CN101921815B - 链霉菌获得黄酮类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

一种链霉菌获得黄酮类化合物的方法，是将草绿色链霉菌HNS2-2进行斜面、种子及摇瓶发酵培养，发酵液酸化处理、离心、萃取、浓缩，萃取相再经硅胶柱层析、薄板层析得三种化合物，经鉴定为黄酮类化合物，该黄酮类化合物具有广泛的生物活性，即抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤等，而且毒性低，不良反应少，对微生物具有抑制杀灭作用。

Description

链霉菌获得黄酮类化合物的方法

技术领域：

本发明涉及一种从土壤链霉菌(草绿色链霉菌HNS2-2)代谢产物中分离得到的黄酮类化合物。

背景技术：

黄酮类化合物(亦称类黄酮化合物)，主要指具有色酮环与苯环为基本结构的一类化合物的总称，是一种重要的生理活性物质，有着很强的抗氧化、抗辐射、抗癌和抗肿瘤作用，同时对微生物具有抑制杀灭作用，在医学领域及食品工业领域有广阔的应用前景。黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，多酚类植物以及几乎所有植物的花、叶、茎中都含有一定量的黄酮类化合物，但是由于植物资源受季节性影响、黄酮类化合物结构复杂、从植物中提取纯化困难、植物黄酮类化合物粗提物抑菌效果不稳定等原因，限制了黄酮类化合物的进一步开发与利用。链霉菌来源的黄酮类化合物，以前未见报道。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种链霉菌获得黄酮类化合物的方法，从链霉菌中寻找黄酮类化合物，便于工业化生产。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种链霉菌获得黄酮类化合物的方法，其特点是：该方法包括如下步骤：

a、发酵菌株为草绿色链霉菌HNS2-2，将该草绿色链霉菌进行斜面、种子及摇瓶发酵培养，得发酵液；

b、用浓度为37％的浓盐酸调节发酵液pH值为3.5，60℃下酸化处理30min后，离心(转速为3000r/min，时间为20min)，取上清液，上清液与乙酸乙酯等体积混合，于室温下置摇床180r/min振荡2.5h后，萃取10-12h，收集萃取相，得粗提液；

c、将上述粗提液在55℃真空浓缩得棕红色膏状提取物，该提取物上硅胶柱进行层析，用石油醚和乙酸乙酯的混合洗脱液进行梯度洗脱，收集经薄板层析法合并且检测具有活性的两段流分，将其中一段流分上硅胶柱进行层析，用石油醚和乙酸乙酯按体积比为85∶15混合的洗脱液洗脱后得化合物1，将另一段流分按体积比1∶0.5溶于丙酮中，溶于丙酮的部分经重结晶后，上硅胶柱进行层析，用丙酮洗脱得化合物2，溶于丙酮的部分中经重结晶后的剩余部分上硅胶柱进行层析，用石油醚和乙酸乙酯按体积比为82∶18混合的洗脱液洗脱后得化合物3；

d、采用核磁共振氢谱、及核磁共振碳谱技术对获得的上述化合物进行测定和结构鉴定，上述化合物1为槲皮素，其化学结构为：

化合物2为4′-羟基黄烷酮，其化学结构为：

化合物3为3-羟基黄酮，其化学结构为：

上述草绿色链霉菌发酵液的制备已为现有技术，可参考2009年第3期的《生物技术》第30-33页上的“链霉菌HNS2-2生物活性物理化性质的初步研究”，因此在上面的技术方案中并未多加描述，具体的制备过程为：取草绿色链霉菌HNS2-2在高氏一号斜面培养基上培养，再接种于装有30mL种子培养基(可溶性淀粉20g、酵母膏2g及蒸馏水1000mL，pH 7.3)的300mL三角瓶中，置气浴恒温振荡器上，在摇床转速220r/min、28℃条件下振荡培养24h为种子液；随后按10％(V/V)接种量，将种子液接种于装有50mL发酵培养基(大米粉100g、豆饼粉22g、酵母膏5g、K₂HPO₄1g、NaCL1g、CaCO34g及蒸馏水1000mL，pH 7.5)的500mL三角瓶中，置气浴恒温振荡器上，在摇床转速220r/min、28℃条件下振荡培养4d，获得发酵液。

本发明的优点是：由草绿色链霉菌产生黄酮类化合物，不受气候和资源条件的限制，可在人工控制条件下进行规模化生产，克服了从植物中提取黄酮类化合物的不足之处。

附图说明：

图1是本发明以草绿色链霉菌产生黄酮类化合物流程示意图。

具体实施方式：

结合参考图1，将对本发明作进一步的说明。

制备草绿色链霉菌发酵液：

取草绿色链霉菌HNS2-2在高氏一号斜面培养基中培养，再接种于装有30mL种子培养基(可溶性淀粉20g、酵母膏2g及蒸馏水1000mL，pH 7.3)的300mL三角瓶中，置气浴恒温振荡器上，在摇床转速220r/min、28℃条件下振荡培养24h为种子液；随后按10％(V/V)接种量，将种子液接种于装有50mL发酵培养基(大米粉100g、豆饼粉22g、酵母膏5g、K₂HPO₄1g、NaCL 1g、CaCO₃4g及蒸馏水1000mL，pH 7.5)的500mL三角瓶中，置气浴恒温振荡器上，在摇床转速220r/min、28℃条件下振荡培养4d，获得发酵液。

