CN102352403B - 混菌进化传代培养提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤：(1)固体培养；(2)种子培养，将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，以24h-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代50-80天；(3)分纯；(4)发酵；本发明的方法通过混菌进化传代培养数十代后，能明显提高巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌的生长速度和氧化葡糖杆菌产2-酮基-L-古龙酸效率，从而可提高对培养基的利用效率，提高L-山梨糖的转化效率10％左右。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物领域，涉及一种混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法。
背景技术
维生素C是机体营养、生长所必需的一种微量水溶性维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面起着重要的作用。维生素C可以作为药品、保健品、食品添加剂及化妆品营养剂，它的应用范围在扩展，市场稳定。
目前，我国生产维生素C的方法为“二步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。混合发酵所使用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)混菌发酵，其中，氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)为产酸菌，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为伴生菌，若不加入巨大芽孢杆菌而单独使用氧化葡糖杆菌时，生长极端缓慢，产酸效率低，当加入巨大芽孢杆菌，可使氧化葡糖杆菌生长速率提高，产酸量增加，但是，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)混菌发酵2-酮基-L-古龙酸的转化率尚有可提高的空间。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法。
混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤：
(1)固体培养：
取存于液氮的10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48小时；
(2)种子培养：
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，24h-48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，以24h-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代50-80天；
(3)分纯：
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48小时；再分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
(4)发酵：
将所述原始巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养72h-96h，获得2-酮基-L-古龙酸。
固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，琼脂10-50g，KH2PO40.5-5g，MgSO40.1-0.7g，CaCO30.5-5g，加水至1L，调pH为6.5-7.0，121℃灭菌20min，制成固体培养基。
固体培养基的制备优选的是：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，琼脂20g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g，加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成固体培养基。
种子培养基制备为：按比例称取L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，KH2PO40.5-5g，MgSO40.1-0.7g，CaCO30.5-5g，加水至1L，调pH为6.5-7.0，121℃灭菌20min，制成种子培养基。
种子培养基的制备优选的是：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g，加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基。
发酵培养基制备为：按比例称取L-山梨糖40-120g，玉米浆10-50g，尿素10-25g，KH2PO40.5-3g，MgSO40.2-1.2g，CaCO30.5-5g加水至1L，调pH为6.5-7.5，121℃灭菌20min，制成发酵培养基。
发酵培养基的制备优选的是：按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO41g，MgSO40.5g，CaCO31g，加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min，制成发酵培养基。
本发明的方法通过混菌进化传代培养数十代后，能明显提高巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的生长速度和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)产2-酮基-L-古龙酸效率，从而可提高对培养基的利用效率，提高L-山梨糖的转化效率10％-15％。
附图说明
图1为传代过程2-酮基-L-古龙酸转化率变化，图例：◆：2-酮基-L-古龙酸转化率。
图2为传代50天后菌种发酵结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的内容及实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不用于限制本发明。
本发明所使用的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)保藏编号为CGMCC No.1.110，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)保藏编号为CGMCC No 1.459，从中国普通微生物菌种保藏管理中心购得。
实施例1
一种混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤：
(1)固体培养：
固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，琼脂20g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成固体培养基；
将存于液氮的150μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和150μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，30℃，培养48小时；
(2)种子培养：
种子培养基制备为：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基；
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在30℃，250r/min摇床振荡培养，48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为2×109cfu/ml，在30℃，250r/min摇床振荡培养，以24h为传代周期，以体积比为4％为传代比接入新的种子培养基中，传代50天；
(3)分纯：
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，30℃，培养48小时；再分别转入种子培养基，在30℃，250r/min摇床振荡培养48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
(4)发酵：
发酵培养基制备为：按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO41g，MgSO40.5g，CaCO31g，加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min，制成发酵培养基；
将原始的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始的巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×109cfu/ml，在30℃，250r/min摇床振荡培养96h，获得2-酮基-L-古龙酸。
2-酮基-L-古龙酸和L-山梨糖含量测定：
采用高效液相色谱法(HPLC)。
样品制备：取发酵培养不同时间的发酵液1mL于1.5mL离心管中，10000r/min转速离心3min，取上清100μL于1.5mL离心管中，并加入900μL流动相(5mM H2SO4)得到稀释十倍的样品。振荡混匀后，用0.22μm的纤维素微孔滤膜过滤样品，得到待测样品。
高效液相色谱条件：色谱柱：bio-rad HPX-87H，流动相：5mM H2SO4，流速：0.6mL/min，柱温：65℃，示差检测器。
检测结果见图2。
图例：◇：原始氧化葡糖杆菌和原始巨大芽孢杆菌搭配；△：传代50天氧化葡糖杆菌和原始巨大芽孢杆菌搭配。
原始氧化葡糖杆菌与原始巨大芽孢杆菌利用实施例1步骤(4)的发酵条件进行搭配混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率达到78％；
传代培养50天的氧化葡糖杆菌与原始巨大芽孢杆菌搭配混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率达到88.2％，有了10.2％的提高。
实施例2
一种混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤：
(1)固体培养：
取存于液氮的10μL保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10μL保藏于体积浓度为30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，35℃，培养24小时；
(2)种子培养：
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在35℃，200r/min摇床振荡培养24h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为2×108cfu/ml，在35℃，200r/min摇床振荡培养，以24h为传代周期，以体积比为2％为传代比接入新的种子培养基中，传代60天；
(3)分纯：
