JPH06225793A - ６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの新規製造法 - Google Patents
６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの新規製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】マイロセシウム属に属し、４−アンドロステン
−３，１７−ジオンを水酸化し、６β，１４α−ジヒド
ロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを生産
する能力を有する微生物を４−アンドロステン−３，１
７−ジオンを含む培地にて培養し、培養物より６β，１
４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−
ジオンを採取することを特徴とする。 【効果】本発明の方法を用いることにより、６β，１４
α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジ
オン及び１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，６，１７−トリオンを高収率で製造することができ
る。
−３，１７−ジオンを水酸化し、６β，１４α−ジヒド
ロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを生産
する能力を有する微生物を４−アンドロステン−３，１
７−ジオンを含む培地にて培養し、培養物より６β，１
４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−
ジオンを採取することを特徴とする。 【効果】本発明の方法を用いることにより、６β，１４
α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジ
オン及び１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，６，１７−トリオンを高収率で製造することができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アンドロジェン活性、
アロマテース活性阻害作用、ヒト乳癌細胞に対する細胞
増殖阻害作用等を有することが知られているアンドロス
テン誘導体、６β, １４α −ジヒドロキシ−４−アン
ドロステン−３，１７−ジオン及び１４α−ヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，６，１７−トリオンの新規
製造法に関する。
アロマテース活性阻害作用、ヒト乳癌細胞に対する細胞
増殖阻害作用等を有することが知られているアンドロス
テン誘導体、６β, １４α −ジヒドロキシ−４−アン
ドロステン−３，１７−ジオン及び１４α−ヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，６，１７−トリオンの新規
製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、下記構造式で示される６β, １４
α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジ
オンの製造法としては、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏ
ｎｉｕｍ）属に属する菌株、例えばアクレモニウム・ス
トリクタム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｔｒｉｃｔｕ
ｍ）を栄養源含有培地で培養し、培養物より ６β, １
４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−
ジオンを採取する方法（特開昭６３−１９２７９６号
「６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，１７−ジオン」）が知られている。しかし、この方
法によると、６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンの収量が低く、同時に生成
する副生成物の為精製収率が低い等の問題がある。
α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジ
オンの製造法としては、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏ
ｎｉｕｍ）属に属する菌株、例えばアクレモニウム・ス
トリクタム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｔｒｉｃｔｕ
ｍ）を栄養源含有培地で培養し、培養物より ６β, １
４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−
ジオンを採取する方法（特開昭６３−１９２７９６号
「６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，１７−ジオン」）が知られている。しかし、この方
法によると、６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンの収量が低く、同時に生成
する副生成物の為精製収率が低い等の問題がある。
【０００３】
【化１】
【０００４】また、アクレモニウム（Acremonium) 属に
属する特定の菌株、アクレモニウム・ストリクタム（Ac
remonium Strictum)（前述）を栄養源含有培地で培養
し、培養物より採取した６β，１４α−ジヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンを酸化して、制
癌剤として開発が期待されている１４α−ヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，６，１７−トリオンとするこ
とが知られている。（特公平１−３２２３６）。しか
し、この方法によっても、１４α−ヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，６，１７−トリオンの収量が低い問
題がある。
属する特定の菌株、アクレモニウム・ストリクタム（Ac
remonium Strictum)（前述）を栄養源含有培地で培養
し、培養物より採取した６β，１４α−ジヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンを酸化して、制
癌剤として開発が期待されている１４α−ヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，６，１７−トリオンとするこ
