CN100487131C

CN100487131C - 一种制备人参皂甙Compound-K的方法

Info

Publication number: CN100487131C
Application number: CNB2004100180000A
Authority: CN
Inventors: 周佩; 周伟; 李继扬; 黄海; 冯美卿
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2004-04-27
Filing date: 2004-04-27
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2024-04-27
Also published as: CN1570133A

Abstract

本发明属药学领域，涉及一种制备人参皂甙Compound-K的方法。本发明采用霉菌好气性发酵技术、固定化细胞技术和固定化酶技术，直接以各种人参总皂甙作为底物，发酵转化制备Compound-K，并将其分离纯化，进行含量分析和结构确证。检测结果证实，本方法所得产物符合Compound K结构。本方法简便易操作，成本低，不需要花费人力和财力进行单体皂甙分离，转化率高达15%，易于制药或保健品工业产业化。

Description

一种制备人参皂甙Compound-K的方法

技术领域

本发明属药学领域，涉及一种制备人参皂甙Compound-K的方法，具体涉及Compound-K的分离纯化、结构鉴定和X-Ray分析。

背景技术

人参在我国和东亚的应用已有数千年，作用为滋补强身的药材也已闻名全世界。人参属于五加科(Araliaceae)人参属(Panax)，常用的人参有高丽人参(Panax ginseng C.A.Meyer)在我国即是称之为的普通人参，西洋参(Panax quiquefolium L.)、三七人参(Panaxnotoginseng(Burk)F.H Chen)、竹节参(Panax japonicum C.A.Meyer)等。经过近半世纪的研究从人参植物的根部和其他部位分离了人参皂甙、人参炔醇、人参多糖、多肽、有机酸及酯、甾醇、氨基酸和微量元素，并证明人参皂甙(ginsenoside)是人参功效的主要成分。其作用机理是一些含量较高的皂甙(Rb、Rd、Rg等)作为前药，在体内降解成Rg3、Rh1、Rh2、Compound K等皂甙被机体吸收，从而发挥药理作用。但是这些有效成分在人参中的含量仅为10万分之几，甚至不含。

1972年，I.Yosooka在用土壤细菌水解人参皂甙Rb1、Rb2和Rc获取原人参二醇时意外的发现了Compound-K，并通过元素分析和一些化学方法的分析，推测了其结构(I.Yosooka et al.Chem.Pharm.Bull.1972，20(11)：2418-2421)。近年，生物活性研究发现Compound-K具有抗基因突变(BH.Lee et al.Planta.Med.1998，64：500-503)，抑制肿瘤生长、浸润和转移，诱导细胞调亡等活性(SJ.Lee et al.Cancer lett.1999，144：39-43；Eun-Ah Bae et al.Biol.Pharm.Bull.2002，25(6)：743-747；C.Wakabayashi et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.1998：725-730)，逆转肿瘤细胞的多重耐药，提高联合用药的抗肿瘤效果(H.Hasegawa et al.Plant Med.1995，61：409-413)。然而，由于Compound K含量极低，迄今为止人们无法从人参中分离得到。对Compound-K制备的研究仅停留在从人参单体皂甙(Rb1或Rc)在人或鼠的肠道菌群代谢物中发现该化合物，或者用酶法从Rb1或Rc等单体皂甙进行定向转化，但尚未见其大量制备和生产的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备人参皂甙Compound-K的方法。

本发明采用霉菌好气性发酵技术、固定化细胞技术和固定化酶技术，直接以各种人参总皂甙作为底物，对各种人参皂甙的糖边链选择性切除，从而转化制备Compound-K【20-O-β-D-glucopyranosyl-20-(S)-protopanaxadiol】。本方法简便易操作，成本低，转化率高，利于制药或保健品工业。

本发明采用霉菌好气性发酵技术、固定化细胞技术和固定化酶技术，直接转化人参总皂甙，包括三七茎叶总皂甙，栽培人参总皂甙，西洋参总皂甙等的方法，生成Compound-K，并将其分离纯化，进行含量分析和结构确证。所述Compound-K具有下述结构。

本方法通过下述步骤制备Compound K：

(一)获得转化菌种

按本技术领域常规方法，从野山参种植区收集的土壤中分离霉菌。

(二)发酵

采用的培养基可以是葡萄糖-玉米浆-硫酸铵，麦芽汁，马铃薯汁，基础盐培养基或蔡氏培养基；实验温度为25-35℃，pH：5～6；转化底物及投料量为人参总皂甙，发酵液体积，1-5％投料；菌体生长时间为60-72h，转化时间为40-56h。

