11:19.4,C−12:24.7, C−13:52.9,C−14:80.5, C−15:30.3,C−16:33.0, C−17:218.2,C−18:18.0 C−19:19.6
l3 ) δppm;18−H:1.08(3H,s) 19−H:1.42(3H,s) 6−H:4.49(1H,t) 4−H:5.83(1H,s)13 C−核磁気共鳴スペクトル(CDCl3 ) δppm;C−1:34.3,C−2:32.6, C−3:200.4,C−4:126.8, C−5:167.4,C−6:73.0, C−7:37.3,C−8:32.6, C−9:47.0,C−10:38.5, C−11:19.4,C−12:24.7, C−13:52.9,C−14:80.5, C−15:30.3,C−16:33.0, C−17:218.2,C−18:18.0 C−19:19.6
【0013】本発明で用いられる微生物として具体的に
は、例えば前記マイロセシウム(Myrotheciu
m)sp.NK−928521株〔微工研菌寄第132
34号(FERM P- 13234)〕があげられる。また該
菌株の自然的および人工的変異株を含め、マイロセシウ
ム(Myrothecium)属に属する菌株で4−ア
ンドロステン−3,17−ジオンを水酸化し6β, 14
α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジ
オンを生成する能力を有する微生物はすべて本発明にお
いて使用することができる。人工的変異株は、紫外線の
照射など通常行う方法で得ることができる。
は、例えば前記マイロセシウム(Myrotheciu
m)sp.NK−928521株〔微工研菌寄第132
34号(FERM P- 13234)〕があげられる。また該
菌株の自然的および人工的変異株を含め、マイロセシウ
ム(Myrothecium)属に属する菌株で4−ア
ンドロステン−3,17−ジオンを水酸化し6β, 14
α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジ
オンを生成する能力を有する微生物はすべて本発明にお
いて使用することができる。人工的変異株は、紫外線の
照射など通常行う方法で得ることができる。
【0014】NK−928521株は次の菌学的性質を
有する。 (1)各種培地における生育状態 各種寒天培地におけるNK−928521株の生育状態
は下表のとおりである。観察は25℃で14日後に行っ
た。
有する。 (1)各種培地における生育状態 各種寒天培地におけるNK−928521株の生育状態
は下表のとおりである。観察は25℃で14日後に行っ
た。
【0015】
【表1】
【0016】本菌は、コーンミール寒天培地上で分生子
形成細胞は、散在または白色の周辺部を伴った淡オリー
ブ〜黒緑色の分生子座に集まる。培地上での分生子形成
には3〜4週間要する。菌糸は、無色、滑面、薄壁、隔
壁があり、幅は2.0〜3.0μm。分生子座は、無色
の細胞の薄い層からなる。周縁菌糸は、ねじれて分岐し
ており、無色、滑面、隔壁がある。
形成細胞は、散在または白色の周辺部を伴った淡オリー
ブ〜黒緑色の分生子座に集まる。培地上での分生子形成
には3〜4週間要する。菌糸は、無色、滑面、薄壁、隔
壁があり、幅は2.0〜3.0μm。分生子座は、無色
の細胞の薄い層からなる。周縁菌糸は、ねじれて分岐し
ており、無色、滑面、隔壁がある。
【0017】分生子柄は、薄い子座層から形成され、繰
り返し分岐し、それぞれの分岐部で2〜4本の分岐を生
じ、最後の分岐上にフィアライドを着生する。無色、隔
壁があり、細胞の大きさは7.0〜15.0×2.0〜
3.0μm。フィアライドは、2〜6本輪生、互いに密
着して平行した層となる。円柱形(8.0〜16.0×
2.0〜3.0μm)、無色、分生子形成部周辺が暗色
となる。
り返し分岐し、それぞれの分岐部で2〜4本の分岐を生
じ、最後の分岐上にフィアライドを着生する。無色、隔
壁があり、細胞の大きさは7.0〜15.0×2.0〜
3.0μm。フィアライドは、2〜6本輪生、互いに密
着して平行した層となる。円柱形(8.0〜16.0×
2.0〜3.0μm)、無色、分生子形成部周辺が暗色
となる。
【0018】分生子は、舟形〜紡錘形〜レモン形(5.
