CN1110550C

CN1110550C - 烟草为原料制备辅酶q10的方法

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Publication number: CN1110550C
Application number: CN 00130816
Authority: CN
Inventors: 徐凤彩; 穆虹; 高向阳; 康起亮; 叶国洪
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2003-06-04
Anticipated expiration: 2020-11-28
Also published as: CN1298942A

Abstract

本发明是以烟草为材料，经过诱导、继代和悬浮培养，产生生长快、辅酶Q₁₀含量高的烟草悬浮培养细胞。收集细胞加入丙酮研磨，过滤。滤液用石油醚萃取。萃取液浓缩后，经硅胶柱层析纯化，用乙醚—石油醚混合液浓度线性梯度洗脱，收集洗脱液。除去有机溶剂，加乙醇溶解。密封，结晶，离心收集辅酶Q₁₀结晶。产率达500-510ug/g干细胞，回收率为57-59%，纯度达98%以上。此发明为辅酶Q₁₀生产开拓了新途径，也为辅酶Q₁₀药源国产化奠定了基础。

Description

烟草为原料制备辅酶Q10方法

本发明涉及生物技术领域尤其是辅酶Q₁₀的制备

辅酶Q₁₀(Coenzyme Q₁₀，CoQ₁₀)又称泛醌₁₀，是2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-二苯醌的衍生物，其侧链含有10个异戊烯基。它广泛存在于动物、植物和微生物中，是呼吸链中电子/氢的载体。它可以以NADH脱氢酶，磷酸甘油脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、铁硫蛋白等中接受电子/氢，并将电子传递给Cyt。因此，在呼吸链中占据承上启下的重要位置和作用。辅酶Q₁₀是重要的药源，在医药上广泛用于治疗心、脑、肝、肾疾病，细菌和病毒传染病，癌症病人的综合治疗，以及改善机体免疫功能等。

辅酶Q₁₀在国外用化学合成法或微生物发酵法生成，但产率低、产物专一性差，成本高，价格贵，难于满足制药工业需要。目前国内尚无生产，至今我国制药所需辅酶Q₁₀完全依赖进口。因此，辅酶Q₁₀在国内外都存在广阔的市场。以烟草为原料生产辅酶Q₁₀目前国内外都未见报道。

本发明的目的在于采用现代生物技术方法，利用植物细胞工程和酶工程的原理和技术，从发酵高产生长快的烟草细胞中制备高纯度的结晶辅酶Q₁₀，经济、简便的生产辅酶Q₁₀，以适应经济建设和国内外市场的需要。

我们从1994年起对烟草细胞发酵条件、工艺及其生产辅酶Q₁₀技术、辅酶Q₁₀的分离纯化、结晶纯度控制等技术进行了长期深入研究，从而发明了烟草为原料，以烟草细胞悬浮培养生产辅酶Q₁₀的技术。

本发明是这样实现的：

(一)愈伤组织诱导取烟草植体，洗净，70％乙醇溶液浸泡，再用0.1％氯化汞消毒，无菌水冲洗。在无菌条件下切碎，接种于诱导培养基上培养，置16-32℃培养箱中黑暗培养至形成愈伤组织，较理想的培养温度为28±1℃。诱导培养基以MS为基本培养基，加入BA 0.05mg/L，2，4-D 1.0mg/L，NAA 1.0mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH5.8，高压灭菌。

(二)继代培养上述愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养，继代培养基以LS为基本培养基，另加入BA 0.05mg/L，2，4-D 1.0mg/L，NAA 1.0mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH5.8，高压灭菌，产生疏松愈伤组织；

(三)悬浮培养出种子细胞：将上述疏松愈伤组织，转入悬浮培养基中进行悬浮培养出种子细胞。1.悬浮培养基的组成

组成含量最佳含量

无机营养 LS LS

KT，mg/L 0.02-4 0.02

2，4-D，mg/L 0.05-4 2.00

肌醇mg/L 80-800 100

盐酸硫胺素mg/L 0.05-8.0 4.00

酵母膏％ 0.05-0.5 0.15

蔗糖％ 10-45 30

甲硫酸胺mg/L 5-20 20.02.培养条件

摇床转速，100-150r/min，最佳转速为100r/min，振幅2cm培养基pH，pH4.0-8.0，最佳pH5.8培养温度，16-32℃，最佳培养温度为28±1℃

