DE112012002557B4

DE112012002557B4 - Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-Gulonsäure

Info

Publication number: DE112012002557B4
Application number: DE112012002557.1T
Authority: DE
Inventors: Yingjin Yuan; Yang Zou; Qian Ma; Yun Gao; Jin Du; Jie Yang; Xia Li
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2018-05-09
Anticipated expiration: 2032-06-01
Also published as: DE112012002557T5; WO2012174978A1

Abstract

Eine Methode zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch verbesserte Wechselwirkung zweier Bakterien, wobei diese durch folgende Schritte charakterisiert ist:(1) feste Kultur:Man stellt 10-500µL Gluconobacter oxydans, aufbewahrt in einer 15-30%igen Glycerin-Wasser-Lösung (Volumen %), sowie 10-500µL Bacillus megatherium, aufbewahrt in einer 15-30%igen Glycerin-Wasser-Lösung (Volumen %), bereit, die in flüssigem Stickstoff gelagert sind, impft diese separat auf feste Nährmedien und kultiviert bei 28-35°C für 24-48 h;(2) Anzuchtkultur:man überträgt die in Schritt (1) kultivierten Bacillus megatherium sowie Gluconobacter oxydans separat in Anzuchtnährmedien und kultiviert bei 28-35°C für 24-48 h unter Schütteln mit 200-280 U/min, um eine Kulturflüssigkeit mit Bacillus megatherium sowie eine Kulturflüssigkeit mit Gluconobacter oxydans zu erhalten;man impft die Bacillus megatherium und Gluconobacter oxydans in neue Anzuchtnährmedien ein, um eine Konzentration von 2×10- 2×10KbE/ml für Bacillus megatherium sowie eine Konzentration von 2×10- 2×10KbE/ml für Gluconobacter oxydans zu erreichen, kultiviert unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C und impft mit einem Subkultivierungs-Zyklus von 24 bis 48 h und einem Volumenverhältnis von 1% bis 10% in neue Anzuchtnährmedien ein, um eine Subkultivierung über 100-200 Tage durchzuführen;(3) Abtrennung und Reinigung:man streicht die durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien zwecks Abtrennung und Reinigung aus, impft dann separat auf feste Nährmedien, kultiviert bei 28-35°C für 24-48 h, überträgt dann separat in Anzuchtnährmedien und kultiviert unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C für 24-48 h, um eine entwickelte Kulturflüssigkeit mit Bacillus megatherium sowie eine entwickelte Kulturflüssigkeit mit Gluconobacter oxydans zu erhalten;(4) Fermentierungman impft die entwickelten Bacillus megatherium und die entwickelten Gluconobacter oxydans in Fermentierungs-Nährmedien ein, um eine Konzentration von 2×10- 2×10KbE/ml für die entwickelten Bacillus megaterium sowie eine Konzentration von 2×10- 2×10KbE/ml für die entwickelten Gluconobacter oxydans zu erreichen und kultiviert unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C für 72-96 h, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten oderman impft den originalen Bacillus megatherium sowie den entwickelten Gluconobacter oxydans in Fermentierungs-Nährmedien ein, um eine Konzentration von 2×10- 2×10KbE/ml für den entwickelten Bacillus megatherium und eine Konzentration von 2×10- 2×10KbE/ml für den entwickelten Gluconobacter oxydans zu erhalten und kultiviert unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C für 72-96 h, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.