0〜7.0×2.1〜4.0μm)、基部は突き出て裁
断状、オリーブ褐色、表面は平滑、多くは子座上に粘塊
となって集まる。
0〜7.0×2.1〜4.0μm)、基部は突き出て裁
断状、オリーブ褐色、表面は平滑、多くは子座上に粘塊
となって集まる。
【0019】(2)生理学的性質 至適生育温度は25℃前後で、10〜33℃で生育し、
好ましい生育温度は20〜30℃、37℃では生育しな
い。至適生育pHは、6.0前後で、4.0〜8.0で
生育する。
好ましい生育温度は20〜30℃、37℃では生育しな
い。至適生育pHは、6.0前後で、4.0〜8.0で
生育する。
【0020】以上の各種菌学的性質より本菌は、Ain
sworth,G.C.:Ainsworth and
Bisby’s Dictionary of th
eFungi,7th ed.(by Hawkswo
rth,Sutton,and Ainswort
h),CMI,Kew(1983)に従い、真菌門、不
完全菌亜門、不完全糸状菌綱のマイロセシウム(Myr
othecium)に属する一菌株であることが明らか
になり本菌株をマイロセシウム(Myrotheciu
m)sp.NK−928521株と命名した。
sworth,G.C.:Ainsworth and
Bisby’s Dictionary of th
eFungi,7th ed.(by Hawkswo
rth,Sutton,and Ainswort
h),CMI,Kew(1983)に従い、真菌門、不
完全菌亜門、不完全糸状菌綱のマイロセシウム(Myr
othecium)に属する一菌株であることが明らか
になり本菌株をマイロセシウム(Myrotheciu
m)sp.NK−928521株と命名した。
【0021】本発明による6β, 14α−ジヒドロキシ
−4−アンドロステン−3,17−ジオンの生産は、炭
素源、窒素源、無機物その他使用菌株の必要とする微量
の栄養素をほどよく含有する通常の培地に基質となる4
−アンドロステン−3,17−ジオンを添加し培養す
る。炭素源としては、グリセリンの他に、例えばグルコ
ース、フラクトース、シュークロース、マルトース、ラ
クトース、デキストリン、澱粉、水飴、糖蜜、油脂類、
有機酸類などを用いることができる。好ましくは、シュ
ークロ−スがよい。
−4−アンドロステン−3,17−ジオンの生産は、炭
素源、窒素源、無機物その他使用菌株の必要とする微量
の栄養素をほどよく含有する通常の培地に基質となる4
−アンドロステン−3,17−ジオンを添加し培養す
る。炭素源としては、グリセリンの他に、例えばグルコ
ース、フラクトース、シュークロース、マルトース、ラ
クトース、デキストリン、澱粉、水飴、糖蜜、油脂類、
有機酸類などを用いることができる。好ましくは、シュ
ークロ−スがよい。
【0022】窒素源としては、例えば大豆粉(ソイビー
ンミール)、綿実粉、コーンスチープリカー(C.S.
L.)、ペプトン、カゼイン、カザミノ酸、酵母エキ
ス、胚芽、肉エキス、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩
などの有機窒素化合物や無機窒素化合物が使用可能であ
り好ましくはソイビーンミールやC.S.L.がよい。
さらに無機物としてはナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類が
単独あるいは適宜組み合わせて用いられる。
ンミール)、綿実粉、コーンスチープリカー(C.S.
