CN1534032A

CN1534032A - 一种高效制备紫杉醇的方法

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Publication number: CN1534032A
Application number: CNA2004100135594A
Authority: CN
Inventors: 祖元刚; 薛艳华; 史权; 付玉杰; 唐中华; 祖柏实; 韩梅; 刘丽娜
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2004-02-18
Filing date: 2004-02-18
Publication date: 2004-10-06
Anticipated expiration: 2024-02-18
Also published as: CN1227243C

Abstract

本发明涉及一种高效制备紫杉醇的方法。其特征在于将鲜物料进行匀浆空化生物半合成，再经负压空化混旋生物半合成及负压空化混旋两相培养处理；有机相浓缩至干，水相过滤得水相滤液，滤渣加入溶媒进行负压空化混旋固液萃取，合并萃取液，浓缩后与有机相浓缩物及水相滤液合并，加入柠檬酸或食草动物的胆汁经负压空化混旋处理，冷冻浓缩；浓缩物加入甲醇溶解，置入乙腈中，离心，活性炭脱色，得液体用乙酸乙酯萃取，萃取液水洗至中性，减压浓干。浓缩物用乙腈溶解，沉淀析出10－脱乙酰基巴卡亭III，母液浓缩分别经氧化铝柱层析和制备型高效液相层析及重结晶得紫杉醇晶体。

Description

一种高效制备紫杉醇的方法

所属技术领域

本发明涉及一种高效制备紫杉醇的方法，特别涉及一种鲜法匀浆高效制备紫杉醇的方法。

背景技术

紫杉醇(paclitaxel)是从红豆杉属植物中提取的一种具有高效抗癌活性的二萜类化合物。1977年被确定为抗癌的候选药物开始作临床实验，随后发现紫杉醇对多种人体肿瘤有很强的活性。1979年Schiff和Horwitz(J Natural Prod.，1979，277，665-667)阐明了紫杉醇的独特药理作用机制后引起了科学家们极大兴趣。经过毒理研究和多期临床试验，1992年12月29日，美国食品药品管理局(FDA)批准紫杉醇上市，商品名为Taxol。

紫杉醇的来源主要有以下几个途径：

(1)全合成，1994年获得成功，合成过程需20-30步，总收率低，费用高，只有理论意义，目前尚无商业开发价值；

(2)半合成，由枝叶提取巴卡亭III(BaccatinIII)、10-脱乙酰基巴卡亭III(10-deacetylbaccatinIII)，再半合成紫杉醇，现已实现商业化生产。

(3)植物细胞培养法：红豆杉培养与次生代谢产物合成属于非生长偶联型，因此可采用两段培养法，同时进行营养调控、环境控制、前体饲喂、诱导子调控、两相培养、原位、固定化等等方法来提高紫杉醇的产量。

目前利用细胞大量培养技术生产紫杉醇研究已经进入到生物反应器放大阶段，我国也把红豆杉细胞大量培养研究列入国家“九五”研究计划。美国某公司已经完成4000L的培养技术，正在进行20000L规模的工业放大研究。

(4)微生物培养，目前取得了一定进展，但表达量仍偏低，近期不可能商业化生产。

(5)从天然红豆杉植物中提取紫杉醇，但由于大量砍伐，野生红豆杉数量锐减，急需人工栽培；

(6)红豆杉人工栽培，现已进行广泛种植，几年后可望部分供应紫杉醇生产。

(7)寻找新的资源，最近，我国学者发现与红豆杉科相近缘的三尖杉科植物西双版纳粗榧(Cephalotaxus manii)中也含紫杉醇，但含量较低，在高山三尖杉(C.fortunei)和海南粗榧(C.haina-nensis)和罗汉松科植物大理罗汉松(Podocarpus)茎叶中发现了紫杉醇的类似物巴卡亭(baccatin)。周荣汉等发现我国特有植物白豆杉属(Pseud-otaxus Cheng)白豆杉(P.chienii)中含有紫杉醇及短叶醇bre-vifoliol，。目前为止，红豆杉科5个属中有4个属(红豆杉属、澳洲红豆杉属、白豆杉属及榧属)均有紫杉醇及其同系物。最近，美国俄勒冈州波特兰大学的化学家安杰拉·霍夫曼在美国化学协会举行的会议上宣布说，他们已经从榛树和其真菌中分离出了紫杉醇。