本方法采用BioFlo 110 14L全自动发酵罐。

(1)摇瓶发酵：孢子悬浮液直接接入发酵培养基，培养60～72小时，人参总皂甙1～5％投料，进行转化。

(2)发酵罐发酵：孢子悬浮液接入种子培养基中，旋转培养。将种子培养液按5-10％比例接入发酵罐，人参总皂甙1～5％投料，转化40～56小时。

(三)固定化技术：

(1)收集菌体搅成糊状，海藻酸钠包埋法制备固定化细胞。

(2)纯化皂甙糖苷酶，以聚乙烯氧化物为载体制备固定化人参皂甙糖苷酶。

(四)提取分离：

酒精浸提，正丁醇萃取，活性炭脱色，浓缩制得浸膏。上硅胶柱分离，制备HPLC精制后甲醇-水重结晶。

(五)分析检测Compound K：

用TLC，HPLC方法，进行Compound K定性和定量分析。

(五)Compound K结构鉴定：

上述Compound K经熔点、核磁共振(NMR)及单晶X—衍射进行结构确认。结果显示，

无色针晶，mp：162-164℃(甲醇-水)，

结晶数据：

Empirical formula：C₃₆H₆₄O₈·2H₂O Formula weight：658.89

Crystal size：0.508×0.106×0.094mm

colorless，at 293(2)K

Monoclinic：P2(1)，

α＝90°，β＝101.848(4)°，γ＝90°，

，Z＝4，D_X＝1.162Mg m^-3，μ＝0.083mm^-1

核磁共振谱解析其中¹³C、¹H-NMR与X-Ray结果证实，本方法所得产物符合Compound K结构。

表1是Compound-K核磁共振分析数据表。

表1

本方法具有如下优点，

(1)运用霉菌好气性发酵技术将各种人参总皂甙粗提取物中含量较高的皂甙的糖基进行选择性切除，从而获得Compound-K。

(2)由于采用人参总皂甙直接发酵转化，不需要花费人力和财力进行单体皂甙(Rb1、Rc等)的分离，所以成本低。

(3)转化率高，其中，以三七茎叶总皂甙投料计，发酵转化率10—15％，总得率5—8％；以栽培人参总皂甙投料计，发酵转化率5—10％，总得率2—4％)。

(4)发酵培养基简单，转化条件温和，提取分离方便，易于产业化。

附图说明

图1是人参皂甙TLC，

其中，1是三七总皂甙，2是微生物转化后三七总皂甙，

3是转化后三七总皂甙+C-K，4是Compound-k，

5是栽培人参总皂甙，6是转化后人参皂甙，

7是转化后人参皂甙+C-K。

图2是人参皂甙HPLC，

其中，A：人参总皂甙，

B：Compound-K，

C：发酵后人参总皂甙

图3是Compound-K X-Ray结构图，

具体实施方式

实施例1

采集土样烘干，倒入事先灭菌的研钵中研细，涂布于紫外照射过的白纸上，弹到马铃薯平板，28℃培养，挑取霉菌单菌落至斜面培养基培养，进行发酵菌种筛选。

实施例2

黑曲霉(Aspegillus niger)霉菌在蔡氏培养基上生长(28℃，7天)待孢子丰满后接入含葡萄糖-玉米浆-硫酸铵的种子培养基中，25-35℃、200rpm旋转培养。待菌丝体生长茂盛之时，将种子培养液按5-10％比例接入发酵罐，26-28℃，转速200rpm升至800rpm，溶氧20-40％，培养60～72小时。三七茎叶总皂甙2％投料，继续培养40～56小时，进行人参皂甙的转化。HPLC分析，发酵转化率12％，最后提取分离得率5.25％，Compound K含量97％以上。

实施例3

黑曲霉菌(Aspegillus niger)孢子悬浮液接种到含1L葡萄糖-玉米浆-硫酸铵培养基的5L摇瓶，pH5.0，30℃旋转摇床180r.p.m上培养72h，1％栽培人参总皂甙投料，转化48h。发酵转化液酒精提取，过滤减压蒸干，甲醇溶解，HPLC分析，转化率达8％，最后提取分离得率5％，Compound K含量80％以上。