L.)、ペプトン、カゼイン、カザミノ酸、酵母エキ
ス、胚芽、肉エキス、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩
などの有機窒素化合物や無機窒素化合物が使用可能であ
り好ましくはソイビーンミールやC.S.L.がよい。
さらに無機物としてはナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類が
単独あるいは適宜組み合わせて用いられる。
【0023】さらに必要に応じて鉄塩、銅塩、亜鉛塩、
マンガン塩、コバルト塩などの重金属、ビオチン、ビタ
ミンB1 などのビタミン類を適宜添加してもよい。ま
た、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエー
テルなどの界面活性剤を培地に加えてもよい。
マンガン塩、コバルト塩などの重金属、ビオチン、ビタ
ミンB1 などのビタミン類を適宜添加してもよい。ま
た、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエー
テルなどの界面活性剤を培地に加えてもよい。
【0024】培養法としては、微生物の培養に用いられ
る一般的方法が採用されるが、液体培養法、特に振盪ま
たは深部通気攪拌培養が最適である。培養温度は通常1
0〜33℃であり、好ましくは20〜30℃である。培
養pHは通常2〜8が好ましく、より好ましくは4〜7
である。
る一般的方法が採用されるが、液体培養法、特に振盪ま
たは深部通気攪拌培養が最適である。培養温度は通常1
0〜33℃であり、好ましくは20〜30℃である。培
養pHは通常2〜8が好ましく、より好ましくは4〜7
である。
【0025】また培養日数は培養条件によって異なる
が、通常1〜10日である。培地中の4−アンドロステ
ン−3,17−ジオン濃度は、通常0.02〜2.0%
濃度(w/v)好ましくは0.1〜1.5%(w/v)になるよ
うに添加するのがよい。
が、通常1〜10日である。培地中の4−アンドロステ
ン−3,17−ジオン濃度は、通常0.02〜2.0%
濃度(w/v)好ましくは0.1〜1.5%(w/v)になるよ
うに添加するのがよい。
【0026】また4−アンドロステン−3,17−ジオ
ンの添加時期は、培養開始時に培地の一部として存在さ
せてもよいし、培養中連続的または間欠的に添加しても
よい。培養中、グルコースやマルトースあるいはシュー
クロースなどの炭素源またはペプトンや酵母エキスなど
の窒素源を添加する場合、これに伴って添加してもよ
い。
ンの添加時期は、培養開始時に培地の一部として存在さ
せてもよいし、培養中連続的または間欠的に添加しても
よい。培養中、グルコースやマルトースあるいはシュー
クロースなどの炭素源またはペプトンや酵母エキスなど
の窒素源を添加する場合、これに伴って添加してもよ
い。
【0027】培養終了後、培養物中に蓄積された6β,
14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17
−ジオンを培養物中から採取する為には本物質の理化学
的性質を利用することにより行う。
14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17
−ジオンを培養物中から採取する為には本物質の理化学
的性質を利用することにより行う。
【0028】即ち、6β, 14α−ジヒドロキシ−4−
アンドロステン−3,17−ジオンは菌体を含む不溶性
画分及び培養濾液中に含まれるので培養物を遠心分離ま
たは濾過により培養菌体を含む不溶性画分と濾液とに分
離してから6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロ
ステン−3,17−ジオンを抽出採取することができ
る。
アンドロステン−3,17−ジオンは菌体を含む不溶性
画分及び培養濾液中に含まれるので培養物を遠心分離ま
たは濾過により培養菌体を含む不溶性画分と濾液とに分
離してから6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロ
ステン−3,17−ジオンを抽出採取することができ
る。
【0029】また、培養物を直接非親水性有機溶媒、た
とえばクロロホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノ
ール、メチルイソブチルケトンなどの有機溶媒で抽出す
ることにより分離し、採取することもできる。
とえばクロロホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノ
ール、メチルイソブチルケトンなどの有機溶媒で抽出す
ることにより分離し、採取することもできる。
【0030】培養濾液から6β, 14α−ジヒドロキシ
−4−アンドロステン−3,17−ジオンを分離採取す
るには、培養濾液を活性炭、粉末セルロース、吸着樹脂
例えばポリスチレン系ポーラスポリマーゲル、メタアク
リル酸エステル系ポーラスポリマーゲル、ポリビニルア
ルコールを球状の多孔質ゲルにしたもの、アクリルエス
テル系ポーラスポリマーゲルなどの担体に吸着させ、次
いで適宜の溶媒で溶出することができる。
−4−アンドロステン−3,17−ジオンを分離採取す
るには、培養濾液を活性炭、粉末セルロース、吸着樹脂
例えばポリスチレン系ポーラスポリマーゲル、メタアク
リル酸エステル系ポーラスポリマーゲル、ポリビニルア
ルコールを球状の多孔質ゲルにしたもの、アクリルエス
テル系ポーラスポリマーゲルなどの担体に吸着させ、次
いで適宜の溶媒で溶出することができる。
【0031】これらの担体から6β, 14α−ジヒドロ
キシ−4−アンドロステン−3,17−ジオンを溶出す
るためには、水溶性有機溶剤例えば含水アルコールや含
水アセトンなどで溶出することができる。必要に応じて
カラムクロマトグラフィーによる精製を行なってもよ
い。
