JPH06225791A - １４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの新規製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】微生物による４−アンドロステン−３，１７−
ジオンからの１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン
−３，１７−ジオンの高効率な製造法。 【構成】ユ−ロチウム属、スコピュラリオプシス属、ア
ンブリヨスポリウム属、コックリオボラス属、ジィゴリ
ンチュス属、グロエロセルコスポラ属、コリネスポラ
属、モルチィエレラ属、ドラトマイセス属、コリナスカ
ス属、クラドスポリウム属、ピィトマイセス属、ゾフィ
エラ属、及びムコ−ル・シルシネロイデス・エフ・シル
シネロイデス、ムコ−ル・ヂモルフォスポラス、ムコ−
ル・ジャパニカス、ムコ−ル・アンビグウスに属し４−
アンドロステン−３，１７−ジオンを水酸化し１４α−
ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを
生成する能力を有する微生物を４−アンドロステン−
３，１７−ジオンを含む培地にて培養し、培養物より１
４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジ
オンを採取することを特徴とする１４α−ヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ホルモンの合成の為に
利用されるアンドロステン誘導体、１４α−ヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの新規製造法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、下記構造式で示される１４α−ヒ
ドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの製
造法としては、クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）
属に属する菌株、例えばクルブラリア・ルナタ（Ｃｕｒ
ｖｕｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａ）を栄養源含有培地で培
養し、培養物より１４α−ヒドロキシ−４−アンドロス
テン−３，１７−ジオンを採取する方法（ソビエト特許
第８０１５１７号「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ α−
ｈｙｄｒｏｘｙ−ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅ−ｄｉｏｎｅ
ｂｙ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｈｙｄｒｏｌ
ｙｓｉｓ ｏｆａｎｄｒｏｓｔｅｎｅ−ｄｉｏｎｅ ｕ
ｓｉｎｇ Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａ ｂａ
ｃｔｅｒｉａ，ｉｎ ａｑ．ｏｒ ａｌｃｏｈｏｌｉｃ
ｍｅｄｉｕｍ」）が知られている。しかし、この方法
によると、出発物質の４−アンドロステン−３，１７−
ジオンの濃度を１．５ｇ／ｌ以上にすると、生成物の１
４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジ
オンの収量が低く、同時に生成する副生成物の為品質並
びに精製収率が低下する等の問題がある。

【０００３】

【化１】

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、さらに効率
のよい１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，
１７−ジオンの製造法を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率の良
い１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７
−ジオンの製造法を目的として多数の微生物を財団法人
醗酵研究所より入手し、その生成効率を調べたところ、
ユ−ロチウム属、スコピュラリオプシス属、アンブリヨ
スポリウム属、コックリオボラス属、ジィゴリンチュス
属、グロエロセルコスポラ属、コリネスポラ属、モルチ
ィエレラ属、ドラトマイセス属、コリナスカス属、クラ
ドスポリウム属、ピィトマイセス属、又はゾフィエラ属
に属する微生物、及びムコ−ル・シルシネロイデス・エ
フ・シルシネロイデス、ムコ−ル・ヂモルフォスポラ
ス、ムコ−ル・ジャパニカス、ムコ−ル・アンビグウス
が効率良く１４α−ヒドロキシ−４−−アンドロステン
−３，１７−ジオンを生産していることを見出した。本
発明を概説すれば、本発明の第一の発明は、ユ−ロチウ
ム属、スコピュラリオプシス属、アンブリヨスポリウム
属、コックリオボラス属、ジィゴリンチュス属、グロエ
ロセルコスポラ属、コリネスポラ属、モルチィエレラ
属、ドラトマイセス属、コリナスカス属、クラドスポリ
ウム属、ピィトマイセス属、ゾフィエラ属、及びムコ−
ル・シルシネロイデス・エフ・シルシネロイデス、ムコ
−ル・ヂモルフォスポラス、ムコ−ル・ジャパニカス、
ムコ−ル・アンビグウスに属し、４−アンドロステン−
３，１７−ジオンを水酸化し１４α−ヒドロキシ−４−
アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する能力を有
する微生物を４−アンドロステン−３，１７−ジオンを
含む培地にて培養し、培養物より１４α−ヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンを採取すること
を特徴とする。