Description

Technischer Bereich
Diese Erfindung betrifft den Bereich industrieller Mikroorganismen. Offenbart wird eine spezielle Methode zur Entdeckung von Änderungen von Proteinen, der Phospholipidgruppe, der Ernährungsumgebung und kleiner Moleküle (Metaboliten) in dem Prozess der Subkultur von Stämmen für die industrielle Produktion von Vitamin C. Diese Erfindung bezieht sich weiterhin auf Methoden zur Steigerung der industriellen Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure, einem Vorprodukt des Vitamin C, einschließlich einer Methode für die Steigerung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Evolution und Subkultur von Mischbakterien und die Verbesserung der Interaktion zweier Bakterien. Ferner offenbart wird eine Methode zur molekularbiologischen Genmodifikation und eine Methode zur Beimischung von Glutathion. Außerdem offenbart wird ein Qualitätskontrollindex für Maisquellwasser, das für die Fermentation verwendet wird.
Stand der Technik
Mit der wirtschaftlichen Entwicklung und dem Anstieg des Lebensstandards erhält die Gesundheit mehr und mehr an Aufmerksamkeit, und die Mengennachfrage nach diversen Vitaminen steigt mit den Jahren an. Von diversen Vitaminen ist das Vitamin C ein höchst wirkungsvolles Antioxidationsmittel, das an vielen wichtigen biosynthetischen Metabolitenprozessen im menschlichen Körper beteiligt ist, und es ist ein wesentliches Vitamin für die Aufrechterhaltung der Ernährung und das Wachstum. Es wird auch in der Pharmazie, für Lebensmittel und Kosmetika verbreitet eingesetzt.
Derzeit wird Vitamin C in China mit einer „zweistufigen Fermentationsmethode“ hergestellt. Der erste Schritt der Fermentation besteht darin, Sorbitol mit Hilfe von Acetobacter melanogenum in L-Sorbose umzuwandeln, und der zweite Schritt der Fermentation darin, Sorbose durch eine Mischfermentation von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in 2-Keto-L-gulonsäure, das Vorprodukt für Vitamin C, umzuwandeln. Im zweiten Fermentationsschritt ist Gluconobacter oxydans das säurebildende Bakterium, während Bacillus megaterium das assoziierte Bakterium ist. Wenn Gluconobacter oxydans alleine ohne Bacillus megaterium kultiviert wird, wächst es sehr langsam mit einer geringen Säurebildungseffizienz, wenn jedoch Bacillus megaterium hinzugefügt wird, steigt die Wachstumsrate des Gluconobacter oxydans, und die Säureproduktion steigt ebenfalls an. Dennoch besteht immer noch ein Bedarf an der Steigerung der Umwandlungsrate von 2-Keto-L-gulonsäure in der Mischfermentation von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans.
In der Mischkultur zweier Bakterien erfolgt ihre Interaktion zunächst an einer Zellmembran, die Umweltsignale spürt, dringt dann in die Zelle ein und erzeugt eine Serie von Signalereignissen, inkl. der Änderung von intrazellulären Proteinen und Änderungen von Phospholipiden der Zellmembran. Außerdem erfolgen auch Änderungen in der Ernährungsumgebung des Nährmediums und geraten in die Zelle, was zu einer Serie von verschiedenen Arten des Wachstums- und Fermentationsverhaltens führt. Die Untersuchung und Entdeckung dieser Änderungen wird nützliche Informationen für die Erkennung des Mechanismus' der Verbesserung der Säurebildung liefern, indem sie die Interaktion zweier Bakterien verbessert und somit die Optimierung des Produktionsprozesses unterstützen kann.
Andererseits ist es für die Steigerung der Produkteffizienz der Mischfermentation entscheidend, die Fähigkeit von Gluconobacter oxydans zur Zucker-Säure-Umwandlung zu verbessern. Eine molekularbiologische Operation und Metabolic Engineering bedeutet, die künstliche Evolution von Stämmen zu beschleunigen, kann die Eigenschaften der Stämme schnell verbessern und gezielt Stämme auf der Basis von Geninformationen modifizieren. Patent CN1621518 und Patent CN1515669 zeigen eine Nukleotidsequenz von Sorboson-Dehydrogenase, eines Schlüsselenzyms für die Umwandlung von Zucker in Säure durch Gluconobacter oxydans. Auf der Basis dieser Information kann Gluconobacter oxydans auf molekularer Ebene modifiziert werden, um die Mischfermentationseigenschaften der 2-Keto-L-Gluonsäure zu verbessern, wenn es gemeinsam mit Bacillus megaterium in Mischfermentation kultiviert wird.
Außerdem steigen nach Beimischung von Glutathion das Wachstum von Gluconobacter oxydans und die Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure signifikant an, obwohl der Mechanismus dabei noch unbekannt ist. Durch Hoch-Durchsatz- Proteomik können die Proteinänderungen während der Fermentation von Gluconobacter oxydans unter Zugabe von Glutathion untersucht werden, um den Mechanismus zu offenbaren, dass Glutathion das Wachstum von Gluconobacter oxydans und der Produktion von 2-Keto-L-Gluonsäure verstärkt, was nützliche Informationen für die molekularbiologische Modifikation von Gluconobacter oxydans liefert, um sein Wachstum und seine Produktivität zu verbessern.
In anderer Hinsicht hat auch Maisquellwasser als Fermentationsmaterial signifikante Auswirkungen auf das Fermentationsprodukt. Maisquellwasser ist ein Nebenprodukt des Einweichens von Mais bei der Herstellung von Maisstärke. Es enthält viele Nährstoffe wie Aminosäuren, organische Säuren, lösliche Saccharide, Vitamine und Metallsalze und ist daher ein wichtiger Rohstoff für Nährmedien zur Herstellung von Antibiotika, da es eine Stickstoffquelle für das Wachstum von Mikroorganismen liefert. Es wird aufgrund seines niedrigen Preises und des Überflusses an Nährstoffen verbreitet für die industrielle Fermentation mit Mikroorganismen eingesetzt. Die aktuellen Methoden für die Qualitätsinspektion von Maisquellwasser werden von den Herstellern vorgegeben, und es existiert kein nationaler Standard. Die aktuelle Qualitätsinspektion schreibt gewöhnlich vor: Dick und undurchsichtig im Aussehen, Farbe Braun bis Sepia, kein anomaler, wie etwa ranziger, Geschmack, sowie Standards für Trockengewicht, Proteine, Säuregrad, Gehalt an schwefliger Säure und Asche. Eine solche Inspektion kann jedoch die Qualität der Rohstoffe nicht wissenschaftlich und präzise ermitteln, und Rohstoffe verschiedener Lose können die Wirksamkeit des Fermentationproduktes signifikant beeinflussen. Daher ist es notwendig, um die Qualität der Rohstoffe umfassend und richtig zu kontrollieren, eine hohe Wirksamkeit des Fermentationsprodukts sicherzustellen, die Produktivität zu steigern und Abfall zu vermeiden, die Qualitätskontrollindizes zu untersuchen.
Die CN 101 338 335 A offenbart die Verwendung einer Bakterienmischkultur zur Herstellung von 2-Ketogulonsäure, wobei sich die Mischkultur aus Gluconobacter oxydans und Bacillus megatherium zusammensetzt.
Zusammenfassung der Erfindung
Der erste Aspekt dieser Offenbarung liefert eine Methode für die Steigerung der 2-Keto-L-gulonsäure - Produktion in einer Evolutionssubkultur von Mischbakterien, die folgende Schritte umfasst:

(1) Festkultur:
- Bereitstellung von 10-500µL Gluconobacter oxydans, bewahrt in einer 15-30%igen Glycerin-Wasser-Lösung (Volumen-%) und 10-500µL Bacillus megaterium, bewahrt in einer 15-30%igen Glycerin-Wasser-Lösung (Volumen-%), die in flüssigen Stickstoff eingelagert werden, wobei getrennt auf festen Nährmedien eingeimpft und 24-48 Std. lang bei 28-35°C kultiviert wird;
(2) Anzuchtkultur:
- Getrennte Überführung des Bacillus megaterium und des Gluconobacter oxydans, kultiviert wie in Schritt (1), in das Anzuchtmedium, 24-48 Std. bei 28-35°C kultivieren und dabei mit 200-280 U/min schütteln, um Bacillus megaterium-Anzuchtflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Anzuchtflüssigkeit zu erhalten;
- Einimpfung von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in neues Anzuchtmedium, um eine Dichte von 2×10⁷- 2×10¹⁰ cfu/ml für Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁸- 2×10¹¹ cfu/ml für Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivieren bei 28-35°C und dabei mit 200-280 U/min schütteln, und in neues Anzuchtmedium einimpfen, mit einem Subkulturzyklus von 24 Std. bis 48 Std. und einem Volumenverhältnis von 1% zu 10%, um eine Subkultur über 50-80 Tage durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
- Abstreifen der mit der Subkultur in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um eine Trennung und Reinigung durchzuführen, dann getrennt auf festem Nährmedium einimpfen und 24-48 Std. lang bei 28-35°C kultivieren; dann getrennt in Anzuchtmedium einimpfen, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultivieren, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Anzuchtflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans- Anzuchtflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
- Einimpfen des originalen Bacillus megaterium und des entwickelten Gluconobacter oxydans in Fermentations-Nährmedium bis zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷-2×10¹⁰ cfu/ml für den originalen Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁷ - 2×10⁹ cfu/ml für den entwickelten Gluconobacter oxydans, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 72-96 Std. lang kultivieren, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.

Die Zubereitung des festen Nährmediums umfasst: Abwiegen von 10-50g L-Sorbose, 2-10g Maisquellwasser, 2-10g Rindfleischextrakt, 2-10g Hefeextraktpulver, 0,5-5g Harnstoff, 2-12g Pepton, 10-50g Agar, 0,5-5g KH₂PO₄, 0,1-0,7g MgSO₄, 0,5-5g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,5-7,0 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um so das feste Nährmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des festen Nährmediums umfasst vorzugsweise: Abwiegen von 20g L-Sorbose, 3g Maisquellwasser, 3g Rindfleischextrakt, 3g Hefeextraktpulver, 1g Harnstoff, 10g Pepton, 20g Agar, 1g KH₂PO₄, 0,2g MgSO₄, 1g CaCO₃, bis zum 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,8 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um so das feste Nährmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des Anzuchtmediums umfasst: Abwiegen von 10-50g L-Sorbose, 2-10g Maisquellwasser, 2-10g Rindfleischextrakt, 2-10g Hefeextraktpulver, 0,5-5g Harnstoff, 2-12g Pepton, 0,5-5g KH₂PO₄, 0,1-0,7g MgSO₄, 0,5-5g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,5-7,0 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das Anzuchtmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des Anzuchtmediums umfasst vorzugsweise: Abwiegen von 20g L-Sorbose, 3g Maisquellwasser, 3g Rindfleischextrakt, 3g Hefextraktpulver, 1g Harnstoff, 10g Pepton, 1g KH₂PO₄, 0,2g MgSO₄, 1g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,8 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das Anzuchtmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des Fermentations-Nährmediums umfasst: Abwiegen von 40-120g L-Sorbose, 10-50g Maisquellwasser, 10-25g Harnstoff, 0,5-3g KH₂PO₄, 0,2-1,2g MgSO₄, 0,5-5g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,5-7,5 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das Anzuchtmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des Fermentations-Nährmediums umfasst vorzugsweise: Abwiegen von 80g L-Sorbose, 20g Maisquellwasser, 12g Harnstoff, 1g KH₂PO₄, 0,5g MgSO₄, 1g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 7,0 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das Anzuchtmedium zu erhalten.
In der Methode werden, nachdem die Mischbakterien entwickelt sind, nach Dutzenden von Generationen der Subkultur, die Wachstumsrate von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans und die Effizienz zur Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Gluconobacter oxydans signifikant verbessert, so dass die Nutzungseffizienz des Nährmediums steigt, und die Umwandlungseffizienz der L-Sorbose steigt um 10%-15%.
Diese Erfindung bietet eine Methode zur Steigerung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Verbesserung der Interaktion zweier Bakterien, die die folgenden Schritte umfasst:

(1) Festkultur:
- Bereitstellung von 10-500µL Gluconobacter oxydans, bewahrt in 15-30%iger Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%) und 10-500µL Bacillus megaterium, bewahrt in einer 15-30%igen Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%), die in flüssigem Stickstoff eingelagert werden, wobei getrennt in feste Nährmedien eingeimpft und bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultiviert wird;
(2) Anzuchtkultur:
- Getrennte Überführung von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in das Anzuchtmedium, bei 28-35°C 24-48 Std. lang bei Schütteln mit 200-280 U/min kultivieren, um die Bacillus megaterium -Anzuchtflüssigkeit und die Gluconobacter oxydans-Anzuchtflüssigkeit zu erhalten;
- Einimpfen von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in neues Anzuchtmedium bis zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷- 2×10¹⁰ cfu/ml für Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸- 2×10¹¹ cfu/ml für Gluconobacter oxydans, bei 28-35°C unter Schütteln mit 200-280 U/min kultivieren und in das neue Anzuchtmedium einimpfen, mit einem Subkulturzyklus von 24 Std. bis 48 Std. und einem Volumenverhältnis von 1% zu 10%, um über 100-200 Tage eine Subkultur durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
- Abstreifen der mit der Subkultur in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um eine Trennung und Reinigung durchzuführen, dann getrennt auf festem Nährmedium einimpfen und 24-48 Std. lang bei 28-35°C kultivieren; dann getrennt in Anzuchtmedium einimpfen, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultivieren, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Anzuchtflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans- Anzuchtflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
- Einimpfen des originalen Bacillus megaterium und des entwickelten Gluconobacter oxydans in Fermentations-Nährmedium bis zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷-2×10¹⁰ cfu/ml für den originalen Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸-2×10¹¹ cfu/ml für den entwickelten Gluconobacter oxydans, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 72-96 Std. lang kultivieren, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten, oder den originalen Bacillus megaterium und den entwickelten Gluconobacter oxydans in Fermentations-Nährmedium einimpfen, bis eine Dichte von 2×10⁷ - 2×10¹⁰ cfu/ml für den entwickelten Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁷ - 2×10⁹ cfu/ml für den entwickelten Gluconobacter oxydans erreicht wird, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 72-96 Std. kultivieren, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.