キシ−4−アンドロステン−3,17−ジオンを溶出す
るためには、水溶性有機溶剤例えば含水アルコールや含
水アセトンなどで溶出することができる。必要に応じて
カラムクロマトグラフィーによる精製を行なってもよ
い。
【0032】培養菌体を含む不溶性画分からの6β, 1
4α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−
ジオンの分離採取は該不溶性画分からアセトン、エタノ
ールなどの親水性有機溶媒で目的化合物を抽出し、ステ
ロイド類の通常知られた分離精製法を用い、さらに精製
することができる。例えばシリカゲル、活性アルミナ、
吸着樹脂などの担体を用いるカラムクロマトグラフィー
による方法である。
4α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−
ジオンの分離採取は該不溶性画分からアセトン、エタノ
ールなどの親水性有機溶媒で目的化合物を抽出し、ステ
ロイド類の通常知られた分離精製法を用い、さらに精製
することができる。例えばシリカゲル、活性アルミナ、
吸着樹脂などの担体を用いるカラムクロマトグラフィー
による方法である。
【0033】担体としてシリカゲルを用いたカラムクロ
マトグラフィーでは、溶出溶媒としてクロロホルム、酢
酸エチル、アセトン、メタノール、水などを単独あるい
は適宜組み合わせた混合溶媒を用いて溶出することがで
きる。また高速液体クロマトグラフィーによる分離精製
も有利に利用できる。用いる担体としてはシリカゲル、
オクタデシル基、アミノ基、オクチル基、などが結合し
た化学結合型シリカゲル、またはポリスチレン系ポーラ
スポリマーゲルなどの吸着樹脂を用いる。
マトグラフィーでは、溶出溶媒としてクロロホルム、酢
酸エチル、アセトン、メタノール、水などを単独あるい
は適宜組み合わせた混合溶媒を用いて溶出することがで
きる。また高速液体クロマトグラフィーによる分離精製
も有利に利用できる。用いる担体としてはシリカゲル、
オクタデシル基、アミノ基、オクチル基、などが結合し
た化学結合型シリカゲル、またはポリスチレン系ポーラ
スポリマーゲルなどの吸着樹脂を用いる。
【0034】移動層としてはヘキサン、イソプロピルア
ルコール、含水メタノール、含水アセトニトリルなどを
用いて溶出することができる。また液相間の分配に基づ
く分離、精製法である交流分配法も有利に利用できる。
分配液系としてはヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリ
ル系、クロロホルム−メタノール−水系などの混合溶媒
を用いることができる。所望により、脱色用に使用され
るハイポーラス樹脂などの吸着樹脂や活性炭などで、菌
体ろ液やクロマトグラフィー溶出液を処理して脱色して
もよい。
ルコール、含水メタノール、含水アセトニトリルなどを
用いて溶出することができる。また液相間の分配に基づ
く分離、精製法である交流分配法も有利に利用できる。
分配液系としてはヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリ
ル系、クロロホルム−メタノール−水系などの混合溶媒
を用いることができる。所望により、脱色用に使用され
るハイポーラス樹脂などの吸着樹脂や活性炭などで、菌
体ろ液やクロマトグラフィー溶出液を処理して脱色して
もよい。
【0035】このようにして得られた、6β,14α−
ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオン
を酸化して、14α−ヒドロキシ−4−アンドロステン
−3,6,17−トリオンを製造するには、特公平1−
32236号に記載の方法もしくはこれに準じて行えば
よい。すなわち、6β,14α−ジヒドロキシ−4−ア
ンドロステン−3,17−ジオンをクロロホルムに溶解
し、活性二酸化マンガン等の酸化剤を加えて反応を行
い、反応終了後、反応混合物をろ過して酸化剤を除去
し、十分洗浄した後、溶媒を除去して、粗精製品を得
る。次いで、この粗精製品を少量のクロロホルム又はメ
タノールで溶解し、シリカゲルカラム及び溶出溶媒(ク
ロロホルム:メタノール=98:2)を用い、高速液体
クロマトグラフィに付して14−α−ヒドロキシ−4−
アンドロステン−3,6,17−トリオンを溶出、分取
する。
ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオン
を酸化して、14α−ヒドロキシ−4−アンドロステン
−3,6,17−トリオンを製造するには、特公平1−
32236号に記載の方法もしくはこれに準じて行えば
よい。すなわち、6β,14α−ジヒドロキシ−4−ア
ンドロステン−3,17−ジオンをクロロホルムに溶解
し、活性二酸化マンガン等の酸化剤を加えて反応を行
い、反応終了後、反応混合物をろ過して酸化剤を除去
し、十分洗浄した後、溶媒を除去して、粗精製品を得
る。次いで、この粗精製品を少量のクロロホルム又はメ
タノールで溶解し、シリカゲルカラム及び溶出溶媒(ク
ロロホルム:メタノール=98:2)を用い、高速液体
クロマトグラフィに付して14−α−ヒドロキシ−4−
アンドロステン−3,6,17−トリオンを溶出、分取
する。
【0036】
【実施例】以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【0037】実施例1 NK−928521株〔微工研菌寄第13234号(FE
RM P- 13234)〕の斜面培養から一白金耳を100
mlの液体培地(Malt ext.3.0%、ポリペ
プトン2.0%、ソイビーンミール(Soybean
meal)1.0%、KH2 PO4 0.5%、MgSO
4 7H2 O0.5%(以上の濃度はすべてW/V))を
入れた500ml容の三角フラスコに接種し、27℃で
3日間、振盪し、一次種培養液を得た。この種培養液全
量を20Lの液体培地A(砂糖5%、C.S.L.2.