【０００６】前記培養物からこの生産物を単離し、理化
学的性質を調べた結果、１４α−ヒドロキシ−４−アン
ドロステン−３，１７−ジオンの標準品と一致した。

【０００７】〔請求項１〕で用いられる微生物は、ユ−
ロチウム属、スコピュラリオプシス属、アンブリヨスポ
リウム属、コックリオボラス属、ジィゴリンチュス属、
グロエロセルコスポラ属、コリネスポラ属、モルチィエ
レラ属、ドラトマイセス属、コリナスカス属、クラドス
ポリウム属、ピィトマイセス属、又はゾフィエラ属に属
し、４−アンドロステン−３，１７−ジオンを水酸化
し、１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１
７−ジオンを生成する能力を有する微生物であれば特に
制限はなく、例えば次のものがあげられる。 ユ−ロチウム・チェバリエリ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｃｈ
ｅｖａｌｉｅｒｉ）ＩＦＯ ４３３４ スコピュラリオプシス・ブレビカウリス・バ−・アルバ
（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｂｒｅｖｉｃａｕｌ
ｉｓ ｖａｒ．ａｌｂａ） ＩＦＯ ５４４７ アンブリヨスポリウム・ボトリチス（Ａｍｂｌｙｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ ｂｏｔｒｙｔｉｓ） ＩＦＯ ５９３８ コックリオボラス・ルナ−タ（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕ
ｓ ｌｕｎａｔａ）ＩＦＯ ６２８９ ジゴリンチュス・エクスポネンス・バ−・スミチ−（Ｚ
ｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｅｘｐｏｎｅｎｓ ｖａｒ．
ｓｍｉｔｈｉｉ） ＩＦＯ ６６６５ グロエロセルコスポラ・ソルギ−（Ｇｌｏｅｒｏｃｅｒ
ｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｒｇｈｉ） ＩＦＯ ６６８６ コックリオボラス・ヘテロストロフス（Ｃｏｃｈｌｉｏ
ｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ） ＩＦＯ
７３５５ コリネスポラ・ビグニコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ
ｖｉｇｎｉｃｏｌａ）ＩＦＯ ７４１６ コリネスポラ・メロニス（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｍ
ｅｌｏｎｉｓ） ＩＦＯ ７４８４ スコピュラリオプシス・アクレモニウム（Ｓｃｏｐｕｌ
ａｒｉｏｐｓｉｓ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ） ＩＦＯ
８１１５ モルチエレラ・バ−チシラタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ
ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ） ＩＦＯ ８５７５ ドラトマイセス・プトレヂニス（Ｄｏｒａｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ） ＩＦＯ ９３８４ コリナスカス・ノボグイニ−ンシス（Ｃｏｒｙｎａｓｃ
ｕｓ ｎｏｖｏｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）ＩＦＯ ９５５
６ クラドスポリウム・カルポフィラン（Ｃｌａｄｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ ｃａｒｐｏｐｈｉｒｕｍ） ＩＦＯ ９６４
５ ピトマイセス・マイヂカス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｍ
ａｙｄｉｃｕｓ） ＩＦＯ ３００１５ ゾフィエラ・ロンギカウダ−タ（Ｚｏｐｈｉｅｌｌａ
ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔａ） ＩＦＯ ３０２９６

【０００８】〔請求項２〕で用いられる微生物は、ムコ
−ル・シルシネロイデス・エフ・シルシネロイデス、ム
コ−ル・ヂモルフォスポラス、ムコ−ル・ジャパニカ
ス、ムコ−ル・アンビグウスに属し、４−アンドロステ
ン−３，１７−ジオンを水酸化し、１４α−ヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成する能
力を有する微生物であれば特に制限はなく、例えば次の
ものがあげられる。 ムコ−ル・シルシネロイデス・エフ・シルシネロイデス
（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｃ
ｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ ４５５４ ムコ−ル・ヂモルフォスポラス（Ｍｕｃｏｒ ｄｉｍｏ
ｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ）ＩＦＯ ４５５６ ムコ−ル・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃ
ｕｓ）ＩＦＯ ４５６９ ムコ−ル・アンビグウス（Ｍｕｃｏｒ ａｍｂｉｇｕｕ
ｓ）ＩＦＯ ６７４２

