CN108753626A - 一株生物合成16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的菌株及其应用 - Google Patents

一株生物合成16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株能将19‑去甲‑4‑雄烯二酮有效转化为16β‑羟基‑19‑去甲‑4‑雄烯二酮的黑曲霉(Aspergillus niger)(保藏编号：CGMCC No.15662)及其在转化甾体药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明所述的菌株具有生长迅速，易于培养的特点，该菌株可高效的将19‑去甲‑4‑雄烯二酮有效转化为16β‑羟基‑19‑去甲‑4‑雄烯二酮，并且产物易于萃取分离，终产物纯度高。经检测，19‑去甲‑4‑雄烯二酮的生物转化率为80～90％，产物提取得率75～80％，16β‑羟基‑19‑去甲‑4‑雄烯二酮产品纯度大于99.5％。

Description

一株生物合成16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的菌株及其 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株生物转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。
背景技术
19-去甲-4-雄烯二酮(CAS号：734-32-7)是炔诺酮、睾丸素丙酸酯、诺龙苯丙酸酯的中间体，通过在母核上引入羟基可大大增强其抗炎活性。其生产方式主要有传统的化学合成法、半合成法、生物转化法三类。生物转化法相比于化学方法减少了合成步骤、降低了能耗，并大幅削减了污染物的排放，属于先进的清洁生产工艺路线。至今已经报道Penicillium decumbens(Mao,S.；Zhang,L.；Ge,Z.；Wang,X.；Li,Y.；Liu,X.；Liu,F.；Lu,F.,Microbial hydroxylation of steroids by Penicillium decumbens.Journal ofMolecular Catalysis B Enzymatic 2017,133.)能够转化19-去甲-4-雄烯二酮生成的羟化产物有：1α-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮和1α,15β-二羟基-19-去甲-4-雄烯二酮；雄甾-4-烯-3,17-二酮转化得到1α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮和1α,6β-二羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮；表达突变体P450BM3酶(P450BM3酶来源于Bacillus megaterium)的工程化红球菌菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮为16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮(Venkataraman,H.；Poele,E.M.T.；K.Z.；Vermeulen,N.；Commandeur,J.N.M.；Geize,R.V.D.；Dijkhuizen,L.,Biosynthesis of a steroid metabolite by an engineered Rhodococcuserythropolis strain expressing a mutant cytochrome P450BM3enzyme.AppliedMicrobiology&Biotechnology 2015,99(11),4713-4721.)。
发明内容
本发明目的在于提供一株可高效转化19-去甲-4-雄烯二酮生成16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，以及利用该菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮生成16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的方法，能达到高底物投料量、高底物转化率的要求。
本发明从树皮中筛选一株黑曲霉(Aspergillus niger)菌株TCCCC 41690，该菌株已于2018年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号：CGMCC No.15662，分类命名：黑曲霉Aspergillus niger。
本发明提供的黑曲霉CGMCC No.15662可应用于生物转化甾体药物，尤其是应用于生物转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮。
利用上述黑曲霉菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的方法，包括菌株发酵和生物转化，首先制备黑曲霉CGMCC No.15662菌株的发酵培养液，再向发酵培养液中加入预先用有机溶剂溶解的底物19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮，在25～37℃、150～220r/min的条件下转化3-9天，即得含有产物16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的转化液。
优选的，所述黑曲霉的发酵培养基组成为：葡萄糖20～50g/L；KCl 0.3～1g/L；玉米浆10～30g/L；K2HPO4 0.5～5.0g/L；FeSO4 0.01～0.1g/L；MgSO4·7H2O 0.1-1g/L；NaNO30.5～3.0g/L；灭菌前调培养基的pH至5.5～6.5，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
优选的，所述发酵培养液的制备：向发酵培养基中加入黑曲霉，使其孢子终浓度为5×106～1×108个/mL，于25～35℃、150～220r/min的培养条件下培养22～26h，得到发酵培养液。
优选的，所述底物的用量为加入发酵培养液后使底物终浓度质量比为0.2-5g/L。
优选的，所述有机溶剂的用量为发酵培养液总体积的2～6％。
优选的，所述有机溶剂为乙醇、甲醇、DMSO、甘油、二甲基亚砜中的至少一种。
所述转化液中的产物16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮经过进一步的分离纯化可获得高纯度产物晶体。所述分离纯化的方法包括但不限于惯常使用的过滤、萃取、层析、结晶、色谱等及其可能的组合。
有益效果：
本发明首次发现一株黑曲霉菌株可高效转化19-去甲-4-雄烯二酮生成16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮，并且通过培养和转化的优化后能实现高底物投料量(5g/L)、高底物转化率(80-90％)、高产物得率等效果，与表达突变型P450BM3酶的工程化红球菌(投料量1g/L，转化率35％，Venkataraman,H.et al)相比转化率优势很明显。
本发明黑曲霉菌株具有生长迅速、易于培养的特点，该菌株可高效地将19-去甲-4-雄烯二酮有效转化为16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮，并且产物易于萃取分离，终产物纯度高。经检测，19-去甲-4-雄烯二酮的生物转化率为80-90％，产物提取得率75～80％，16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮产品纯度大于99.5％。
附图说明