0%、ソイビーンミール(Soybean meal)
1.0%、KH2 PO4 0.5%、MgSO4 7H2 O
0.5%(以上の濃度はすべてW/V))を入れた30
L容のジャーファメンターに接種し、27℃で3日間、
通気攪拌培養を行い、二次種培養液を得た。
RM P- 13234)〕の斜面培養から一白金耳を100
mlの液体培地(Malt ext.3.0%、ポリペ
プトン2.0%、ソイビーンミール(Soybean
meal)1.0%、KH2 PO4 0.5%、MgSO
4 7H2 O0.5%(以上の濃度はすべてW/V))を
入れた500ml容の三角フラスコに接種し、27℃で
3日間、振盪し、一次種培養液を得た。この種培養液全
量を20Lの液体培地A(砂糖5%、C.S.L.2.
0%、ソイビーンミール(Soybean meal)
1.0%、KH2 PO4 0.5%、MgSO4 7H2 O
0.5%(以上の濃度はすべてW/V))を入れた30
L容のジャーファメンターに接種し、27℃で3日間、
通気攪拌培養を行い、二次種培養液を得た。
【0038】この種培養液0.6Lを20Lの液体培地
B(砂糖10%、C.S.L.2.0%、ソイビーンミ
ール(Soybean meal)1.0%、KH2 P
O4 0.5%、MgSO4 7H2 O0.5%、4−アン
ドロステン−3,17−ジオン0.75%(以上の濃度
はすべてW/V))を入れた30L容のジャーファメン
ターに接種し、27℃で5日間、通気攪拌培養を行っ
た。
B(砂糖10%、C.S.L.2.0%、ソイビーンミ
ール(Soybean meal)1.0%、KH2 P
O4 0.5%、MgSO4 7H2 O0.5%、4−アン
ドロステン−3,17−ジオン0.75%(以上の濃度
はすべてW/V))を入れた30L容のジャーファメン
ターに接種し、27℃で5日間、通気攪拌培養を行っ
た。
【0039】このようにして得た培養液2リットルを水
2リットルで希釈し、濾過助剤3.0%を添加し、予め
硅そう土を敷き詰めたヌッチェで濾過し、上澄と菌体に
分離した。得られた濾液をダイヤイオンHP−20(商
品名)吸着樹脂に通液し6β, 14α−ジヒドロキシ−
4−アンドロステン−3,17−ジオンを吸着させ、6
0%メタノールで溶出を行った。溶出液を減圧濃縮し、
析出した結晶を濾過で集めた。
2リットルで希釈し、濾過助剤3.0%を添加し、予め
硅そう土を敷き詰めたヌッチェで濾過し、上澄と菌体に
分離した。得られた濾液をダイヤイオンHP−20(商
品名)吸着樹脂に通液し6β, 14α−ジヒドロキシ−
4−アンドロステン−3,17−ジオンを吸着させ、6
0%メタノールで溶出を行った。溶出液を減圧濃縮し、
析出した結晶を濾過で集めた。
【0040】更に、この結晶を140mlのアセトンに
溶解し、精密濾過により濁りを除去した後、28mlの
水を添加し再度減圧濃縮し、析出した結晶を濾過で集め
た。上記アセトンによる再結晶化をもう一度繰り返し行
い、6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン
−3,17−ジオンの白色粉末2.4gを得た。
溶解し、精密濾過により濁りを除去した後、28mlの
水を添加し再度減圧濃縮し、析出した結晶を濾過で集め
た。上記アセトンによる再結晶化をもう一度繰り返し行