实施例4

犁头霉菌(Absidic corymbifera)接种30ml蔡氏培养基，26℃转速200r.p.m摇床中培养60h，2‰西洋参总皂甙投料，继续转化60h后，停止反应，乙醇提取，过滤，减压蒸干，甲醇溶解，HPLC分析，发酵转化率为6.8％。

实施例5

黑根霉菌(Rhizopus nigricans)接种于Medium325麦芽汁培养液100ml和人参抽提液，培养48h。200r.p.m离心后，除去上清，备用。按40％含菌量加入3％浓度的海藻酸钠溶液，搅匀，连续注入搅拌的0.1MCaCl₂溶液中，成线状物(约1mm直径)，然后将其剪成0.5～1cm的线段，得固定化细胞便得固定化细胞。此固定化细胞在悬于人参总皂甙溶液中可获得Compound-K。

实施例6

绿色木霉菌(Trichonderma viride)生长72小时，4000r.p.m离心，上清液以30-70％硫酸铵饱和度获取酶活力部分，透析后，Q-Sepharose纯化皂甙糖苷酶。纯化的人参皂甙糖苷酶聚乙烯氧化物载体混合，4℃搅拌反应3d砂芯漏斗过滤，固定化酶颗粒经醋酸钠缓冲液洗涤。即得固定化人参皂甙糖苷酶。人参总皂甙溶液中可获得Compound-K。

实施例7

TLC：硅胶H；展开剂：CHCl₃∶CH₃OH∶H₂O＝7∶3∶0.5(下层)；显色剂：5％硫酸-乙醇，电吹风吹干显色

实施例8

发酵液酒精提取，减压蒸干，甲醇溶解，HPLC检测：柱：WatersSymmetry C18(4.6×150mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-水(48∶52)；检测波长：203nm；流速：1ml/min。

实施例9

HPLC检测：柱：Waters NH₂(4.6×250mm，7μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈—1％磷酸溶液(82∶18)；检测波长：203nm；流速：0.5ml/min。

实施例10

发酵结束后，加入95％酒精浸提，离心除去菌体，减压浓缩，适量水悬浮，水饱和正丁醇萃取，有机相减压浓缩，活性炭回流脱色，过滤除去活性炭，浓缩得浸膏，拌入适量硅胶。取上述样品上硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC跟踪检测。Compound-K组分再上硅胶柱，氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(2∶1∶4∶1，下层)洗脱，得Compound-K粗品，制备HPLC精制后甲醇-水重结晶。

Claims

1、一种制备人参皂甙Compound-K的方法，其特征在于采用霉菌好气性发酵技术，直接转化人参总皂甙，制备人参皂甙Compound-K，包括下述步骤：

1)分离霉菌菌种；

2)发酵转化

摇瓶发酵：孢子悬浮液直接接入麦芽汁培养基、马铃薯汁培养基、基础盐培养基、蔡氏培养基或葡萄糖-玉米浆-硫酸铵发酵培养基，培养60～72小时，人参总皂甙1～5％投料，转化40～56小时；或，

发酵罐发酵：孢子悬浮液接入种子培养基，将种子培养液按5～10％比例接入发酵罐，人参总皂甙1～5％投料，转化40～56小时；

3)提取分离

酒精浸提后，正丁醇萃取，活性炭脱色，浓缩制得浸膏，上硅胶柱分离，以氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水2：1：4：1，下层洗脱，HPLC精制甲醇-水重结晶；4)TLC，HPLC方法分析检测Compound-K

TLC检测：硅胶H；展开剂：CHCl₃：CH₃OH：H₂O＝7：3：0.5下层；显色剂：5％硫酸-乙醇，电吹风吹干显色；

HPLC检测：柱：Waters Symmetry C184.6×150mm，5μm；柱温：30℃；流动相：乙腈-水48∶52；检测波长：203nm；流速：1ml/min；

5)核磁共振和单晶衍射技术Compound-K结构鉴定。

2、根据权利要求1所述的制备人参皂甙Compound-K的方法，其特征是，所述的霉菌菌种是曲霉、根霉、绿色木霉或犁头霉霉菌。

3、根据权利要求1所述的制备人参皂甙Compound-K的方法，其特征是所述的步骤2)的发酵温度为25℃～35℃；pH：5～6；发酵罐中种子培养液接入量为5％～10％。