尽管紫杉醇有以上的来源，但到目前为止，市售紫杉醇还主要是从天然和栽培红豆杉的树皮或枝叶中直接提取而得，对于来自植物体的物料在提取之前多采用的是低温烘干或自然风干，研磨成粉末等预处理，再进行提取，组培的材料有些采取是冻干打粉，直接用鲜物料提取的很少，只有Nair(usp.5,279,949，1994)和陈建民(专利号01131862.7，2003)的专利中用的是鲜物料，陈建民将鲜物料打成糊状，之后才加入提取液，Nair(usp.5,478,736，1995)利用含有水的溶媒浸提未经干燥的新鲜枝叶，可以使很多的蜡质、叶绿素和亲脂性化合物留在材料中不被浸提出来，从而减少了浸提液中这些杂质的含量，同时避免了由于干燥所造成的紫杉醇含量的降低和提取成本的升高，进而充分利用有限的资源。此外，在生产过程中，亦存在着原料的采集时间、地点、贮藏方式等几方面均影响紫杉醇的含量，肖国勇等针对东北红豆杉树皮紫杉醇含量随采集时间、储存方式等预处理过程进行动态分析，发现以不同条件保管方式(置阴凉处干燥；堆积放置；露天摊置)的红豆杉树皮中紫杉醇含量的改变非常大，以置阴凉处干燥紫杉醇含量最佳。生长于背阴处的红豆杉，其树皮中紫杉醇含量明显高于同一区域受光照充足的红豆杉树皮，采集于4月的红豆杉树皮中紫杉醇含量明显高于采集于9月的样含量品，红豆杉树皮在常温避光条件下放置一年后，其紫杉醇含量明显降低，而受不同日光照射的红豆杉树皮中紫杉醇含量无显著差异。Nair(usp.5,478,736，1995)在其实验观察到将剪修下来的红豆杉鲜枝叶放置在0-10℃环境条件下，紫杉醇的含量会明显增加。但他们在提取时未能全面考虑这些影响因素，来提高紫杉醇的得率。

目前提取紫杉醇常用方法为渗漉浸提法，此法浸提时间长，提取率低，新发展了超声萃取和超临界流体萃取法，其中的超声萃取可大大缩短初级萃取过程的时间，且萃取可在低温下进行，从而避免了紫杉醇在高温下转化为其它物质而造成收率降低，但超声萃取处理物料量有限，设备昂贵，尚难用于大型工业化生产。超临界流体萃取是一种不污染环境的新技术，在紫杉醇的提取中显示出收率高、省时间等优点，但该方法对设备要求高，操作条件严格，目前还难以进行大量原料的超临界萃取。祖元刚(专利申请号02132922.2；03210970.9，2003；03211143.6，2003)利用种芽提取喜树碱及10-羟基喜树碱过程中以超声空化理论为基础，提出了鲜法匀浆萃取、负压空化混旋固液萃取和负压空化混旋液液萃取理论及生产工艺并自行研究和设计了相应的设备，其设备具有操作简单，快速，萃取效率高，极大地提高了物料中有效成分的提出率，具有普遍的适用性和适用于工业化生产的特点，但在应用于紫杉醇提取领域还尚属空白。

综上所述，在利用植物资源提取紫杉醇过程中除了现有的植物资源短缺外，一个主要的原因在于提取原料的利用率低下，提取工艺严重落后，原料的预处理和提取分离过程中普遍存在紫杉醇的降解或流失，尤其是结合态紫杉醇的大量丢失，前提化合物未加以利用，使得紫杉醇的得率偏低，成本升高，造成资源严重浪费。本发明旨在建立一种利用鲜物料通过生物半合成将物料中大量存在的前体化合物进一步转化为紫杉醇，将结合态的紫杉醇转变成游离态紫杉醇，通过空化强化提取，实现简单而快速的高效制备紫杉醇。