とが知られている。（特公平１−３２２３６）。しか
し、この方法によっても、１４α−ヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，６，１７−トリオンの収量が低い問
題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題を
改善し、さらに効率のよい６β, １４α−ジヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，１７−ジオン及び１４α−
ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，６，１７−トリ
オンの製造法を提供することを課題とする。
改善し、さらに効率のよい６β, １４α−ジヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，１７−ジオン及び１４α−
ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，６，１７−トリ
オンの製造法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率の良
い６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，１７−ジオンの製造法を目的として多数の微生物を
土壌中より分離し、その生成効率を調べたところ、マイ
ロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属する微生
物が、副生物の生成も少なく，効率良く６β, １４α−
ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン
を生産していることを見出した。
い６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，１７−ジオンの製造法を目的として多数の微生物を
土壌中より分離し、その生成効率を調べたところ、マイ
ロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属する微生
物が、副生物の生成も少なく，効率良く６β, １４α−
ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン
を生産していることを見出した。
【０００７】本発明を概説すれば、本発明の第１の発明
は、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属
し、４−アンドロステン−３，１７−ジオンを水酸化し
６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，１７−ジオンを生成する能力を有する微生物を４−
アンドロステン−３，１７−ジオンを含有する培地にて
培養し、培養物より６β, １４α−ジヒドロキシ−４−
アンドロステン−３，１７−ジオンを採取することを特
徴とする。
は、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属
し、４−アンドロステン−３，１７−ジオンを水酸化し
６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，１７−ジオンを生成する能力を有する微生物を４−
アンドロステン−３，１７−ジオンを含有する培地にて
培養し、培養物より６β, １４α−ジヒドロキシ−４−
アンドロステン−３，１７−ジオンを採取することを特
徴とする。
【０００８】また、本発明の第２の発明は、マイロセシ
ウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属し、４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンを水酸化し、６β, １４α
−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ンを生成する能力を有する微生物に関する。
ウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属し、４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンを水酸化し、６β, １４α
−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ンを生成する能力を有する微生物に関する。
【０００９】また、本発明の第３の発明は、４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンを、微生物で、水酸化し、
６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，１７−ジオンとした後、酸化して１４α−ヒドロキ
シ−４−アンドロステン−３，６，１７−トリオンを製
造する方法において、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅ
ｃｉｕｍ）属に属し、４−アンドロステン−３，１７−
ジオンを水酸化し６β，１４α−ジヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオンを生成する能力を有す
る微生物を４−アンドロステン−３，１７−ジオンを含
有する培地にて培養し、培養物より６β，１４α−ジヒ
ドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを採
取する工程を含むことを特徴とする１４α−ヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，６，１７−トリオンの製造
方法に関する。
ロステン−３，１７−ジオンを、微生物で、水酸化し、
６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−
３，１７−ジオンとした後、酸化して１４α−ヒドロキ
シ−４−アンドロステン−３，６，１７−トリオンを製
造する方法において、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅ
ｃｉｕｍ）属に属し、４−アンドロステン−３，１７−
ジオンを水酸化し６β，１４α−ジヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオンを生成する能力を有す
る微生物を４−アンドロステン−３，１７−ジオンを含
有する培地にて培養し、培養物より６β，１４α−ジヒ
ドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを採
取する工程を含むことを特徴とする１４α−ヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，６，１７−トリオンの製造