Die Zubereitung des festen Nährmediums umfasst: Abwiegen von 10-50g L-Sorbose, 2-10g Maisquellwasser, 2-10g Rindfleischextrakt, 2-10g Hefeextraktpulver, 0,5-5g Harnstoff, 2-12g Pepton, 10-50g Agar, 0,5-5g KH₂PO₄, 0,1-0,7g MgSO₄, 0,5-5g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,5-7,0 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das feste Nährmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des festem Nährmediums umfasst vorzugsweise: Abwiegen von 20g L-Sorbose, 3g Maisquellwasser, 3g Rindfleischextrakt, 3g Hefeextraktpulver, 1g Harnstoff, 10g Pepton, 20g Agar, 1g KH₂PO₄, 0,2g MgSO₄, 1g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,8 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das feste Nährmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des Anzuchtmediums umfasst: Abwiegen von 10-50g L-Sorbose, 2-10g Maisquellwasser, 2-10g Rindfleischextrakt, 2-10g Hefeextraktpulver, 0,5-5g Harnstoff, 2-12g Pepton, 0,5-5g KH₂PO₄, 0,1-0,7g MgSO₄, 0,5-5g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,5-7,0 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das Anzuchtmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des Anzuchtmediums umfasst vorzugsweise: Abwiegen von 20g L-Sorbose, 3g Maisquellwasser, 3g Rindfleischextrakt, 3g Hefeextraktpulver, 1g Harnstoff, 10g Peptone, 1g KH₂PO₄, 0,2g MgSO₄, 1g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,8 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das Anzuchtmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des Fermentations-Nährmediums umfasst: Abwiegen von 40-120g L-Sorbose, 10-50g Maisquellwasser, 10-25g Harnstoff, 0,5-3g KH₂PO₄, 0,2-1,2g MgSO₄, 0,5-5g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 6,5-7,5 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das Fermentations- Nährmedium zu erhalten.
Die Zubereitung des Fermentations-Nährmediums umfasst vorzugsweise: Abwiegen von 80g L-Sorbose, 20g Maisquellwasser, 12g Harnstoff, 1g KH₂PO₄, 0,5g MgSO₄, 1g CaCO₃, bis zu 1L mit Wasser auffüllen, den pH-Wert bis auf 7,0 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren, um das Fermentations- Nährmedium zu erhalten.
In der Methode werden, nachdem die Mischbakterien entwickelt sind, nach Dutzenden von Generationen der Subkultur, die Wachstumsrate von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans und die Effizienz zur Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Gluconobacter oxydans signifikant verbessert, so dass die Nutzungseffizienz des Nährmediums steigt, und die Umwandlungseffizienz der L-Sorbose steigt um 10%-15%.
Der dritte Aspekt dieser Offenbarung bietet eine Methode zur Entdeckung von Proteinänderungen verschiedener Generationen von gemischten industriellen Vitamin C-Bakterien während der Subkultur, die die folgenden Schritte umfasst:
Subkultur von Mischbakterien:
Festkultur:
Bereitstellung von 10-200µL Gluconobacter oxydans, bewahrt in einer 15-30%igen Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%) und 10-200µL Bacillus megaterium, bewahrt in einer 15-30%igen Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%), die in flüssigen Stickstoff eingelagert werden, wobei getrennt auf festem Nährmedium eingeimpft und bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultiviert wird;
(ii) Anzuchtkultur:
Getrennte Überführung des Bacillus megaterium und des Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(i) kultiviert, in Anzuchtmedium, bei 28-35°C 24-48 Std. lang unter Schütteln mit 200-280 U/min kultivieren, um die Bacillus megaterium-Anzuchtflüssigkeit und die Gluconobacter oxydans -Anzuchtflüssigkeit zu erhalten;
Einimpfen von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in neues Anzuchtmedium bis zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷- 2×10¹⁰ cfu/ml für Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸- 2×10¹¹ cfu/ml für Gluconobacter oxydans, bei 28-35°C unter Schütteln mit 200-280 U/min kultivieren und in neues Anzuchtmedium einimpfen, mit einem Subkultur-Zyklus von 24 Std. bis 48 Std. und einem Volumenverhältnis von 1% zu 10%, um über 100-150 Tage eine Subkultur durchzuführen, wobei 3-4 Probeentnahmezeiten gewählt und 3-4 Proben entnommen werden;
(iii) Trennung und Reinigung:
Abstreifen der in Schritt (1)(ii) erhaltenen Mischbakterien der 3-4 Proben zur Durchführung von Trennung und Reinigung, dann getrenntes Einimpfen auf festem Nährmedium und bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultivieren; dann getrennt in Anzuchtmedium überführen, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultivieren, um eine entwickelte Bacillus megaterium -Anzuchtflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans -Anzuchtflüssigkeit zu erhalten; Aufbewahrung in 15-30%iger Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%).
(iv) Kultivierung von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans verschiedener Entwicklungsperioden:
Einimpfung des entwickelten Bacillus megaterium und des entwickelten Gluconobacter oxydans nach Erhalt gemäß Schritt (1)(iii) getrennt im Fermentations-Nährmedium bis zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷ - 2×10¹⁰ cfu/ml für den entwickelten Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸ - 2×10¹¹ cfu/ml für den entwickelten Gluconobacter oxydans, Kultivierung über 10-15 Std. unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C;
Messung intrazellulärer Proteine:
Sammeln und Abschrecken der Zellen:
Getrennt die in Schritt (1)(iv) erhaltene Bacillus megaterium-Kultur und Gluconobacter oxydans-Kultur bei 4°C mit 4000-6000 U/min zentrifugieren, Zellen der unteren Schicht einsammeln, mit Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2-7,4 waschen, mit flüssigem Stickstoff abschrecken, um die metabolische Reaktion zu beenden; Aufbrechen der Zellen durch Schleifen mit flüssigem Stickstoff;
(ii) Extraktion intrazellularer Proteine:
Die zerbrochenen Zellen nehmen und sie getrennt in einer Menge von 80-100mg pro Röhrchen in Zentrifugenröhrchen platzieren, in jedes Röhrchen 0,5-1 mL Zell-Lyse-Lösung hinzugeben, Mischen, 20-50s lang auf Eis Ultraschall aussetzen; 5-15µL einer gemischten Enzymlösung aus DNase I/Rnase A im Massenverhältnis von 2-4:1 hinzugeben, mischen, 10-30min lang bei 4°C stehen lassen; 5-15µL einer 80-120mM Benzylsulfonyl-Fluorid-Isopropanol-Lösung hinzugeben, 1-3 Std. lang bei 4°C stehen lassen; 25-40 min lang mit 15000 U/min zentrifugieren; den Überstand abnehmen, um eine Proteinlösung zu erhalten;
, wobei die Zell-Lyse-Lösung Folgendes enthält: 8 mol.L^-1 Harnstoff, 3-[(3-Cholamidopropyl)-Diethylamin]-Propansulfonsäure in einer Massenkonzentration von 4%, 40 mM Tris und Wasser;
(iii) Messung der Proteinkonzentrationen:
Mit Hilfe eines Bradford-Sets Rinderserumalbumin von geringer Konzentration bis hoher Konzentration in eine Coomassie-Brilliant-Blau-G-250-Lösung hinzugeben, den Absorptionswert der in Schritt (2)(ii) erhaltenen Proteinlösungen bei 595nm messen, eine Standardkurve erstellen; die Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen messen;
(iv) Präzipitation der Proteine:
Die in Schritt (2)(ii) erhaltenen Proteinlösungen, die 50-100µg Protein enthalten, getrennt nehmen, zu jeder Lösung Aceton mit -20°C bis -40°C mit dem 4-6-fachen Volumen hinzugeben, bei -20°C bis -40°C 12-20 Std. stehen lassen; zentrifugieren, Überstand entfernen, das Präzipitat mit einer wässrigen Acetonlösung mit -20°C bis - 40°C mit einer Volumenkonzentration von 70-85% waschen; trocknen, um trockene Proteinpulver zu erhalten;
Reduktion und Enzymolyse der Proteine
Getrennt zu jedem der trockenen Proteinpulver mit 20-40µL 40-60 mM wässrige Triethyl-Ammonium-Bicarbonat Lösung hinzugeben, um die Proteine aufzulösen; dann 1-4µL Tri(2-Carboxyethyl)Phosphin hinzugeben und die Reduktionsreaktion bei 50-60°C 1-1,5 Std. lang laufen lassen, dann 1-2µL Methylthiosulfonsäure-Methylester hinzugeben, 10-15 min lang bei Zimmertemperatur reagieren lassen, um die Reduktionsreaktion zu beenden; dann 20-30 µL wässrige Trypsinlösung in einer Konzentration von 0,2-0,3µg/µL hinzugeben und die Proteolyse bei 37°C 12-18 Std. lang laufen lassen, um die enzymatischen Hydrolysate zu erhalten;
(vi) Markierungsproteine
Getrennt zu den in Schritt (2)(v) erhaltenen enzymatischen Hydrolysaten Markierreagenz iTRAQ, gelöst in 60-80µL Ethanol, hinzugeben und bei Zimmertemperatur 1-1,5 Std. lang reagieren lassen;
(vii) Mischen der Lösungen
Die vom Bacillus megaterium abgeleiteten Proteinlösungen, wie in Schritt (2)(vi) markiert, mischen; die vom Gluconobacter oxydans abgeleiteten Proteinlösungen, wie in Schritt (2)(vi) markiert, mischen; bei -40°C aufbewahren;
(viii) Identifikation differentiell exprimierter Proteine
Die beiden in Schritt (2)(vii) erhaltenen Gruppen gemischter Lösungen einem Q-TOF-Massenspektrum aussetzen, um das Proteom-Profil zu erhalten, wodurch man differentiell exprimierte Proteine von Proben gemischter Gruppen durch Quantifizierung erhält;
Clusteranalyse:
Standardisierung der in Schritt (2)(viii) erhaltenen Daten mit Expander4.0, dann Durchführung einer K-Means-Clusteranalyse, um Datenklassen mit verschiedenen variierenden Mustern und Kandidaten für differentielle Proteine zu erhalten;
Prozessanalyse
Graphische Darstellung der Inhalte der in Schritt (3) erhaltenen Kandidaten für differentielle Proteine als Funktion der Zeit, Beobachtung der variierenden Muster dieser Proteine und dann Entdeckung der Auswirkungen der Evolutions-Subkultur der Mischbakterien im Prozess der steigenden Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Gluconobacter oxydans.
Die Methode zeigt die Auswirkungen der Subkultur von Mischbakterien auf Änderungen intrazellulärer Proteine von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans, um so wichtige Proteine im Fermentationsprozess zu finden. Diese variierenden Muster von Proteininhalten bieten eine Basis für das Verständnis des inhärenten Mechanismus' des Fermentationsprozesses der Mischbakterien und liefern somit eine grundlegende Basis für die Optimierung des Fermentationsprozesses und eine steigende Vitamin C-Produktion. Sie liefern auch neue Einsichten und Methoden für die Untersuchung des industriellen Fermentationsprozess von Mischbakterien.
Der vierte Aspekt dieser Offenbarung bietet eine Methode für die Analyse von Änderungen der Phospholipide im Prozess der Subkultur von Vitamin C-Produktionsstämmen, die die folgenden Schritte umfasst:
Festkultur:
Bereitstellung von 10-500µL Gluconobacter oxydans, bewahrt in einer 15-30%igen Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%) und 10-500µL Bacillus megaterium, bewahrt in einer 15-30%igen Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%), die in flüssigen Stickstoff eingelagert werden, wobei getrennt in festes Nährmedium eingeimpft und 24-48 Std. lang bei 28-35°C kultiviert wird;
Aufzuchtkultur:
Getrennte Überführung des Bacillus megaterium und des Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Aufzucht-Nährmedium, Kultivierung bei 28-35°C 24-48 Std. lang unter Schütteln mit 200-280 U/min, um Bacillus megaterium -Aufzuchtflüssigkeit und Gluconobacter oxydans -Aufzuchtflüssigkeit zu erhalten;
Einimpfung des Bacillus megaterium und des Gluconobacter oxydans in neues Aufzucht-Nährmedium bis zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷- 2×10¹⁰ cfu/ml für den Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸- 2×10¹¹ cfu/ml für Gluconobacter oxydans, Kultivieren bei 28-35°C unter Schütteln mit 200-280 U/min und Einimpfen in neues Aufzucht-Nährmedium mit einem Subkultur-Zyklus von 24 bis 48 Std. und einem Volumenverhältnis von 1% zu 10%, um die Subkultur über 100-150 Tage durchzuführen, 3-5 Probenentnahmezeiten wählen und 3-5 Proben während 0-100 Tagen oder 0-150 Tagen entnehmen;
Trennung und Reinigung:
Abstreifen der durch die Subkultur in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien der 3-5 Proben, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann getrennt auf festem Nährmedium einimpfen und bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultivieren; dann getrennt in Aufzucht-Nährmedium überführen, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultivieren, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Aufzuchtflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Aufzuchtflüssigkeit zu erhalten;
Fermentation
Einimpfen des entwickelten Bacillus megaterium, des entwickelten Gluconobacter oxydans und einer Mischung des entwickelten Bacillus megaterium und des entwickelten Gluconobacter oxydans in Fermentations-Nährmedium bis zur Erreichung einer Dichte von 2×10⁷ - 2×10¹⁰ cfu/ml für den entwickelten Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸ - 2×10¹¹ cfu/ml für den entwickelten Gluconobacter oxydans, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 10-15 Std. lang kultivieren,
Extraktion der zellulären Phospholipide