本发明采用的技术方案：

鲜物料经预处理后，在一定温度下进行匀浆空化生物半合成，得匀浆液再经负压空化混旋生物半合成及负压空化混旋两相培养处理后，静止分液，有机相浓缩至干，水相过滤得水相滤液，滤渣加入提取溶媒进行负压空化混旋固液萃取，合并空化混旋萃取液，经减压浓缩后回收提取溶媒得浓缩液，浓缩液与有机相浓缩物及水相滤液合并，加入柠檬酸或食草动物的胆汁经负压空化混旋处理，冷冻浓缩，浓缩物加入等体积甲醇，缓慢置入乙腈中，静止，离心，得离心液，经活性炭静止脱色，过滤得无色液体，用乙酸乙酯进行等体积萃取，萃取液水洗至中性，减压浓干。浓缩物用乙腈溶解，沉淀析出，过滤得析出物，为10-脱乙酰基巴卡亭III粗品，母液浓缩分别经氧化铝柱层析和制备型高效液相层析及重结晶得紫杉醇晶体。

发明内容：

将榛子、南方红豆杉、东北红豆杉、曼地亚红豆杉、云南红豆杉等的鲜茎皮、根或枝叶在0～30℃条件下避光放置1～15天，经匀浆空化生物半合成，利用鲜物料自身所具有的丰富的紫杉醇前体与高效的生物酶体系，在生物半合成培养液中同时加入半合成前体或诱导子或混合糖原或其协同配伍，通过匀浆机刀片的高速切割与搅拌所产生的气泡的瞬间崩解与溃灭时产生的空化效应、扰动效应，强化紫杉醇的生物半合成，匀浆空化生物半合成时间为3～30分钟，温度为20-29℃，料液比为1∶8～1∶15，匀浆空化生物半合成培养液可为水、pH值为4.0-5.8的磷酸缓冲液、B5培养液及B5培养液的改良配方。

将经匀浆空化生物半合成处理的物料转入负压空化罐中进行负压空化混旋生物半合成，利用经匀浆粉碎后的鲜物料中自身所具有丰富的生物半合成前体和高效生物酶体系，同加入的半合成前体或诱导子或混合糖原或其协同配伍，通过负压空化所产生气泡的搅拌效应，空化效应、湍流效应来强化胞内及胞外紫杉醇的生成。负压空化混旋生物半合成的温度在20-29℃，培养时间2～5天，每间隔3～4小时空化一次，每次5～30分钟，其余时间在发酵罐中微混。在培养3-5天时加入有机相包括油酸、邻苯二甲酸，体积分数为0.04～0.5，进行负压空化两相培养，通过负压空化所产生气泡的搅拌效应，空化效应、湍流效应加速紫杉醇进入有机相，从而降低水相中紫杉醇浓度，减少产物的反馈抑制和紫杉醇对自身细胞的毒害作用，进而加速紫杉醇进一步合成。其中的半合成前体可为醋酸钠、苯丙氨酸、苯甲酸钠等，最佳剂量均为0.08～0.2mmol/L。诱导子可为水杨酸、赤霉酸、硝酸银、甲基茉莉酮酸、花生四烯酸及柠檬酸铵，茉莉酸甲酯。混合糖源为蔗糖与麦芽糖体积最佳配比为1∶2。协同配伍为半合成前体的两种或两种以上协同配伍；诱导子的两种或两种以上协同配伍；半合成前体和诱导子的协同配伍；混合糖原同半合成前体或/和诱导子的协同配伍；负压空化其底部进气的气体类型包括空气、氢气、氧气、二氧化碳和氮气，通气量为1-3m³/min。

两相培养处理后，静止分液，有机相浓缩至干，水相过滤得水相滤液，滤渣加入50～95％乙醇、甲醇、丙酮；丙酮∶乙酸乙酯(体积比为：1∶1)或乙醇∶水∶柠檬酸(体积比为：80∶19∶1)等提取溶媒进行负压空化混旋固液萃取，空化时间为10-30分钟，通气量为2-4m³/min，重复2-3次，料液比为1∶5-1∶20，合并空化混旋萃取液，经减压浓缩后回收提取溶媒得浓缩液，浓缩液与有机相浓缩物及水相滤液合并，加入0.1～2％柠檬酸或10-50％食草动物的胆汁经负压空化混旋处理，再经悬浮冷冻浓缩或降膜式渐进冷冻浓缩，浓缩物加入等体积甲醇，缓慢置入乙腈中，离心，得离心液，经活性炭静止脱色，过滤得无色液体，用乙酸乙酯进行等体积萃取，萃取液水洗至中性，减压浓干。浓缩物用乙腈溶解，沉淀析出，过滤得10-脱乙酰基巴卡亭III粗品，母液浓缩分别经氧化铝柱层析和制备型高效液相层析及重结晶得紫杉醇晶体。