图1：19-去甲-4-雄烯二酮羟基化反应式。
图2：实施例2的产物16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮在转化液中的高效液相色谱图。
图3：实施例2的产物16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的1H-NMR核磁共振谱图。
图4：实施例2的产物16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的13C-NMR核磁共振谱图。
图5：实施例2的产物16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的晶体衍射图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明提供一种黑曲霉菌株(保藏编号CGMCC No.15662)应用于生物转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的具体实施方式如下，还包括了对产物进一步的分离纯化和检测：
(1)取黑曲霉CGMCC No.15662接种于活化培养基，温度25～35℃，培养4～7天，得活化后的黑曲霉。
(2)制备黑曲霉菌株的发酵培养液：取活化后的黑曲霉接种于发酵培养基，使其孢子终浓度为5×106～1×108个/mL，于25～35℃、150～220r/min的培养条件下培养22～26h，得到发酵培养液。
(3)生物转化：预先用乙醇、甲醇、DMSO、甘油、二甲基亚砜等有机溶剂溶解底物19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮，投入步骤(2)得到的发酵培养液中，使底物终浓度质量比为0.2-5g/L，在25～37℃，150～220r/min的条件下转化3-9天，即得转化液。
(4)产物的分离纯化：将步骤(3)的转化液与有机溶剂混合萃取30～60min，将萃取物加入柱层析硅胶进行吸附，干法上样，柱层析分离，收集组分进行TLC检测，目标组分浓缩，再进行1～3次柱层析分离，浓缩后采用重结晶方法获得产物晶体。
(5)产物的检测与鉴定：将分离纯化后的产物晶体经过质谱、13C NMR和1H NMR及晶体衍射等分析，确认所得产物即为16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮。
将步骤(3)的转化液用等体积乙酸乙酯萃取3次，并通过0.22μm的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮和生成产物的含量。HPLC条件为色谱仪：Agilent 1260；色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测器：Agilent 1260variable wavelength detector；流动相:乙腈:水＝70:30；流速：0.8mL/min；进样量：10μL；柱温：25℃。
经检测，19-去甲-4-雄烯二酮的生物转化率为80-90％，产物提取得率75～80％，16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮产品纯度大于99.5％。
优选的，步骤(1)中所述活化培养基的组成为：土豆200g/L；葡萄糖20g/L；琼脂粉20g/L；pH自然，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
优选的，步骤(2)中所述发酵培养基的组成为：葡萄糖20～50g/L；KCl 0.3～1g/L；玉米浆10～30g/L；K2HPO4 0.5～5.0g/L；FeSO4 0.01～0.1g/L；MgSO4·7H2O 0.1-1g/L；NaNO3 0.5～3.0g/L；灭菌前调培养基的pH至5.5～6.5，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
优选的，步骤(3)中有机溶剂的添加量为发酵液总体积的2～6％。
以下将进一步列举几种较佳实施方式。
实施例1：
黑曲霉菌种的培养及其对19-去甲-4-雄烯二酮的转化，步骤如下：
(1)取菌种黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No.15662接种于活化培养基，培养条件：温度25℃，培养4天，得活化后的黑曲霉；活化培养基组成如下：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然；
(2)取活化后的黑曲霉接种于发酵培养基中，使培养基中的孢子浓度达到5×106个/mL，于25℃、150r/min的培养条件下培养24h。发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L；KCl0.3g/L；玉米浆10g/L；K2HPO4 0.5g/L；FeSO4 0.01g/L；MgSO4·7H2O 0.1g/L；NaNO3 0.5g/L；灭菌前调培养基的pH至5.5，在115℃高压蒸汽下灭菌20min；
(3)将预先用甲醇溶解的底物19-去甲-4-雄烯二酮投入到菌体发酵液中，使底物终浓度为5g/L，甲醇添加量为培养基总体积的2％，于25℃、150r/min、pH为5.5的培养条件下转化9天。分离纯化产物进行HPLC分析，得到转化率为80.58％，产物收率为77％，纯度99.8％。
实施例2：
黑曲霉菌种的培养及其对19-去甲-4-雄烯二酮的转化，步骤如下：
(1)取菌种黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No.15662接种于活化培养基，培养条件：温度28℃，培养5天，得活化后的黑曲霉；。
(2)取活化后的黑曲霉，用0.9％无菌生理盐水洗下其孢子，然后接种于发酵培养基中，使培养基中的菌体浓度达到5×107个/mL，于28℃、180r/min的培养条件下培养24h。发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L；KCl 1g/L；玉米浆20g/L；K2HPO4 3g/L；FeSO4 0.02g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；NaNO3 2g/L；灭菌前调培养基的pH至6.0，在115℃高压蒸汽下灭菌20min；
(3)将预先用乙醇溶解的底物19-去甲-4-雄烯二酮投入到菌体发酵液中，使底物终浓度为3g/L，乙醇添加量为发酵液总体积的4％，在28℃、180r/min、pH为6.0的培养条件下转化6天。分离纯化产物进行HPLC分析，得到转化率为86.76％，产物收率为76％，产物纯度99.6％。
实施例3：
黑曲霉菌种的培养及其对19-去甲-4-雄烯二酮的转化，步骤如下：
(1)取菌种黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No.15662接种于活化培养基，培养条件：温度35℃，培养7天，得活化后的黑曲霉；
(2)取活化后的黑曲霉，用0.9％无菌生理盐水洗下其孢子，接种于发酵培养基中，使培养基中的孢子浓度达到1×108个/mL，于35℃、220r/min的培养条件下培养24h。发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L；KCl 1g/L；玉米浆30g/L；K2HPO4 5g/L；FeSO4 0.05g/L；MgSO4·7H2O 1g/L；NaNO3 3g/L；灭菌前调培养基的pH至6.5，在115℃高压蒸汽下灭菌20min；
(3)将提前用乙醇溶解的底物19-去甲-4-雄烯二酮投入到菌体发酵液中，使底物终浓度为2g/L，乙醇添加量为培养基总体积的6％，在35℃、220r/min、pH为6.5的培养条件下转化4天。提取产物进行HPLC分析，得到转化率为90.12％，产物收率为80％，产物纯度99.8％。