い、6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン
−3,17−ジオンの白色粉末2.4gを得た。
【0041】実施例2 変異株の取得方法 3.6×105 個/mlの濃度NK−928521株
〔微工研菌寄第13234号(FERM P−13234)〕
の胞子懸濁液10mlをガラスシャーレに入れ、マグネ
チックスターラーでゆっくり攪拌しながら、15Wの紫
外線殺菌灯から40cm離して3分間紫外線処理を行っ
た。処理液を生理食塩水で100〜1000倍に希釈し
て、その希釈液0.1mlずつを市販のPDA(ポテト
デキストロース寒天)培地で作製したシャーレ上にガラ
ス棒で塗布し、25℃、1週間培養した。出現したコロ
ニーを斜面培地に移植し、さらに25℃、1週間培養し
た。このようにして得られた変異株によっても実施例と
同様に、6β、14α−ジヒドロキシ−4−アンドロス
テン−3,17−ジオンの製造に用いることが出来る。
〔微工研菌寄第13234号(FERM P−13234)〕
の胞子懸濁液10mlをガラスシャーレに入れ、マグネ
チックスターラーでゆっくり攪拌しながら、15Wの紫
外線殺菌灯から40cm離して3分間紫外線処理を行っ
た。処理液を生理食塩水で100〜1000倍に希釈し
て、その希釈液0.1mlずつを市販のPDA(ポテト
デキストロース寒天)培地で作製したシャーレ上にガラ
ス棒で塗布し、25℃、1週間培養した。出現したコロ
ニーを斜面培地に移植し、さらに25℃、1週間培養し
た。このようにして得られた変異株によっても実施例と
同様に、6β、14α−ジヒドロキシ−4−アンドロス
テン−3,17−ジオンの製造に用いることが出来る。
【0042】実施例3 変異株の6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロス
テン−3,17−ジオンの生産性の確認方法 実施例2で得られた変異株の斜面培養から一白金耳を1
0mlの液体培地(Malt ext.3.0%、ポリ
ペプトン2.0%、ソイビーンミール(Soybean
meal)1.0%、KH2 PO4 0.5%、MgS
O4 7H2 O0.5%(以上の濃度はすべてW/V)を
入れた25×200mmの試験管に接種し、27℃で3
日間、振盪し、種培養液を得た。この種培養液1.5m
lを50mlの液体培地C(砂糖5%、C.S.L.
2.0%、ソイビーンミール(Soybean mea
l)1.0%、KH2 PO4 0.5%、MgSO4 7H
2 O0.5%、4−アンドロステン−3,17−ジオン
0.5%(以上の濃度はすべてW/V)を入れた500
ml容の三角フラスコに接種し、27℃で5日間、通気
攪拌培養を行った。
テン−3,17−ジオンの生産性の確認方法 実施例2で得られた変異株の斜面培養から一白金耳を1
0mlの液体培地(Malt ext.3.0%、ポリ
ペプトン2.0%、ソイビーンミール(Soybean
meal)1.0%、KH2 PO4 0.5%、MgS
O4 7H2 O0.5%(以上の濃度はすべてW/V)を
入れた25×200mmの試験管に接種し、27℃で3
日間、振盪し、種培養液を得た。この種培養液1.5m
lを50mlの液体培地C(砂糖5%、C.S.L.