方法に関する。
【００１０】前記培養物から培養生産物を単離し、理化
学的性質を調べた結果、６β, １４α−ジヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンの標準品と一致
した。
学的性質を調べた結果、６β, １４α−ジヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンの標準品と一致
した。
【００１１】即ち培養生産物の理化学的性質は次の通り
である。 外観 白色粉末 分子量 318 分子式 Ｃ19Ｈ26Ｏ4 融点 256〜257 ℃ 紫外部吸収スペクトル 極大吸収 236 nm（中性、メ
タノール中） Ｅ１マススペクトル m/z=318 赤外吸収スペクトル （KBr 法）3460,2960,1748,168
2,1650cm-1
である。 外観 白色粉末 分子量 318 分子式 Ｃ19Ｈ26Ｏ4 融点 256〜257 ℃ 紫外部吸収スペクトル 極大吸収 236 nm（中性、メ
タノール中） Ｅ１マススペクトル m/z=318 赤外吸収スペクトル （KBr 法）3460,2960,1748,168
2,1650cm-1
【００１２】プロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣ
ｌ3 ） δｐｐｍ；１８−Ｈ：１．０８（３Ｈ，ｓ） １９−Ｈ：１．４２（３Ｈ，ｓ） ６−Ｈ：４．４９（１Ｈ，ｔ） ４−Ｈ：５．８３（１Ｈ，ｓ）13 Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ3 ） δｐｐｍ；Ｃ−１：３４．３，Ｃ−２：３２．６， Ｃ−３：２００．４，Ｃ−４：１２６．８， Ｃ−５：１６７．４，Ｃ−６：７３．０， Ｃ−７：３７．３，Ｃ−８：３２．６， Ｃ−９：４７．０，Ｃ−１０：３８．５， Ｃ−１１：１９．４，Ｃ−１２：２４．７， Ｃ−１３：５２．９，Ｃ−１４：８０．５， Ｃ−１５：３０．３，Ｃ−１６：３３．０， Ｃ−１７：２１８．２，Ｃ−１８：１８．０ Ｃ−１９：１９．６
ｌ3 ） δｐｐｍ；１８−Ｈ：１．０８（３Ｈ，ｓ） １９−Ｈ：１．４２（３Ｈ，ｓ） ６−Ｈ：４．４９（１Ｈ，ｔ） ４−Ｈ：５．８３（１Ｈ，ｓ）13 Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ3 ） δｐｐｍ；Ｃ−１：３４．３，Ｃ−２：３２．６， Ｃ−３：２００．４，Ｃ−４：１２６．８， Ｃ−５：１６７．４，Ｃ−６：７３．０， Ｃ−７：３７．３，Ｃ−８：３２．６， Ｃ−９：４７．０，Ｃ−１０：３８．５， Ｃ−１１：１９．４，Ｃ−１２：２４．７， Ｃ−１３：５２．９，Ｃ−１４：８０．５， Ｃ−１５：３０．３，Ｃ−１６：３３．０， Ｃ−１７：２１８．２，Ｃ−１８：１８．０ Ｃ−１９：１９．６
【００１３】本発明で用いられる微生物として具体的に
は、例えば前記マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
ｍ）ｓｐ．ＮＫ−９２８５２１株〔微工研菌寄第１３２
３４号（FERM P- １３２３４）〕があげられる。また該
菌株の自然的および人工的変異株を含め、マイロセシウ
ム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属する菌株で４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオンを水酸化し６β, １４
α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジ
オンを生成する能力を有する微生物はすべて本発明にお
いて使用することができる。人工的変異株は、紫外線の
照射など通常行う方法で得ることができる。
は、例えば前記マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
ｍ）ｓｐ．ＮＫ−９２８５２１株〔微工研菌寄第１３２
３４号（FERM P- １３２３４）〕があげられる。また該
菌株の自然的および人工的変異株を含め、マイロセシウ
ム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属する菌株で４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオンを水酸化し６β, １４
α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジ
オンを生成する能力を有する微生物はすべて本発明にお
いて使用することができる。人工的変異株は、紫外線の
照射など通常行う方法で得ることができる。
【００１４】ＮＫ−９２８５２１株は次の菌学的性質を
有する。 （１）各種培地における生育状態 各種寒天培地におけるＮＫ−９２８５２１株の生育状態
は下表のとおりである。観察は２５℃で１４日後に行っ
た。
有する。 （１）各種培地における生育状態 各種寒天培地におけるＮＫ−９２８５２１株の生育状態
は下表のとおりである。観察は２５℃で１４日後に行っ
た。
【００１５】
【表１】
【００１６】本菌は、コーンミール寒天培地上で分生子
形成細胞は、散在または白色の周辺部を伴った淡オリー
ブ〜黒緑色の分生子座に集まる。培地上での分生子形成
には３〜４週間要する。菌糸は、無色、滑面、薄壁、隔
壁があり、幅は２．０〜３．０μｍ。分生子座は、無色
の細胞の薄い層からなる。周縁菌糸は、ねじれて分岐し
ており、無色、滑面、隔壁がある。
形成細胞は、散在または白色の周辺部を伴った淡オリー
ブ〜黒緑色の分生子座に集まる。培地上での分生子形成
には３〜４週間要する。菌糸は、無色、滑面、薄壁、隔
壁があり、幅は２．０〜３．０μｍ。分生子座は、無色
の細胞の薄い層からなる。周縁菌糸は、ねじれて分岐し
ており、無色、滑面、隔壁がある。
【００１７】分生子柄は、薄い子座層から形成され、繰
り返し分岐し、それぞれの分岐部で２〜４本の分岐を生
じ、最後の分岐上にフィアライドを着生する。無色、隔
壁があり、細胞の大きさは７．０〜１５．０×２．０〜
３．０μｍ。フィアライドは、２〜６本輪生、互いに密
着して平行した層となる。円柱形（８．０〜１６．０×
２．０〜３．０μｍ）、無色、分生子形成部周辺が暗色
となる。
り返し分岐し、それぞれの分岐部で２〜４本の分岐を生
じ、最後の分岐上にフィアライドを着生する。無色、隔
壁があり、細胞の大きさは７．０〜１５．０×２．０〜
３．０μｍ。フィアライドは、２〜６本輪生、互いに密
着して平行した層となる。円柱形（８．０〜１６．０×
２．０〜３．０μｍ）、無色、分生子形成部周辺が暗色
となる。
【００１８】分生子は、舟形〜紡錘形〜レモン形（５．
０〜７．０×２．１〜４．０μｍ）、基部は突き出て裁
断状、オリーブ褐色、表面は平滑、多くは子座上に粘塊
となって集まる。
０〜７．０×２．１〜４．０μｍ）、基部は突き出て裁
断状、オリーブ褐色、表面は平滑、多くは子座上に粘塊