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，35℃培养24小时；再分别转入种子培养基，在35℃，200r/min摇床振荡培养24h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
(4)发酵：
将原始的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始的巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108cfu/ml，在35℃，200r/min摇床振荡培养96h，获得2-酮基-L-古龙酸。
本实施例所用的培养基：
固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖10g，玉米浆10g，牛肉膏5g，酵母浸粉2g，尿素5g，蛋白胨5g，琼脂10g，KH2PO45g，MgSO40.5g，CaCO30.5g，加水至1L，调pH为6.5，121℃灭菌20min，制成固体培养基。
种子培养基制备为：按比例称取L-山梨糖10g，玉米浆10g，牛肉膏8g，酵母浸粉2g，尿素5g，蛋白胨2g，KH2PO45g，MgSO40.5g，CaCO30.5g，加水至1L，调pH为6.5，121℃灭菌20min，制成种子培养基。
发酵培养基制备为：按比例称取L-山梨糖40g，玉米浆50g，尿素20g，KH2PO40.5g，MgSO41.2g，CaCO32g加水至1L，调pH为6.5，121℃灭菌20min，制成发酵培养基。
实施例3
一种混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤：
(1)固体培养：
取存于液氮的200μL保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和200μL保藏于体积浓度为15％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，30℃，培养36小时；
(2)种子培养：
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在30℃，240r/min摇床振荡培养36h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×108cfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml，在30℃，240r/min摇床振荡培养，以36h为传代周期，以体积比为1％为传代比接入新的种子培养基中，传代70天；
(3)分纯：
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，30℃培养36小时；再分别转入种子培养基，在30℃，240r/min摇床振荡培养36h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
(4)发酵：
将原始的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始的巨大芽孢杆菌的密度为2×108cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml，在30℃，240r/min摇床振荡培养96h，获得2-酮基-L-古龙酸。
本实施例所用的各个培养基：
固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖30g，玉米浆2g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，尿素0.5g，蛋白胨12g，琼脂30g，KH2PO40.5g，MgSO40.7g，CaCO33g，加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成固体培养基。
种子培养基制备为：按比例称取L-山梨糖30g，玉米浆2g，牛肉膏10g，酵母浸粉8g，尿素0.5g，蛋白胨8g，KH2PO40.5g，MgSO40.7g，CaCO33g，加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基。
发酵培养基制备为：按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆10g，尿素25g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO35g加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成发酵培养基。
实施例4
一种混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤：
(1)固体培养：
取存于液氮的500μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和500μL保藏于体积浓度为20％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28℃，培养48小时；
(2)种子培养：
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28℃，280r/min摇床振荡培养48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×1010cfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml，在28℃，280r/min摇床振荡培养，以48h为传代周期，以体积比为10％为传代比接入新的种子培养基中，传代80天；
(3)分纯：
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28℃培养48小时；再分别转入种子培养基，在28℃，280r/min摇床振荡培养48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
(4)发酵：
将原始的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始的巨大芽孢杆菌的密度为2×1010cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml，在28℃，280r/min摇床振荡培养72h，获得2-酮基-L-古龙酸。
本实施例所用的各个培养基：
固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖50g，玉米浆5g，牛肉膏2g，酵母浸粉10g，尿素3g，蛋白胨2g，琼脂50g，KH2PO43g，MgSO40.1g，CaCO35g，加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min，制成固体培养基。
种子培养基制备为：按比例称取L-山梨糖50g，玉米浆8g，牛肉膏2g，酵母浸粉10g，尿素3g，蛋白胨12g，KH2PO43g，MgSO40.1g，CaCO30.5-5g，加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min，制成种子培养基。
发酵培养基制备为：按比例称取L-山梨糖120g，玉米浆30g，尿素10g，KH2PO43g，MgSO40.5g，CaCO30.5g加水至1L，调pH为7.5，121℃灭菌20min，制成发酵培养基。
Claims (7)
1.混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）固体培养：
取10-500μL保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌（Gluconobacteroxydans）和10-500μL保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48小时；
（2）种子培养：
将经步骤（1）培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，24h-48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，以24h-48h为传代周期，以体积比为1%-10%为传代比接入新的种子培养基中，传代50-80天；
（3）分纯：
将步骤（2）获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48小时；再分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；
（4）发酵：
将原始巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养72h-96h，获得2-酮基-L-古龙酸。
2.根据权利要求1所述的混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，琼脂10-50g，KH2PO40.5-5g，MgSO40.1-0.7g，CaCO30.5-5g，加水至1L，调pH为6.5-7.0，121℃灭菌20min，制成固体培养基。
3.根据权利要求2所述的混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，琼脂20g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g，加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成固体培养基。
4.根据权利要求1所述的混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述种子培养基制备为：按比例称取L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，KH2PO40.5-5g，MgSO40.1-0.7g，CaCO30.5-5g，加水至1L，调pH为6.5-7.0，121℃灭菌20min，制成种子培养基。
5.根据权利要求4所述的混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述种子培养基制备为：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g，加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基。
6.根据权利要求1所述的混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述发酵培养基制备为：按比例称取L-山梨糖40-120g，玉米浆10-50g，尿素10-25g，KH2PO40.5-3g，MgSO40.2-1.2g，CaCO30.5-5g加水至1L，调pH为6.5-7.5，121℃灭菌20min，制成发酵培养基。
7.根据权利要求6所述的混菌进化传代培养提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述发酵培养基制备为：按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO41g，MgSO40.5g，CaCO31g，加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min，制成发酵培养基。
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