2.0%、ソイビーンミール(Soybean mea
l)1.0%、KH2 PO4 0.5%、MgSO4 7H
2 O0.5%、4−アンドロステン−3,17−ジオン
0.5%(以上の濃度はすべてW/V)を入れた500
ml容の三角フラスコに接種し、27℃で5日間、通気
攪拌培養を行った。
【0043】6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンド
ロステン−3,17−ジオンの分析方法 上記培養液1gを試験管に秤量し9mlのメタノールを
添加し抽出を行った後、その一部を遠心管に移し、15
000rpm、5分間の遠心により菌体残渣を除いたの
ちその上清を、以下の条件でHPLCにより定量を行っ
た。 分析カラム:Senshu−pak C18 6.0×
150mm 移動相 :アセトニトリル/水−1/2 流量 :1.0ml/min カラム温度:40℃ 検出 :240nm サンプル注入量:5μl 変異株の6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロス
テン−3,17−ジオンの生産量は1.82mg/gで
あった。
ロステン−3,17−ジオンの分析方法 上記培養液1gを試験管に秤量し9mlのメタノールを
添加し抽出を行った後、その一部を遠心管に移し、15
000rpm、5分間の遠心により菌体残渣を除いたの
ちその上清を、以下の条件でHPLCにより定量を行っ
た。 分析カラム:Senshu−pak C18 6.0×
150mm 移動相 :アセトニトリル/水−1/2 流量 :1.0ml/min カラム温度:40℃ 検出 :240nm サンプル注入量:5μl 変異株の6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロス
テン−3,17−ジオンの生産量は1.82mg/gで
あった。
【0044】実施例4 実施例1で得られた6β,14α−ジヒドロキシ−4−
アンドロステン−3,17−ジオン1gを48mlのク
ロロホルムに溶解し、この溶液に活性二酸化マンガン6
gを加えて、数時間、室温で反応を行った。反応後、反
応混合物より二酸化マンガンを除去し、十分洗浄した
後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去して粗精製
画分を得た。この画分を少量のクロロホルム(又はメタ
ノール)で溶解し、シリカゲルカラム及び溶出溶媒(ク
ロロホルム;メタノール=98:2)を用い、高速液体
クラマトグラフイー(センシュ−科学社製)で14α−
ヒドロキシ−4−アンドロステン−3,6,17−トリ
オンを溶出し、分取した。
アンドロステン−3,17−ジオン1gを48mlのク
ロロホルムに溶解し、この溶液に活性二酸化マンガン6
gを加えて、数時間、室温で反応を行った。反応後、反
応混合物より二酸化マンガンを除去し、十分洗浄した
後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去して粗精製
画分を得た。この画分を少量のクロロホルム(又はメタ
ノール)で溶解し、シリカゲルカラム及び溶出溶媒(ク
ロロホルム;メタノール=98:2)を用い、高速液体
クラマトグラフイー(センシュ−科学社製)で14α−
ヒドロキシ−4−アンドロステン−3,6,17−トリ
オンを溶出し、分取した。
【0045】
【発明の効果】本発明によれば、特定の生物的活性を有
し医薬品の原料として有用な6β, 14α−ジヒドロキ
シ−4−アンドロステン−3,17−ジオン及び14α
ヒドロキシ−4−アンドロステン−3,6,17−トリ
オンの生産性が高く、単離しにくい副生成物を含まない
ので、この化合物をより効率的に製造できる。
し医薬品の原料として有用な6β, 14α−ジヒドロキ
シ−4−アンドロステン−3,17−ジオン及び14α
ヒドロキシ−4−アンドロステン−3,6,17−トリ
オンの生産性が高く、単離しにくい副生成物を含まない
ので、この化合物をより効率的に製造できる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成5年12月13日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0003
【補正方法】変更
【補正内容】
【0003】
【化1】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 1/14 C12R 1:645)
Claims (3)
- 【請求項1】マイロセシウム(Myrotheciu
m)属に属し、4−アンドロステン−3,17−ジオン
を水酸化し6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンドロ
ステン−3,17−ジオンを生成する能力を有する微生
物を4−アンドロステン−3,17−ジオンを含有する
培地にて培養し、培養物より6β, 14α−ジヒドロキ
シ−4−アンドロステン−3,17−ジオンを採取する
ことを特徴とする方法。 - 【請求項2】マイロセシウム(Myrotheciu
m)属に属し、4−アンドロステン−3,17−ジオン
を水酸化し、6β, 14α−ジヒドロキシ−4−アンド
ロステン−3,17−ジオンを生成する能力を有する微
生物。 - 【請求項3】4−アンドロステン−3,17−ジオン
を、微生物で、水酸化し、6β,14α−ジヒドロキシ
−4−アンドロステン−3,17−ジオンとした後、酸
化して14α−ヒドロキシ−4−アンドロステン−3,
6,17−トリオンを製造する方法において、マイロセ
シウム(Myrothecium)属に属し、4−アン
ドロステン−3,17−ジオンを水酸化し6β, 14α
−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオ
ンを生成する能力を有する微生物を4−アンドロステン
−3,17−ジオンを含有する培地にて培養し、培養物
より6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン
3,17−ジオンを採取する工程を含むことを特徴とす
る14α−ヒドロキシ−4−アンドロステン−3,6,
17トリオンの製造方法。
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5272912A JPH06225793A (ja) | 1992-11-27 | 1993-10-06 | 6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオンの新規製造法 |
US08/154,857 US5378611A (en) | 1992-11-27 | 1993-11-19 | Process for producing 6β,14α-dihydroxy-4-androstene-3, 17-dione amid 14α-hydroxy-4-androstene-3,6,17-trione from 4-androstene-3, 17-dione using myrothecium sp. ferm bp-4432 |
CA002109680A CA2109680A1 (en) | 1992-11-27 | 1993-11-22 | Process for production of 6.beta.14.alpha.-dihydroxy-4-androstene-3, 17-dione |