培养时间，8天黑暗中培养(四)辅酶Q₁₀的制备

1.辅酶Q₁₀的提取用丙酮作为抽提溶剂，将烟草悬浮培养细胞与丙酮按1∶2(质量/体积比)混合，研磨，过滤，残渣重复2次以上，合并滤液，用0.5倍滤液体积的石油谜(30-65)℃作萃取剂进行萃取，所得石油醚萃取液为辅酶Q₁₀的石油醚提取液。

2.辅酶Q₁₀分离纯化：将石油醚提取液用蒸发法浓缩至原体积的1/15，上硅胶柱层析纯化，硅胶(60-325孔/cm)烘至恒重，加60克/L水活化，装柱(2.0×20.0cm²)，用体积分数为4％的乙醚-石油醚浓度线性梯度洗脱，流速1ml/分钟、5ml/管，收集黄色部分洗脱液，为辅酶Q₁₀纯化液。

3.结晶：将纯化辅酶Q₁₀溶液于60℃水浴上蒸发除去有机溶剂后，干物质加入乙醇溶解，密封于4-8℃冰箱中结晶，结晶完全后离心(10500转/分钟，4℃，15分钟)，收集结晶为辅酶Q₁₀。

4.干燥：用冷冻干燥法干燥，密封避光保存。

5.辅酶Q₁₀含量每克干重细胞产辅酶Q₁₀500-510ug，回收率达59.2％，纯度98％。辅酶Q₁₀的特征特性

辅酶Q₁₀正品为黄色长菱形结晶，无毒，无味，易溶于有机溶液。水分＜5％，

辅酶Q₁₀正品为黄色长菱形结晶，无毒，无味，易溶于有机溶液。水分＜5％，灰份＜3％，辅酶Q₉及其他杂质＜0.2％。

其化学结构式：(氧化型) (还原型)辅酶Q₁₀含量检测

将辅酶Q₁₀溶于10ml无水乙醇，取3ml在275nm波长下测定其氧化型吸光值(A1)；然后，加入0.1ml0.7％硼氢化钠水溶液，又在275nm波长下测定其还原型吸光值(A2)。对照为无水乙醇。按下式计算辅酶Q₁₀含量：

式中：n为稀释倍数，s为细胞干重(g)，142为辅酶Q₁₀的1％无水乙醇溶液在275波长下氧化型和还原型吸光值之差。

每g干重细胞达500-510ug辅酶Q₁₀质量标准检验

采用高效液相色谱法(HPLC)检测辅酶Q₁₀的纯度。色谱条件：色谱柱Zorbaxods7u；流动相为60％的乙醇/甲醇溶液；流速为1ml/min，波长283nm，进样量为30ul，标样和样品辅酶Q₁₀的浓度4.9umol/L。纯度＞98％，辅酶Q₉及其他杂质＜0.2％。水分、灰份检测按常规法。细胞干重按常规恒重法。本发明的优点1.本发明为辅酶Q₁₀药源生产开辟了新途径，为辅酶Q₁₀药源国产化奠定了基础。以适应市场和经济发展的需要。2.本发明用烟草细胞为材料，细胞生长快，辅酶Q₁₀含量高。从发酵细胞中易于提取辅酶Q₁₀。3.本发明工艺生产设备简单，可以国产化，而且投资少，工艺简便。辅酶Q₁₀成本低。4.发明辅酶Q₁₀回收率高，纯度高。达到药用要求，可以用于制药。

实例：

取盆栽砂培烟草黄花大金元具3-4片真叶幼苗的叶片，用自来水洗净。在无菌条件下70％乙醇溶液浸泡5-8秒，再用0.1％氯化汞消毒8-10分钟，无菌水冲洗3次，切成0.5cm-0.5cm小块，接种于诱导培养基上培养，置28±1℃培养箱中黑暗培养25天形成愈伤组织。将愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养，产生疏松愈伤组织。将疏松愈伤组织转入装有50ml悬浮培养基的250ml锥形瓶中，接种4g。摇瓶；转速为100-120r/分钟，振幅2cm，28±1℃黑暗中培养8天。用吸管吸取培养基中上部细胞并过滤，可作为悬浮培养的种子细胞。