となって集まる。
【００１９】（２）生理学的性質 至適生育温度は２５℃前後で、１０〜３３℃で生育し、
好ましい生育温度は２０〜３０℃、３７℃では生育しな
い。至適生育ｐＨは、６．０前後で、４．０〜８．０で
生育する。
好ましい生育温度は２０〜３０℃、３７℃では生育しな
い。至適生育ｐＨは、６．０前後で、４．０〜８．０で
生育する。
【００２０】以上の各種菌学的性質より本菌は、Ａｉｎ
ｓｗｏｒｔｈ，Ｇ．Ｃ．：Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ
Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｔｈ
ｅＦｕｎｇｉ，７ｔｈ ｅｄ．（ｂｙ Ｈａｗｋｓｗｏ
ｒｔｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，ａｎｄ Ａｉｎｓｗｏｒｔ
ｈ），ＣＭＩ，Ｋｅｗ（１９８３）に従い、真菌門、不
完全菌亜門、不完全糸状菌綱のマイロセシウム（Ｍｙｒ
ｏｔｈｅｃｉｕｍ）に属する一菌株であることが明らか
になり本菌株をマイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
ｍ）ｓｐ．ＮＫ−９２８５２１株と命名した。
ｓｗｏｒｔｈ，Ｇ．Ｃ．：Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ
Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｔｈ
ｅＦｕｎｇｉ，７ｔｈ ｅｄ．（ｂｙ Ｈａｗｋｓｗｏ
ｒｔｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，ａｎｄ Ａｉｎｓｗｏｒｔ
ｈ），ＣＭＩ，Ｋｅｗ（１９８３）に従い、真菌門、不
完全菌亜門、不完全糸状菌綱のマイロセシウム（Ｍｙｒ
ｏｔｈｅｃｉｕｍ）に属する一菌株であることが明らか
になり本菌株をマイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
ｍ）ｓｐ．ＮＫ−９２８５２１株と命名した。
【００２１】本発明による６β, １４α−ジヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの生産は、炭
素源、窒素源、無機物その他使用菌株の必要とする微量
の栄養素をほどよく含有する通常の培地に基質となる４
−アンドロステン−３，１７−ジオンを添加し培養す
る。炭素源としては、グリセリンの他に、例えばグルコ
ース、フラクトース、シュークロース、マルトース、ラ
クトース、デキストリン、澱粉、水飴、糖蜜、油脂類、
有機酸類などを用いることができる。好ましくは、シュ
ークロ−スがよい。
−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの生産は、炭
素源、窒素源、無機物その他使用菌株の必要とする微量
の栄養素をほどよく含有する通常の培地に基質となる４
−アンドロステン−３，１７−ジオンを添加し培養す
る。炭素源としては、グリセリンの他に、例えばグルコ
ース、フラクトース、シュークロース、マルトース、ラ
クトース、デキストリン、澱粉、水飴、糖蜜、油脂類、
有機酸類などを用いることができる。好ましくは、シュ
ークロ−スがよい。
【００２２】窒素源としては、例えば大豆粉（ソイビー
ンミール）、綿実粉、コーンスチープリカー（Ｃ．Ｓ．
Ｌ．）、ペプトン、カゼイン、カザミノ酸、酵母エキ
ス、胚芽、肉エキス、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩
などの有機窒素化合物や無機窒素化合物が使用可能であ
り好ましくはソイビーンミールやＣ．Ｓ．Ｌ．がよい。
さらに無機物としてはナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類が
単独あるいは適宜組み合わせて用いられる。
ンミール）、綿実粉、コーンスチープリカー（Ｃ．Ｓ．
Ｌ．）、ペプトン、カゼイン、カザミノ酸、酵母エキ
ス、胚芽、肉エキス、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩
などの有機窒素化合物や無機窒素化合物が使用可能であ
り好ましくはソイビーンミールやＣ．Ｓ．Ｌ．がよい。
さらに無機物としてはナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類が
単独あるいは適宜組み合わせて用いられる。
【００２３】さらに必要に応じて鉄塩、銅塩、亜鉛塩、
マンガン塩、コバルト塩などの重金属、ビオチン、ビタ
ミンＢ1 などのビタミン類を適宜添加してもよい。ま
た、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエー
テルなどの界面活性剤を培地に加えてもよい。
マンガン塩、コバルト塩などの重金属、ビオチン、ビタ
ミンＢ1 などのビタミン類を適宜添加してもよい。ま
た、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエー
テルなどの界面活性剤を培地に加えてもよい。
【００２４】培養法としては、微生物の培養に用いられ
る一般的方法が採用されるが、液体培養法、特に振盪ま
たは深部通気攪拌培養が最適である。培養温度は通常１
０〜３３℃であり、好ましくは２０〜３０℃である。培
養ｐＨは通常２〜８が好ましく、より好ましくは４〜７
である。
る一般的方法が採用されるが、液体培養法、特に振盪ま
たは深部通気攪拌培養が最適である。培養温度は通常１
０〜３３℃であり、好ましくは２０〜３０℃である。培
養ｐＨは通常２〜８が好ましく、より好ましくは４〜７
である。
【００２５】また培養日数は培養条件によって異なる
が、通常１〜１０日である。培地中の４−アンドロステ
ン−３，１７−ジオン濃度は、通常０．０２〜２．０％
濃度（w/v)好ましくは０．１〜１．５％（w/v)になるよ
うに添加するのがよい。
が、通常１〜１０日である。培地中の４−アンドロステ
ン−３，１７−ジオン濃度は、通常０．０２〜２．０％
濃度（w/v)好ましくは０．１〜１．５％（w/v)になるよ
うに添加するのがよい。
【００２６】また４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ンの添加時期は、培養開始時に培地の一部として存在さ
せてもよいし、培養中連続的または間欠的に添加しても
よい。培養中、グルコースやマルトースあるいはシュー
クロースなどの炭素源またはペプトンや酵母エキスなど
の窒素源を添加する場合、これに伴って添加してもよ
い。
ンの添加時期は、培養開始時に培地の一部として存在さ
せてもよいし、培養中連続的または間欠的に添加しても
よい。培養中、グルコースやマルトースあるいはシュー
クロースなどの炭素源またはペプトンや酵母エキスなど
の窒素源を添加する場合、これに伴って添加してもよ