KR1019930024962A KR940011638A (ko) | 1992-11-27 | 1993-11-23 | 6β, 14α-디히드록시-4-안드로스텐 3, 17-디온 제조방법 |
TW082109877A TW256855B (ja) | 1992-11-27 | 1993-11-23 | |
EP93309454A EP0599658A3 (en) | 1992-11-27 | 1993-11-26 | Process for the preparation of 6-beta, 14-alpha-dihydroxy-4-androstene-3,17-dione. |
CN93121553A CN1095418A (zh) | 1992-11-27 | 1993-11-27 | 生产6β,14α-二羟基-4-雄甾烯-3,17-二酮的方法 |
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---|---|---|---|
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Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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Family Applications (1)
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---|---|
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EP (1) | EP0599658A3 (ja) |
JP (1) | JPH06225793A (ja) |
KR (1) | KR940011638A (ja) |
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CA (1) | CA2109680A1 (ja) |
TW (1) | TW256855B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015535223A (ja) * | 2012-10-22 | 2015-12-10 | オロン エス.ピー.エー. | 酢酸アビラテロンの精製方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8052585B2 (en) * | 2008-10-24 | 2011-11-08 | Stuart Donaldson | Rehabilitation apparatus |
CN106831919A (zh) * | 2015-12-04 | 2017-06-13 | 上海市农药研究所有限公司 | 生物转化17α-羟基黄体酮生产11α,17α-双羟基黄体酮的提取工艺 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4382952A (en) * | 1981-05-19 | 1983-05-10 | Warner-Lambert Company | Antibiotic roridin L-2 and its use |
JPS63192796A (ja) * | 1987-02-06 | 1988-08-10 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 6β,14α−ジヒドロキシ−4−アンドロステン−3,17−ジオン |
ATE78825T1 (de) * | 1987-02-06 | 1992-08-15 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | Neue androst-4-en-3,17-dion-derivate und verfahren zur herstellung. |
US5180827A (en) * | 1988-03-29 | 1993-01-19 | Rhone-Poulenc Agrochimie | 2-(3-pyridyl) propanenitrile derivatives |
FR2629455B1 (fr) * | 1988-03-29 | 1991-09-27 | Rhone Poulenc Agrochimie | Derives de 2-(3-pyridinyl)3-(phenoxy) propanenitrile |
JPH0643439B2 (ja) * | 1989-02-07 | 1994-06-08 | 雪印乳業株式会社 | 光による6β,14α‐ジヒドロキシ‐4‐アンドロステン‐3,17‐ジオンの6β位水酸基の酸化方法 |
JP2844354B2 (ja) * | 1989-08-03 | 1999-01-06 | 富士薬品工業株式会社 | D―パントラクトンの製造法 |
DE4029389A1 (de) * | 1990-09-13 | 1992-03-26 | Schering Ag | Verfahren zur herstellung von (beta)-carbolin-derivaten |
-
1993
- 1993-10-06 JP JP5272912A patent/JPH06225793A/ja active Pending
- 1993-11-19 US US08/154,857 patent/US5378611A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-22 CA CA002109680A patent/CA2109680A1/en not_active Abandoned
- 1993-11-23 KR KR1019930024962A patent/KR940011638A/ko not_active Withdrawn
- 1993-11-23 TW TW082109877A patent/TW256855B/zh active
- 1993-11-26 EP EP93309454A patent/EP0599658A3/en not_active Withdrawn
- 1993-11-27 CN CN93121553A patent/CN1095418A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015535223A (ja) * | 2012-10-22 | 2015-12-10 | オロン エス.ピー.エー. | 酢酸アビラテロンの精製方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1095418A (zh) | 1994-11-23 |
US5378611A (en) | 1995-01-03 |
TW256855B (ja) | 1995-09-11 |
CA2109680A1 (en) | 1994-05-28 |
KR940011638A (ko) | 1994-06-21 |
EP0599658A3 (en) | 1995-07-12 |
EP0599658A2 (en) | 1994-06-01 |
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