(i) Die drei Zellsuspensionen in einem Volumen von 100-200 mL nehmen, wie unter Schütteln 10-15 Std. in Schritt (4) kultiviert, 3-10 min mit 1000-3000 U/min zentrifugieren, Überstand entfernen, die Zellen behalten, die Zellen mit Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2-7,4 1-3 mal waschen, unter denselben Bedingungen zentrifugieren, Überstand entfernen, um die Zellen zu erhalten;
(ii) die Zellen von Schritt (i) trocknen, um ein Pulver zu erhalten, 200-300 mg des Zellpulvers nehmen, in das Zentrifugenröhrchen A stecken, 0,5-0,8mL Reinstwasser hinzugeben, gründlich durchmischen;
(iii) 2-4ml Extraktionslösung in das Zentrifugenröhrchen A hinzufügen, gründlich mischen; mit 1000-3000 U/min 3-10 min lang zentrifugieren, die Lösung schichten, aus der unteren Schicht die organische Lösungsmittelschicht nehmen, in das Zentrifugenröhrchen B stecken;
(iv) Schritt (iii) 2-4 mal wiederholen, bis die Ablagerung der Zellen abgeschlossen ist;
(v) In das Zentrifugenröhrchen B 0,5-1,5 mL 0,8-1,2 mol/L wässrige KCI-Lösung hinzugeben, gründlich mischen, mit 2000-4000 U/min 3-10 min lang zentrifugieren, den Überstand, der wasserlösliche Verunreinigungen enthält, entfernen;
(vi) In das Zentrifugenröhrchen B 1-3 mL Reinstwasser hinzugeben, gründlich mischen, mit 2000-4000 U/min 3-10 min lang zentrifugieren und Überstand entfernen;
(vii) In der in Schritt (vi) erhaltenen Mischung über Destillation oder Stickstoffspülung das organische Lösungsmittel trocknen, um eine Extraktmischung ganzer Phospholipide zu erhalten;
(viii) Die Extraktmischung ganzer Phospholipide in 0,2-2 mL einer Aufbewahrungslösung auflösen, um eine Probe zu erhalten, und unter -40°C lagern;
(ix) Vor dem Nachweis Phospholipid-Standards zur Probe hinzugeben, so dass die endgültige Konzentration der Phospholipid-Standards 0,5-1,5 µg/mL beträgt;