【０００９】本発明による１４α−ヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオンの生産は、炭素源、窒
素源、無機物その他使用菌株の必要とする微量の栄養素
をほどよく含有する通常の培地に基質となる４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンを添加し培養する。炭素源
としては、グリセリンの他に、例えばグルコース、フラ
クトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、
デキストリン、澱粉、水飴、糖蜜、油脂類、有機酸類な
どを用いることができる。窒素源としては、例えば大豆
粉、綿実粉、コーンスチープリカー、ペプトン、カゼイ
ン、カザミノ酸、酵母エキス、胚芽、肉エキス、尿素、
アミノ酸、アンモニウム塩などの有機窒素化合物や無機
窒素化合物が使用可能である。さらに無機物としてはナ
トリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム
塩、リン酸塩などの無機塩類が単独あるいは適宜組み合
わせて用いられる。さらに必要に応じて鉄塩、銅塩、亜
鉛塩、マンガン塩、コバルト塩などの重金属、ビオチ
ン、ビタミンＢ₁ などのビタミン類を適宜添加してもよ
い。また、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコー
ルエーテルなどの界面活性剤を培地に加えてもよい。

【００１０】培養法としては、微生物の培養に用いられ
る一般的方法が採用されるが、液体培養法、特に振盪ま
たは深部通気攪拌培養が最適である。培養温度は１０℃
〜３３℃の範囲で可能であるが通常１５〜３０℃が好ま
しく、培養ｐＨは通常２〜８が好ましい。また培養日数
は培養条件によって異なるが、通常１〜１０日である。
培地中の４−アンドロステン−３，１７−ジオン濃度は
微生物の生育を阻害しない濃度であれば特に制限はな
く、最高１０％（Ｗ／Ｖ）程度まで可能であるが、通常
０．０２〜２．０％濃度で、好ましくは０．１〜１．５
％、より好ましくは０．２〜１．０％濃度になるように
添加するのがよい。また４−アンドロステン−３，１７
−ジオンの添加時期は、培養開始時に培地の一部として
存在させてもよいし、培養中連続的または間欠的に添加
してもよい。培養中、グルコースやマルトースあるいは
シュークロースなどの炭素源またはペプトンや酵母エキ
スなどの窒素源を添加する場合、これに伴って添加して
もよい。

【００１１】培養終了後、培養物中に蓄積された１４α
−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン
を培養物中から採取する為には本物質の理化学的性質を
利用することにより行う。即ち、１４α−ヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンは菌体を含む不
溶性画分及び培養濾液中に含まれるので培養物を遠心分
離または濾過により培養菌体を含む不溶性画分と濾液と
に分離してから１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステ
ン−３，１７−ジオンを抽出採取することができる。ま
た、培養物を直接非親水性有機溶媒、たとえばクロロホ
ルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、メチルイ
ソブチルケトンなどの有機溶媒で抽出することにより分
離し、採取することもできる。培養濾液から１４α−ヒ
ドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを分
離採取するには、培養濾液を活性炭、粉末セルロース、
吸着性樹脂などの担体に吸着させ、次いで適宜の溶媒で
溶出することができる。これらの担体から１４α−ヒド
ロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを溶出
するためには、水溶性有機溶剤例えば含水アルコールや
含水アセトンなどで溶出することができる。菌体からの
１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−
ジオンの分離採取はアセトン、エタノールなどの親水性
有機溶媒で抽出し、ステロイド類の通常知られた分離精
製法を用い、さらに精製することができる。例えばシリ
カゲル、活性アルミナ、吸着性樹脂などの担体を用いる
カラムクロマトグラフィーによる方法である。担体とし
てシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーでは、
溶出溶媒としてクロロホルム、酢酸エチル、アセトン、
メタノール、水などを単独あるいは適宜組み合わせた混
合溶媒を用いて溶出することができる。また高速液体ク
ロマトグラフィーによる分離精製も有利に利用できる。
用いる担体としてはシリカゲル、オクタデシル基、アミ
ノ基、オクチル基、などが結合した化学結合型シリカゲ
ル、またはポリスチレン系ポーラスポリマーゲルなどを
用いる。移動層としてはヘキサン、イソプロピルアルコ
ール、含水メタノール、含水アセトニトリルなどを用い
て溶出することができる。また液相間の分配に基づく分
離、精製法である交流分配法も有利に利用できる。分配
液系としてはヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリル
系、クロロホルム−メタノール−水系などの混合溶媒を
用いることができる。