い。
【００２７】培養終了後、培養物中に蓄積された６β,
１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７
−ジオンを培養物中から採取する為には本物質の理化学
的性質を利用することにより行う。
１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７
−ジオンを培養物中から採取する為には本物質の理化学
的性質を利用することにより行う。
【００２８】即ち、６β, １４α−ジヒドロキシ−４−
アンドロステン−３，１７−ジオンは菌体を含む不溶性
画分及び培養濾液中に含まれるので培養物を遠心分離ま
たは濾過により培養菌体を含む不溶性画分と濾液とに分
離してから６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロ
ステン−３，１７−ジオンを抽出採取することができ
る。
アンドロステン−３，１７−ジオンは菌体を含む不溶性
画分及び培養濾液中に含まれるので培養物を遠心分離ま
たは濾過により培養菌体を含む不溶性画分と濾液とに分
離してから６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロ
ステン−３，１７−ジオンを抽出採取することができ
る。
【００２９】また、培養物を直接非親水性有機溶媒、た
とえばクロロホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノ
ール、メチルイソブチルケトンなどの有機溶媒で抽出す
ることにより分離し、採取することもできる。
とえばクロロホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノ
ール、メチルイソブチルケトンなどの有機溶媒で抽出す
ることにより分離し、採取することもできる。
【００３０】培養濾液から６β, １４α−ジヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを分離採取す
るには、培養濾液を活性炭、粉末セルロース、吸着樹脂
例えばポリスチレン系ポーラスポリマーゲル、メタアク
リル酸エステル系ポーラスポリマーゲル、ポリビニルア
ルコールを球状の多孔質ゲルにしたもの、アクリルエス
テル系ポーラスポリマーゲルなどの担体に吸着させ、次
いで適宜の溶媒で溶出することができる。
−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを分離採取す
るには、培養濾液を活性炭、粉末セルロース、吸着樹脂
例えばポリスチレン系ポーラスポリマーゲル、メタアク
リル酸エステル系ポーラスポリマーゲル、ポリビニルア
ルコールを球状の多孔質ゲルにしたもの、アクリルエス
テル系ポーラスポリマーゲルなどの担体に吸着させ、次
いで適宜の溶媒で溶出することができる。
【００３１】これらの担体から６β, １４α−ジヒドロ
キシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを溶出す
るためには、水溶性有機溶剤例えば含水アルコールや含
水アセトンなどで溶出することができる。必要に応じて
カラムクロマトグラフィーによる精製を行なってもよ
い。
キシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを溶出す
るためには、水溶性有機溶剤例えば含水アルコールや含
水アセトンなどで溶出することができる。必要に応じて
カラムクロマトグラフィーによる精製を行なってもよ
い。
【００３２】培養菌体を含む不溶性画分からの６β, １
４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−
ジオンの分離採取は該不溶性画分からアセトン、エタノ
ールなどの親水性有機溶媒で目的化合物を抽出し、ステ
ロイド類の通常知られた分離精製法を用い、さらに精製
することができる。例えばシリカゲル、活性アルミナ、
吸着樹脂などの担体を用いるカラムクロマトグラフィー
による方法である。
４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−
ジオンの分離採取は該不溶性画分からアセトン、エタノ
ールなどの親水性有機溶媒で目的化合物を抽出し、ステ
ロイド類の通常知られた分離精製法を用い、さらに精製
することができる。例えばシリカゲル、活性アルミナ、
吸着樹脂などの担体を用いるカラムクロマトグラフィー
による方法である。
【００３３】担体としてシリカゲルを用いたカラムクロ
マトグラフィーでは、溶出溶媒としてクロロホルム、酢
酸エチル、アセトン、メタノール、水などを単独あるい
は適宜組み合わせた混合溶媒を用いて溶出することがで
きる。また高速液体クロマトグラフィーによる分離精製
も有利に利用できる。用いる担体としてはシリカゲル、
オクタデシル基、アミノ基、オクチル基、などが結合し
た化学結合型シリカゲル、またはポリスチレン系ポーラ
スポリマーゲルなどの吸着樹脂を用いる。
マトグラフィーでは、溶出溶媒としてクロロホルム、酢
酸エチル、アセトン、メタノール、水などを単独あるい
は適宜組み合わせた混合溶媒を用いて溶出することがで
きる。また高速液体クロマトグラフィーによる分離精製
も有利に利用できる。用いる担体としてはシリカゲル、
オクタデシル基、アミノ基、オクチル基、などが結合し
た化学結合型シリカゲル、またはポリスチレン系ポーラ
スポリマーゲルなどの吸着樹脂を用いる。
【００３４】移動層としてはヘキサン、イソプロピルア
ルコール、含水メタノール、含水アセトニトリルなどを
用いて溶出することができる。また液相間の分配に基づ
く分離、精製法である交流分配法も有利に利用できる。
分配液系としてはヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリ
ル系、クロロホルム−メタノール−水系などの混合溶媒
を用いることができる。所望により、脱色用に使用され
るハイポーラス樹脂などの吸着樹脂や活性炭などで、菌
体ろ液やクロマトグラフィー溶出液を処理して脱色して
もよい。
ルコール、含水メタノール、含水アセトニトリルなどを
用いて溶出することができる。また液相間の分配に基づ
く分離、精製法である交流分配法も有利に利用できる。
分配液系としてはヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリ
ル系、クロロホルム−メタノール−水系などの混合溶媒
を用いることができる。所望により、脱色用に使用され
るハイポーラス樹脂などの吸着樹脂や活性炭などで、菌
体ろ液やクロマトグラフィー溶出液を処理して脱色して
もよい。
【００３５】このようにして得られた、６β，１４α−
ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン
を酸化して、１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン
−３，６，１７−トリオンを製造するには、特公平１−
３２２３６号に記載の方法もしくはこれに準じて行えば
よい。すなわち、６β，１４α−ジヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオンをクロロホルムに溶解
し、活性二酸化マンガン等の酸化剤を加えて反応を行
い、反応終了後、反応混合物をろ過して酸化剤を除去
し、十分洗浄した後、溶媒を除去して、粗精製品を得
る。次いで、この粗精製品を少量のクロロホルム又はメ
タノールで溶解し、シリカゲルカラム及び溶出溶媒（ク
ロロホルム：メタノール＝９８：２）を用い、高速液体
クロマトグラフィに付して１４−α−ヒドロキシ−４−
アンドロステン−３，６，１７−トリオンを溶出、分取
する。
ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン
を酸化して、１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン
−３，６，１７−トリオンを製造するには、特公平１−
３２２３６号に記載の方法もしくはこれに準じて行えば
よい。すなわち、６β，１４α−ジヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオンをクロロホルムに溶解
し、活性二酸化マンガン等の酸化剤を加えて反応を行
い、反応終了後、反応混合物をろ過して酸化剤を除去
し、十分洗浄した後、溶媒を除去して、粗精製品を得
る。次いで、この粗精製品を少量のクロロホルム又はメ
タノールで溶解し、シリカゲルカラム及び溶出溶媒（ク
ロロホルム：メタノール＝９８：２）を用い、高速液体
クロマトグラフィに付して１４−α−ヒドロキシ−４−
アンドロステン−３，６，１７−トリオンを溶出、分取
する。
【００３６】
【実施例】以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３７】実施例１ ＮＫ−９２８５２１株〔微工研菌寄第１３２３４号（FE
RM P- １３２３４）〕の斜面培養から一白金耳を１００
ｍｌの液体培地（Ｍａｌｔ ｅｘｔ．３．０％、ポリペ
プトン２．０％、ソイビーンミール（Ｓｏｙｂｅａｎ
ｍｅａｌ）１．０％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５％、ＭｇＳＯ
4 ７Ｈ2 Ｏ０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ））を
入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２７℃で
３日間、振盪し、一次種培養液を得た。この種培養液全
量を２０Ｌの液体培地Ａ（砂糖５％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．２．
０％、ソイビーンミール（Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ）
１．０％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５％、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ
０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ））を入れた３０
Ｌ容のジャーファメンターに接種し、２７℃で３日間、
通気攪拌培養を行い、二次種培養液を得た。
RM P- １３２３４）〕の斜面培養から一白金耳を１００
ｍｌの液体培地（Ｍａｌｔ ｅｘｔ．３．０％、ポリペ
プトン２．０％、ソイビーンミール（Ｓｏｙｂｅａｎ
ｍｅａｌ）１．０％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５％、ＭｇＳＯ
4 ７Ｈ2 Ｏ０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ））を
入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２７℃で
３日間、振盪し、一次種培養液を得た。この種培養液全
量を２０Ｌの液体培地Ａ（砂糖５％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．２．
０％、ソイビーンミール（Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ）
１．０％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５％、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ
０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ））を入れた３０
Ｌ容のジャーファメンターに接種し、２７℃で３日間、
通気攪拌培養を行い、二次種培養液を得た。
【００３８】この種培養液０．６Ｌを２０Ｌの液体培地
Ｂ（砂糖１０％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．２．０％、ソイビーンミ
ール（Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ）１．０％、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ０．５％、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ０．５％、４−アン
ドロステン−３，１７−ジオン０．７５％（以上の濃度
はすべてＷ／Ｖ））を入れた３０Ｌ容のジャーファメン
ターに接種し、２７℃で５日間、通気攪拌培養を行っ
た。
Ｂ（砂糖１０％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．２．０％、ソイビーンミ
ール（Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ）１．０％、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ０．５％、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ０．５％、４−アン
ドロステン−３，１７−ジオン０．７５％（以上の濃度
はすべてＷ／Ｖ））を入れた３０Ｌ容のジャーファメン
ターに接種し、２７℃で５日間、通気攪拌培養を行っ
た。
【００３９】このようにして得た培養液２リットルを水
２リットルで希釈し、濾過助剤３．０％を添加し、予め
硅そう土を敷き詰めたヌッチェで濾過し、上澄と菌体に
分離した。得られた濾液をダイヤイオンＨＰ−２０（商