Claims (10)

1.一株黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，其保藏编号为CGMCC No.15662。
2.权利要求1所述的黑曲霉菌株在生物转化甾体药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述黑曲霉用于生物转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮。
4.利用权利要求1所述的黑曲霉菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的方法，其特征在于，包括菌株发酵和生物转化，首先制备黑曲霉CGMCCNo.15662菌株的发酵培养液，再向发酵培养液中加入预先用有机溶剂溶解的底物19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮，在25～37℃、150～220r/min的条件下转化3-9天，即得含有产物16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的转化液。
5.如权利要求4所述的黑曲霉菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的方法，其特征在于，所述黑曲霉的发酵培养基组成为：葡萄糖20～50g/L；KCl0.3～1g/L；玉米浆10～30g/L；K2HPO4 0.5～5.0g/L；FeSO4 0.01～0.1g/L；MgSO4·7H2O0.1-1g/L；NaNO3 0.5～3.0g/L；灭菌前调培养基的pH至5.5～6.5，在115℃高压蒸汽下灭菌20min。
6.如权利要求4所述的黑曲霉菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的方法，其特征在于，所述发酵培养液的制备：向发酵培养基中加入黑曲霉，使其孢子终浓度为5×106～1×108个/mL，于25～35℃、150～220r/min的培养条件下培养22～26h，得到发酵培养液。
7.如权利要求4所述的黑曲霉菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的方法，其特征在于，所述底物的用量为加入发酵培养液后使底物终浓度质量比为0.2-5g/L。
8.如权利要求4所述的黑曲霉菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的方法，其特征在于，所述有机溶剂的用量为发酵培养液总体积的2～6％。
9.如权利要求4所述的黑曲霉菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇、甲醇、DMSO、甘油、二甲基亚砜中的至少一种。
10.如权利要求4所述的黑曲霉菌株转化19-去甲-4-雄烯二酮生产16β-羟基-19-去甲-4-雄烯二酮的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取黑曲霉CGMCC No.15662接种于活化培养基，温度25～35℃，培养4～7天，得活化后的黑曲霉；
(2)制备黑曲霉菌株的发酵培养液：取活化后的黑曲霉接种于发酵培养基，使其孢子终浓度为5×106～1×108个/mL，于25～35℃、150～220r/min的培养条件下培养22～26h，得到发酵培养液；
(3)生物转化：预先用有机溶剂溶解底物19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮，投入步骤(2)得到的发酵培养液中，使底物终浓度质量比为0.2-5g/L，在25～37℃，150～220r/min的条件下转化3-9天，即得转化液；有机溶剂的添加量为发酵液总体积的2～6％；
(4)产物的分离纯化：将步骤(3)的转化液与有机溶剂混合萃取30～60min，将萃取物加入柱层析硅胶进行吸附，干法上样，柱层析分离，收集组分进行TLC检测，目标组分浓缩，再进行1～3次柱层析分离，浓缩后采用重结晶方法获得产物晶体。
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