LC-MS-Nachweis:
Überprüfung der mit Phospholipid-Standards, wie in Schritt (5) erhalten, angereicherten Probe mit Hilfe von LC-MS, um die molekulare Struktur und Gehaltsdaten der Phospholipide in der Subkultur der Mischbakterien für die Vitamin C-Produktion zu erhalten;
Multivariate statistische Analyse
Die Gehaltsdaten der Phospholipide in der Subkultur der Mischbakterien für die Vitamin C-Produktion, die in Schritt (6) erhalten wurden, werden einer multivariaten statistischen Analyse unterzogen, um differentielle Phospholipid-Marker zur Unterscheidung der Vitamin C-Produktionsstämme zu verschiedenen Zeitpunkten der Subkultur zu erhalten;
Prozessanalyse
Graphische Darstellung der Gehaltswerte der differentiellen Phospholipidmarker, wie sie in Schritt (7) erhalten wurden, als Funktion der verschiedenen Zeitpunkte der Subkultur, Beobachtung und Analyse der variierenden Muster dieser Phospholipidmoleküle, und dann Entdeckung der Phospholipidmoleküle und relevanten metabolischen Wege derselben, die eine kritische Rolle bei der Subkultur der gemischten Bakterien spielen, somit erhält man eine Anleitung zur Optimierung der Stammmodifikation und Kultivierungsbedingungen zur Steigerung der Menge an 2-Keto-L-gulonsäure.
Die Methode für die Vorbereitung des trockenen Zellpulvers umfasst vorzugsweise das Schleifen der Zellen in Mörtel mit flüssigem Stickstoff.
Die Destillation in Schritt (5)(vii) ist vorzugsweise die reduzierte Druckdestillation bei 30-40°C.
Die Phospholipid-Standards sind mindestens zwei von Phosphatidyl-Glyzerin, Phosphatidyl-Ethanolamin, Lysophosphatidyl-Ethanolamin und Phosphatidsäure.
Phosphatidyl-Glyzerin, Phosphatidyl-Ethanolamin, Lysophosphatidyl- Ethanolamin oder Phosphatidsäure enthalten hydrophobe Endstücke, die jeweils eine Länge von 10-20 Kohlenstoffatomen haben.
Die LC-MS-Nachweisbedingungen sind vorzugsweise:

Chromatographie-Säule: Hypersil GOLD Silica, 150mm × 2,1mm, 5µm;
Probenladung: 10 µL;
Säulentemperatur: 25°C;
Mobile Phase A(%): Chloroform (89,5), Methanol (10), Ammoniumhydroxid (0,5);
Mobile Phase B(%): Chloroform (55), Methanol (39), Ammoniumhydroxid (0,5), Wasser (5,5);
Gradientenprogramm: 0-7 min, 20-30% B; 7-15 min 30-40% B; 15-20 min 40-50% B; 20-25 min 50% B; 25-35min, 50-20% B; 35-45min, 20% B;
Ionisierungsmodus: ESI (negativer Ionenmodus);
Scanmodus: MS Scan;
Scanbereich: m/z 400-900;
Scangeschwindigkeit: 1000 Scans/s;
Kapillarspannung: 3 KV;
Kegelspannung: 30 V;
Extraktionsspannung: 3 V;
Ionenquellentemperatur: 100°C;
Temperatur des Desolvatisierungsgases: 350°C;
Kegelgasfluss: 50 L/Hr
Fluss des Desolvatisierungsgases: 400 L/Hr;
Eingangs-/Ausgangsenergie: 50;
Kollisionsenergie: 2;
HM1/LM1/HM2/LM2: 15.0;
Ionenenergie 1: 1.0;
Ionenenergie 2: 2.0.