品名）吸着樹脂に通液し６β, １４α−ジヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンを吸着させ、６
０％メタノールで溶出を行った。溶出液を減圧濃縮し、
析出した結晶を濾過で集めた。
２リットルで希釈し、濾過助剤３．０％を添加し、予め
硅そう土を敷き詰めたヌッチェで濾過し、上澄と菌体に
分離した。得られた濾液をダイヤイオンＨＰ−２０（商
品名）吸着樹脂に通液し６β, １４α−ジヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンを吸着させ、６
０％メタノールで溶出を行った。溶出液を減圧濃縮し、
析出した結晶を濾過で集めた。
【００４０】更に、この結晶を１４０ｍｌのアセトンに
溶解し、精密濾過により濁りを除去した後、２８ｍｌの
水を添加し再度減圧濃縮し、析出した結晶を濾過で集め
た。上記アセトンによる再結晶化をもう一度繰り返し行
い、６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン
−３，１７−ジオンの白色粉末２．４ｇを得た。
溶解し、精密濾過により濁りを除去した後、２８ｍｌの
水を添加し再度減圧濃縮し、析出した結晶を濾過で集め
た。上記アセトンによる再結晶化をもう一度繰り返し行
い、６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン
−３，１７−ジオンの白色粉末２．４ｇを得た。
【００４１】実施例２ 変異株の取得方法 ３．６×１０5 個／ｍｌの濃度ＮＫ−９２８５２１株
〔微工研菌寄第１３２３４号（FERM P−１３２３４）〕
の胞子懸濁液１０ｍｌをガラスシャーレに入れ、マグネ
チックスターラーでゆっくり攪拌しながら、１５Ｗの紫
外線殺菌灯から４０ｃｍ離して３分間紫外線処理を行っ
た。処理液を生理食塩水で１００〜１０００倍に希釈し
て、その希釈液０．１ｍｌずつを市販のＰＤＡ（ポテト
デキストロース寒天）培地で作製したシャーレ上にガラ
ス棒で塗布し、２５℃、１週間培養した。出現したコロ
ニーを斜面培地に移植し、さらに２５℃、１週間培養し
た。このようにして得られた変異株によっても実施例と
同様に、６β、１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロス
テン−３，１７−ジオンの製造に用いることが出来る。
〔微工研菌寄第１３２３４号（FERM P−１３２３４）〕
の胞子懸濁液１０ｍｌをガラスシャーレに入れ、マグネ
チックスターラーでゆっくり攪拌しながら、１５Ｗの紫
外線殺菌灯から４０ｃｍ離して３分間紫外線処理を行っ
た。処理液を生理食塩水で１００〜１０００倍に希釈し
て、その希釈液０．１ｍｌずつを市販のＰＤＡ（ポテト
デキストロース寒天）培地で作製したシャーレ上にガラ
ス棒で塗布し、２５℃、１週間培養した。出現したコロ
ニーを斜面培地に移植し、さらに２５℃、１週間培養し
た。このようにして得られた変異株によっても実施例と
同様に、６β、１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロス
テン−３，１７−ジオンの製造に用いることが出来る。
【００４２】実施例３ 変異株の６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロス
テン−３，１７−ジオンの生産性の確認方法 実施例２で得られた変異株の斜面培養から一白金耳を１
０ｍｌの液体培地（Ｍａｌｔ ｅｘｔ．３．０％、ポリ
ペプトン２．０％、ソイビーンミール（Ｓｏｙｂｅａｎ
ｍｅａｌ）１．０％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５％、ＭｇＳ
Ｏ4 ７Ｈ2 Ｏ０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ）を
入れた２５×２００ｍｍの試験管に接種し、２７℃で３
日間、振盪し、種培養液を得た。この種培養液１．５ｍ
ｌを５０ｍｌの液体培地Ｃ（砂糖５％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．
２．０％、ソイビーンミール（Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａ
ｌ）１．０％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５％、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ
2 Ｏ０．５％、４−アンドロステン−３，１７−ジオン
０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ）を入れた５００
ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２７℃で５日間、通気
攪拌培養を行った。
テン−３，１７−ジオンの生産性の確認方法 実施例２で得られた変異株の斜面培養から一白金耳を１
０ｍｌの液体培地（Ｍａｌｔ ｅｘｔ．３．０％、ポリ
ペプトン２．０％、ソイビーンミール（Ｓｏｙｂｅａｎ
ｍｅａｌ）１．０％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５％、ＭｇＳ
Ｏ4 ７Ｈ2 Ｏ０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ）を
入れた２５×２００ｍｍの試験管に接種し、２７℃で３
日間、振盪し、種培養液を得た。この種培養液１．５ｍ
ｌを５０ｍｌの液体培地Ｃ（砂糖５％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．
２．０％、ソイビーンミール（Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａ
ｌ）１．０％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５％、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ
2 Ｏ０．５％、４−アンドロステン−３，１７−ジオン
０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ）を入れた５００
ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２７℃で５日間、通気
攪拌培養を行った。
【００４３】６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンの分析方法 上記培養液１ｇを試験管に秤量し９ｍｌのメタノールを
添加し抽出を行った後、その一部を遠心管に移し、１５
０００ｒｐｍ、５分間の遠心により菌体残渣を除いたの
ちその上清を、以下の条件でＨＰＬＣにより定量を行っ
た。 分析カラム：Ｓｅｎｓｈｕ−ｐａｋ Ｃ１８ ６．０×