黄酮类化合物的粗提纯：

用浓度为37％的浓盐酸调节发酵液pH值为3.5，60℃下酸化处理30min后，离心(3000r/min、20min)取上清液，上清液与乙酸乙酯等体积混合，于室温下置摇床180r/min振荡2.5h后，萃取10-12h，收集萃取相，得黄酮类化合物的粗提液；随后可用芦丁作为标准品，采用分光光度法测得粗提液黄酮类化合物的含量。

黄酮类化合物的主要成分的分离纯化：

将上述粗提液在55℃真空减压浓缩得棕红色膏状提取物，该提取物经硅胶柱层析(柱Φ×L为9cm×80cm；硅胶100～200目；石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱；500mL/流分)，分离得到76个流分。经薄板层析(TLC)合并为12个流分段，其中F_37～41流分和F_48～57流分具有活性，该F_37～41流分经硅胶柱层析(柱Φ×L为2cm×45cm；硅胶200～300目；洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的体积比为85∶15；25mL/流分)，得化合物1；将该F_48～57流分溶于丙酮中，溶于丙酮的部分经重结晶后，经硅胶柱层析(柱Φ×L为2cm×45cm；硅胶200～300目；洗脱剂为丙酮；25mL/流分)，得化合物2；溶于丙酮的部分中经重结晶后的剩余部分经硅胶柱层析(柱Φ×L为2cm×50cm；硅胶100～200目；洗脱剂为石油醚82：乙酸乙酯18；20mL/流分)，得化合物3。

黄酮类化合物主要成分的结构鉴定：

采用核磁共振氢谱(¹H NMR)，核磁共振碳谱(¹³C NMR)技术对获得的纯化合物进行测定，根据¹H NMR及¹³C NMR数据，并与相关文献对比，对分离得到的化合物进行结构鉴定。

化合物1：为黄色粉末。根据该化合物的¹H NMR和¹³C NMR，鉴定该化合物化学名为quercetin dehydrate，与已知的黄酮类化合物槲皮素为同一物质，其化学结构如下：

化合物2：为白色晶体，根据该化合物的¹H NMR和¹³C NMR，鉴定该化合物化学名为4′-hydroxyflavanone与已知的黄酮类化合物4′-羟基黄烷酮为同一物质，其化学结构如下。

化合物3：为淡黄色晶体，根据该化合物的¹H NMR和¹³C NMR，鉴定该化合物化学名为3-hydroxyflavone与已知的黄酮类化合物3-羟基黄酮为同一物质，其化学结构如下：

本发明的黄酮类化合物具有广泛的生物活性，即抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤等，而且毒性低，不良反应少，同时对微生物(如细菌等)具有抑制杀灭作用。

抑菌试验：

制备装有2.5ml的灭菌牛肉膏蛋白胨液体培养基试管5支，将含有500μl化合物1的丙酮溶液、含有500μl化合物2的丙酮溶液、含有500μl化合物3的丙酮溶液、500μl丙酮、及500μl无菌水分别加入5支试管中，以丙酮、及无菌水作为对照，接种金黄色葡萄球菌悬液10μl，置37℃恒温培养箱中培养36h，随后分别取100μl培养液涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基平板，于37℃恒温培养箱中培养36h，试验设3次重复，观察结果。结果显示，3种化合物对金黄色葡萄球菌均有抑制作用。分别含有化合物1、化合物2、及化合物3的3个平板中的金黄色葡萄球菌的平均CFU(菌落形成单位)分别为12.5、24.5、235.0，而对照中金黄色葡萄球菌多不可计。

Claims (1)

1.一种链霉菌获得黄酮类化合物的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

a、发酵菌株为草绿色链霉菌HNS2-2，将该草绿色链霉菌进行斜面、种子及摇瓶发酵培养，得发酵液；

b、用浓度为37％的浓盐酸调节发酵液pH值为3.5，60℃下酸化处理30min后，离心取上清液，上清液与乙酸乙酯等体积混合，于室温下置摇床180r/min振荡2.5h后，萃取10-12h，收集萃取相，得粗提液；

c、将上述粗提液在55℃真空浓缩得棕红色膏状提取物，该提取物上硅胶柱进行层析，用石油醚和乙酸乙酯的混合洗脱液进行梯度洗脱，收集经薄板层析法合并且检测具有活性的两段流分，将其中一段流分上硅胶柱进行层析，用石油醚和乙酸乙酯按体积比为85∶15混合的洗脱液洗脱后得化合物1，将另一段流分按体积比1∶0.5溶于丙酮中，溶于丙酮的部分经重结晶后，上硅胶柱进行层析，用丙酮洗脱得化合物2，溶于丙酮的部分中经重结晶后的剩余部分上硅胶柱进行层析，用石油醚和乙酸乙酯按体积比为82∶18混合的洗脱液洗脱后得化合物3；

d、采用核磁共振氢谱、及核磁共振碳谱技术对获得的上述化合物进行测定和结构鉴定，上述化合物1为槲皮素，其化学结构为：

化合物2为4′-羟基黄烷酮，其化学结构为：

化合物3为3-羟基黄酮，其化学结构为：

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