实施例1

取南方红豆杉鲜枝叶20kg，在4℃条件下避光放置4天后，加入120kg的纯净水和4.236g的乙酸钠在20-29℃条件下，在自制的匀浆机中匀浆空化生物半合成20分钟，转入自制的空化罐中，培养温度同匀浆空化生物半合成，进行负压空化混旋生物半合成，通入的气体为空气，通气量为2m³/min，每间隔3小时空化一次，每次5分钟，共培养3天，其余时间在发酵罐中微混，在第1天、第2天分别加一次40kg的邻苯二甲酸二丁酯，空化后静止分层取出浓缩，回收有机相，3天后水相过滤得水相滤液，滤渣加入600kg的90％的乙醇空化6分钟，通气量为2.2m³/min，重复3次，合并空化混旋萃取液，经减压浓缩后回收提取溶媒得浓缩液，浓缩液与有机相浓缩物及水相滤液合并，加入柠檬酸1.2kg负压空化混旋处理30分钟，冷冻浓缩，得浓缩物308g，加入300ml甲醇溶解，缓慢置入300ml乙腈中，离心，得离心液，经活性炭静止脱色，过滤得无色液体950ml，用乙酸乙酯进行等体积萃取3次，萃取液水洗至中性，减压浓干。得浓缩物200g，用1.5L乙腈溶解，溶液在0-5℃下放置24h，10-脱乙酰基巴卡亭III沉淀析出，沉淀物再在二氯甲烷/己烷混合液中重结晶得到2.0g纯度为98％白色粉末10-脱乙酰基巴卡亭III，母液浓缩，分别经氧化铝柱层析和制备型高效液相层析及重结晶得纯度为98％紫杉醇晶体0.7g。

实施例2

取东北红豆杉鲜枝叶20kg，在6℃条件下避光放置5天后，加入120kg的B5培养液、29.16g的柠檬酸铵和1.656g水杨酸在20-29℃条件下，在自制的匀浆机中匀浆空化生物半合成25分钟，转入自制的空化罐中，培养温度同匀浆空化生物半合成，进行负压空化混旋生物半合成，通入的气体为氧气，通气量为2m³/min，每间隔3.5h空化一次，每次5分钟，共培养5天，其余时间在发酵罐中微混，在第1天-4天分别加一次20kg的油酸，空化后静止分层取出油酸浓缩，回收有机相，5天后水相过滤得水相滤液，滤渣加入660kg的90％的乙醇空化10分钟，通气量为2.8m³/min，重复3次，合并空化混旋萃取液，经减压浓缩后得浓缩液，浓缩液与有机相浓缩物及水相滤液合并，加入牛胆汁5kg负压空化混旋处理30分钟，冷冻浓缩，得浓缩物350g，加入320ml甲醇溶解，缓慢置入320ml乙腈中，离心，得离心液，经活性炭静止脱色，过滤得无色液体950ml，用乙酸乙酯进行等体积萃取3次，萃取液水洗至中性，减压浓干。得浓缩物223g，用1.6L乙腈溶解，溶液在0-5℃下放置24h，10-脱乙酰基巴卡亭III沉淀析出，沉淀物再在二氯甲烷/己烷混合液中重结晶得到1.9g纯度为98％白色粉末10-脱乙酰基巴卡亭III，母液浓缩，分别经氧化铝柱层析和制备型高效液相层析及重结晶得纯度为98％紫杉醇晶体0.8g。

实施例3

取曼地亚红豆杉鲜枝叶10kg，在4℃条件下避光放置5天后，加入80kg的pH为5.8的磷酸缓冲液、3.2g的β-苯丙氨酸在20-29℃条件下，在自制的匀浆机中匀浆空化生物半合成25分钟，转入自制的空化罐中，培养温度同匀浆空化生物半合成，进行负压空化混旋生物半合成，通入的气体为空气，通气量为2m³/min，每间隔3.5h空化一次，每次5分钟，共培养5天，其余时间在发酵罐中微混，在第1天-4天分别加一次5kg的邻苯二甲酸二丁酯和5kg油酸，其他同实施例2，得98％紫杉醇0.6g。