【００１２】

【実施例】以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

【００１３】実施例 スコピュラリオプシス・アクレモニウム（Ｓｃｏｐｕｌ
ａｒｉｏｐｓｉｓａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ）ＩＦＯ ８
１１５の斜面培養から一白金耳を１０ｍｌの液体培地
（麦芽エキス３．０％、ポリペプトン２．０％、大豆粉
１．０％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂
Ｏ ０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ））を入れた
大型試験管に接種し、２７℃で３日間、振盪し、種培養
液を得た。この種培養液１．５ｍｌを５０ｍｌの液体培
地Ａ（砂糖５％、コ−ンスチ−プリカ−２．０％、大豆
粉１．０％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ ０．５％、４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ン０．５％（以上の濃度はすべて Ｗ／Ｖ））を入れた
５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２７℃で４日
間、振盪培養を行った。

【００１４】このようにして得た培養液を高速液体クロ
マトグラフ（ＨＰＬＣ）で分析し、生成した１４α−ヒ
ドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを定
量した。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。 カラム：キャプセルパック Ｃ１８（６．０×２５０ｍ
ｍ）資生堂製 溶 媒：アセトニトリル／水＝２０〜５０％ 検 出：２４０ｎｍに於ける吸光度 流 速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ 温 度：４０℃ 下記表１に示す微生物を使用し、上記と同様に１４α−
ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを
生成させ、上記と同様に分析定量した結果を表１にまと
めて示す。

【００１５】

【表１】

【００１６】なお、１４α−ヒドロキシ−４−アンドロ
ステン−３，１７−ジオンの精製は次の様に行うことが
出来る。実施例記載の培地及び培養条件で培養したスコ
ピュラリオプシス・アクレモニウム（Ｓｃｏｐｕｌａｒ
ｉｏｐｓｉｓ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ）ＩＦＯ８１１
５の培養液４００ｍｌから濾過により菌体を得、２００
ｍｌのアセトンで３回抽出し、濃縮後、５０ｍｌのジク
ロロメタンで３回抽出し、濃縮乾固する。乾固物をジク
ロロメタンに溶解後、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィ−に供した。２％（Ｖ／Ｖ）メタノ−ルを含むジクロ
ロメタンで溶出、分画を行い、各画分を薄層クロマトグ
ラフィ−（ＴＬＣ）にて分析を行った。以下にＴＬＣの
条件を示す。 吸 着 剤：キ−セルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ） ６
０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｋ社製） 展開溶媒 ：酢酸エチル 検出 ：２５４ｎｍ １４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−
ジオン画分を濃縮乾固させ、更に真空乾燥を行い、１４
α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ン純品結晶９８１ｍｇを得た。得られた結晶をＩＲ、Ｍ
Ｓ、ＮＭＲ、により分析し、１４α−ヒドロキシ−４−
アンドロステン−３，１７−ジオンの標品と比較し、１
４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジ
オンと同定した。

【発明の効果】本発明によれば、１４α−ヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンの生産性が著し
く高く、この化合物をより効率的に製造できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ユ−ロチウム属、ゾフィエラ属、スコ
   ピュラリオプシス属、アンブリヨスポリウム属、コック
   リオボラス属、ジィゴリンチュス属、グロエロセルコス
   ポラ属、コリネスポラ属、モルチィエレラ属、ドラトマ
   イセス属、コリナスカス属、クラドスポリウム属、又は
   ピィトマイセス属に属し、４−アンドロステン−３，１
   ７−ジオンを水酸化し１４α−ヒドロキシ−４−アンド
   ロステン−３，１７−ジオンを生成する能力を有する微
   生物を、４−アンドロステン−３，１７−ジオンを含む
   培地にて培養し、培養物より１４α−ヒドロキシ−４−
   アンドロステン−３，１７−ジオンを採取することを特
   徴とする方法。
2. 【請求項２】 ムコ−ル・シルシネロイデス・エフ・
   シルシネロイデス、ムコ−ル・ヂモルフォスポラス、ム
   コ−ル・ジャパニカス、又はムコ−ル・アンビグウスに
   属し、４−アンドロステン−３，１７−ジオンを水酸化
   し１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７
   −ジオンを生成する能力を有する微生物を、４−アンド
   ロステン−３，１７−ジオンを含む培地にて培養し、培
   養物より１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−
   ３，１７−ジオンを採取することを特徴とする方法。