１５０ｍｍ 移動相 ：アセトニトリル／水−１／２ 流量 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ カラム温度：４０℃ 検出 ：２４０ｎｍ サンプル注入量：５μｌ 変異株の６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロス
テン−３，１７−ジオンの生産量は１．８２ｍｇ／ｇで
あった。
ロステン−３，１７−ジオンの分析方法 上記培養液１ｇを試験管に秤量し９ｍｌのメタノールを
添加し抽出を行った後、その一部を遠心管に移し、１５
０００ｒｐｍ、５分間の遠心により菌体残渣を除いたの
ちその上清を、以下の条件でＨＰＬＣにより定量を行っ
た。 分析カラム：Ｓｅｎｓｈｕ−ｐａｋ Ｃ１８ ６．０×
１５０ｍｍ 移動相 ：アセトニトリル／水−１／２ 流量 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ カラム温度：４０℃ 検出 ：２４０ｎｍ サンプル注入量：５μｌ 変異株の６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロス
テン−３，１７−ジオンの生産量は１．８２ｍｇ／ｇで
あった。
【００４４】実施例４ 実施例１で得られた６β，１４α−ジヒドロキシ−４−
アンドロステン−３，１７−ジオン１ｇを４８ｍｌのク
ロロホルムに溶解し、この溶液に活性二酸化マンガン６
ｇを加えて、数時間、室温で反応を行った。反応後、反
応混合物より二酸化マンガンを除去し、十分洗浄した
後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去して粗精製
画分を得た。この画分を少量のクロロホルム（又はメタ
ノール）で溶解し、シリカゲルカラム及び溶出溶媒（ク
ロロホルム；メタノール＝９８：２）を用い、高速液体
クラマトグラフイー（センシュ−科学社製）で１４α−
ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，６，１７−トリ
オンを溶出し、分取した。
アンドロステン−３，１７−ジオン１ｇを４８ｍｌのク
ロロホルムに溶解し、この溶液に活性二酸化マンガン６
ｇを加えて、数時間、室温で反応を行った。反応後、反
応混合物より二酸化マンガンを除去し、十分洗浄した
後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去して粗精製
画分を得た。この画分を少量のクロロホルム（又はメタ
ノール）で溶解し、シリカゲルカラム及び溶出溶媒（ク
ロロホルム；メタノール＝９８：２）を用い、高速液体
クラマトグラフイー（センシュ−科学社製）で１４α−
ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，６，１７−トリ
オンを溶出し、分取した。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、特定の生物的活性を有
し医薬品の原料として有用な６β, １４α−ジヒドロキ
シ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン及び１４α
ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，６，１７−トリ
オンの生産性が高く、単離しにくい副生成物を含まない
ので、この化合物をより効率的に製造できる。
し医薬品の原料として有用な６β, １４α−ジヒドロキ
シ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン及び１４α
ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，６，１７−トリ
オンの生産性が高く、単離しにくい副生成物を含まない
ので、この化合物をより効率的に製造できる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】
【化１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (3)
- 【請求項１】マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
ｍ）属に属し、４−アンドロステン−３，１７−ジオン
を水酸化し６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンドロ
ステン−３，１７−ジオンを生成する能力を有する微生
物を４−アンドロステン−３，１７−ジオンを含有する
培地にて培養し、培養物より６β, １４α−ジヒドロキ
シ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを採取する
ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
ｍ）属に属し、４−アンドロステン−３，１７−ジオン
を水酸化し、６β, １４α−ジヒドロキシ−４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンを生成する能力を有する微
生物。 - 【請求項３】４−アンドロステン−３，１７−ジオン
を、微生物で、水酸化し、６β，１４α−ジヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，１７−ジオンとした後、酸
化して１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，
６，１７−トリオンを製造する方法において、マイロセ
シウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属し、４−アン
ドロステン−３，１７−ジオンを水酸化し６β, １４α
−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ンを生成する能力を有する微生物を４−アンドロステン
−３，１７−ジオンを含有する培地にて培養し、培養物
より６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン
３，１７−ジオンを採取する工程を含むことを特徴とす
る１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，６，
１７トリオンの製造方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5272912A JPH06225793A (ja) | 1992-11-27 | 1993-10-06 | ６β，１４α−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの新規製造法 |
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