Claims

1.一种高效制备紫杉醇的方法，其特征是：将鲜物料在一定温度下进行匀浆空化生物半合成，得匀浆液再经负压空化混旋生物半合成及负压空化混旋两相培养处理；静止分液，有机相浓缩至干，水相过滤得水相滤液，滤渣加入提取溶媒进行负压空化混旋固液萃取；合并空化混旋萃取液，经减压浓缩后回收提取溶媒得浓缩液，浓缩液与有机相浓缩物及水相滤液合并，加入柠檬酸或食草动物的胆汁经负压空化混旋处理，冷冻浓缩；浓缩物加入等体积甲醇溶解，缓慢置入等体积乙腈中，离心，得离心液，经活性炭静止脱色，过滤得无色液体，用乙酸乙酯进行等体积萃取，萃取液水洗至中性，减压浓干。浓缩物用乙腈溶解，沉淀析出，过滤得10-脱乙酰基巴卡亭III粗品，母液浓缩分别经氧化铝柱层析和制备型高效液相层析及重结晶得紫杉醇晶体。

2.根据权利要求书1所述的鲜物料包括榛子、南方红豆杉、东北红豆杉、曼地亚红豆杉、云南红豆杉等的茎皮、根或枝叶，并在0～30℃条件下避光放置1～15天。

3.根据权利要求书1所述的匀浆空化生物半合成其特征是：在生物半合成培养液中加入半合成前体或诱导子或混合糖原或其协同配伍，通过匀浆机刀片的高速切割与强力搅拌时所产生的负压气泡的瞬间崩解与溃灭时产生的空化效应、扰动效应作用，强化紫杉醇的生物半合成，其条件为温度：20-29℃，时间：3～30分钟，料液比：1∶4～1∶15。

4.根据权利要求书3所述的生物半合成培养液其特征是：生物半合成培养液为水、pH值为4.0-5.8的磷酸缓冲液、B5培养液及其改良配方。

5.根据权利要求书1所述的负压空化混旋生物半合成其特征是：利用外加入的半合成前体或诱导子或混合糖原或其协同配伍，通过负压空化所产生气泡的搅拌效应，空化效应、湍流效应来强化胞内及胞外紫杉醇的生成，其条件是培养温度为20-29℃，时间2～5天，每间隔3～4小时空化一次，每次5～30分钟，其余时间在发酵罐中微混。

6.根据权利要求书3或5所述的半合成前体为醋酸钠、苯丙氨酸、苯甲酸钠。

7.根据权利要求书3或5所述诱导子为水杨酸、赤霉酸、硝酸银、甲基茉莉酮酸、花生四烯酸及柠檬酸铵，茉莉酸甲酯。

8.根据权利要求书3或5所述混合糖源为蔗糖与麦芽糖。

9.根据权利要求书3或5所述协同配伍为半合成前体的两种或两种以上协同配伍；诱导子的两种或两种以上协同配伍；半合成前体和诱导子的协同配伍；混合糖原同半合成前体或/和诱导子的协同配伍。

10.根据权利要求书1所述的负压空化两相培养是通过负压空化所产生气泡的搅拌效应、空化效应、湍流效应加速紫杉醇进入包括油酸或邻苯二甲酸为主的有机相，降低水相中紫杉醇浓度，减少产物的反馈抑制和紫杉醇对自身细胞的毒害作用，加速紫杉醇合成。且有机相在培养体系中的体积分数为0.04～0.5。

11.根据权利要求书5或10所述的负压空化其底部进气的气体类型包括空气、氢气、氧气、二氧化碳、氮气，通气量为1-3m³/min。

12.根据权利要求书1所述的提取溶媒可为50～95％乙醇、甲醇、丙酮；丙酮∶乙酸乙酯(体积比为1∶1)或乙醇∶水∶柠檬酸(体积比为80∶19∶1)。

13.根据权利要求书1所述的柠檬酸浓度为0.1～2％，食草动物的胆汁浓度为10-50％。

14.根据权利要求书1所述的负压空化混旋固液萃取其特征在于料液比为1∶5-1∶20，在自制的空化罐中空化10-30分钟，通气量为2-4m³/min，重复2-3次。