取100g悬浮培养细胞，加入200ml丙酮，研磨，过滤，残渣重复2次以上，合并滤液，用300ml石油谜(30-60)℃作萃取剂进行萃取，所得萃取液为辅酶Q₁₀的石油醚提取液。将石油醚提取液置于60℃水浴浓缩至20ml，上硅胶柱(2.0×20.0cm)，用体积分数为4％的乙醚-石油醚浓度线性梯度洗脱，流速1ml/分钟，5ml/管，收集黄色部分洗脱液250ml，60℃水浴上蒸发除去有机溶剂后，干物质加入10ml乙醇溶解，密封避光，置于4-8℃冰箱中结晶，2天后结晶完全，离心(10500转/分钟，4℃，15分钟)，收集结晶，冷冻干燥，即为辅酶Q₁₀成品。产率为500-510ug/干细胞，回收率达59.2％，纯度98％以上。

Claims

1、烟草为原料制造辅酶Q₁₀的方法，其特征在于：

(1)愈伤组织诱导：取烟草植体，洗净，70％乙醇溶液浸泡，再用0.1％氯化汞溶液消毒，无菌水冲洗除去浸泡液和消毒液，在无菌条件下，切成小块，接种于诱导培养基上，置16-32℃培养箱中黑暗培养至形成愈伤组织；

(2)继代培养：将上述愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养，产生疏松愈伤组织；

(3)悬浮培养出种子细胞：将上述疏松愈伤组织，转入悬浮培养基中培养出种子细胞；

(4)辅酶Q₁₀提取：用丙酮作为抽提溶剂，将烟草悬浮培养细胞与丙酮1∶2的质量/体积比混合，研磨，过滤，残渣重复2次以上，合并滤液，用0.5倍滤液体积的30-65℃石油谜作萃取剂进行萃取，所得石油醚萃取液为辅酶Q₁₀的石油醚提取液；

(5)辅酶Q₁₀分离纯化：将石油醚提取液用蒸发法浓缩至原体积的1/5，上硅胶柱用体积分数为4％的乙醚—石油醚浓度混合液性梯度洗脱，收集黄色部分洗脱液，为辅酶Q₁₀纯化液；

(6)结晶：将纯化辅酶Q₁₀溶液于60℃水浴上蒸发除去有机溶剂后，加入无机乙醇溶解，密封于4-8℃冰库中结晶，结晶完全后离心，收集结晶，即为辅酶Q₁₀产品。

2、根据权利要求1所说的烟草为原料制备辅酶Q₁₀方法，其特征在于：诱导培养基以MS为基本培养基，加入BA 0.05mg/L，2，4-D1.0mg/L，NAA1.0mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH5.8。

3、根据权利要求1所说的烟草为原料制造辅酶Q₁₀方法，其特征在于：继代培养基以LS为基本培养基，加入BA0.05mg/L，2，4-D1.0mg/L，NAA1.0mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂0.7％，pH5.8。

4、根据权利要求1所说的烟草为原料制备辅酶Q₁₀方法，其特征在于：悬浮培养基中各营养成分为：无机营养LS，KT0.02-4mg/L，2，4-D0.05-4mg/L，肌醇80-800mg/L，盐酸硫胺素0.05-8.0mg/L，酵母膏0.05-0.5％，蔗糖10-45％，甲硫酸胺5-20mg/L，各营养成分较佳含量为：无机营养LS，KT0.02mg/L，2，4-D2.00mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素4.00mg/L，酵母膏0.15％，蔗糖30％，甲硫氨酸20mg/L。

5、根据权利要求1或4所说的烟草为原料制备辅酶Q₁₀方法，其特征在于：烟草细胞在悬浮培养基的培养条件为：摇床转速100-150转/分钟，最佳转速为100转/分钟，培养基的pH4.0-8.0，最佳的pH5.8，培养温度16-32℃，最佳培养温度为28±1℃，培养时间8天。