Die multivariate statistische Analyse umfasst die Durchführung einer Analyse der wichtigsten Komponenten nach einer Pareto-Skalierung.
Offenbart ist eine Methode für die Analyse von Änderungen der Phospholipide während der Subkultur der Mischbakterien für die Produktion von Vitamin C, die Methode beinhaltet die Extraktion und Analyse ganzer Phospholipide, die erhaltenen Phospholipid-Daten werden mit einer multivariaten statistischen Analyse analysiert, die qualitative Analyse und quantitative Analyse der Phospholipidmoleküle der Vitamin C-Produktionsstämme verschiedener Subkulturanzahlen unter den Bedingungen alleiniger und gemischter Kultur werden durchgeführt, um Phospholipidmoleküle für die Verbesserung der Interaktion zweier Vitamin C-Produktionsbakterien und deren metabolischer Wege zu finden und eine Methode für deren Analyse zu bieten, was sehr wichtig für die Optimierung der Stammmodifikation und der Kultivierungsbedingungen ist, mit dem Ziel der Steigerung der Menge an 2-Keto-L-gulonsäure.
Der fünfte Aspekt dieser Offenbarung liefert eine Methode für die Entdeckung von Änderungen der Nahrungsumgebung im Prozess der Subkultur von Vitamin C-Produktionsstämmen, die die folgenden Schritte umfasst:
Subkultur von Mischbakterien:
Festkultur:
Bereitstellung von 10-500µL Gluconobacter oxydans, bewahrt in einer 15-30%igen Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%) und 10-500µL Bacillus megaterium, bewahrt in einer 15-30%igen Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%), die in flüssigen Stickstoff eingelagert werden, wobei getrennt in feste Nährmedien eingeimpft und bei 28-35°C 24-48 Std. kultiviert wird;
(ii) Anzuchtkultur:
Getrennte Überführung von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(i) kultiviert, in das Anzuchtmedium, bei 28-35°C 24-48 Std. lang unter Schütteln mit 200-280 U/min kultivieren, um Bacillus megaterium - Anzuchtflüssigkeit und Gluconobacter oxydans - Anzuchtflüssigkeit zu erhalten;
Einimpfung des Bacillus megaterium und des Gluconobacter oxydans in neues Anzuchtmedium bis zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷- 2×10¹⁰ cfu/ml für Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸- 2×10¹¹ cfu/ml für Gluconobacter oxydans, bei 28-35°C unter Schütteln mit 200-280 U/min kultivieren und in neues Anzuchtmedium einimpfen, mit einem Subkultur-Zyklus von 24 Std. bis 48 Std. und einem Volumenverhältnis von 1% zu 10%, um 100-150 Tage lang eine Subkultur durchzuführen, wobei 3-4 Probenentnahmezeiten gewählt und in einem Zeitraum von 0-100 Tagen oder 0-150 Tagen 3-4 Proben entnommen werden;
(iii) Trennung und Reinigung:
Abstreifen der Mischbakterien der in Schritt (1)(ii) erhaltenen 3-4 Proben, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann getrennt auf festem Nährmedium einimpfen, bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultivieren; dann getrennt in Anzuchtmedium überführen, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 24-48 Std. lang kultivieren, um eine entwickelte Bacillus megaterium - Anzuchtflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans - Anzuchtflüssigkeit zu erhalten; in einer Glyzerin-Wasser-Lösung in einer Volumenkonzentration von 15-30% aufbewahren;
(iv) Fermentation
Einimpfen des Bacillus megaterium und des Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(iii) erhalten, sowie der Mischbakterien der zwei Bakterien getrennt in neues Anzuchtmedium bis zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷ - 2×10¹⁰ cfu/ml für den entwickelten Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸ - 2×10¹¹ cfu/ml für den entwickelten Gluconobacter oxydans, unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C 10-15 Std. lang kultivieren;
Feststellung von Substanzen in Ernährungsumgebung:
Sammeln von Kulturlösungen:
Getrennt 1-2 mL der Bacillus megaterium - Kulturlösung, der Gluconobacter oxydans - Kulturlösung und der Mischbakterien - Kulturlösung von Schritt (1)(iv) nehmen, mit 5000-10000 U/min zentrifugieren, Überstand einsammeln, mit 0,22µm Millipore- Zellulose-Filtrationsmembran filtern, um ein Filtrat zu erhalten;
(ii) Vorbereitung der Proben:
10-50µL des Filtrats aus Schritt (2)(i) nehmen und in das Zentrifugenröhrchen stecken, 50-200µL einer 0,04-0,14 mg/ml mit Deuterium markierten Bernsteinsäure-Methanol-Lösung als interne Standardsubstanz hinzufügen, gefriertrocknen; 40-100 µL einer 20 mg/mL Methoxyamin- Hydrochlorid-Pyridin-Lösung hinzufügen und Oximierungsreaktion in einem Wasserbad mit 30-40°C 60-120 min lang durchführen; dann 50-100 µL N-Methyl-N-Trimethylsilyltrifluoroacetamid hinzufügen und Silanisierungsreaktion 30-60min lang in einem Wasserbad mit 35-40°C durchführen;
(iii) GC-TOF/MS-Nachweis:
1 µL der in Schritt (2)(ii) erhaltenen Probe in einen Gaschromatograph laden, bei dem die Chromatographiesäule DB-5MS die Spezifikation 30 m × 0,25 mm i.d., der Injektionsport eine Temperatur von 250-280°C hat, das Trägergas hochreines Helium ist, die Flussrate 0,6-0,8 m/min ist und das Teilungsverhältnis 3:1-20:1 ist, Säulenofentemperaturprogrammierung: Anfangs 50-80°C, 2-5 min lang halten, dann mit einer Rate von 4°C/min bis 8°C/min erhöhen, bis 260-300°C erreicht sind, dies 3-8min lang halten, EI-Ionisationsquelle nutzen, Quellentemperatur 230-260°C, Detektorspannung 2300V bis 2700V, Ionisationsspannung 60-80eV, Strom 30-50µA; Massenspektrum-Nachweisbereich 50-800 m/z; NIST 2005-Datenbank für die Entdeckung der Nahrungsumgebungssubstanzen verwenden, die Software Masslynx 4.1 für die Verarbeitung der Massenspektrumsdaten und die Messung des relativen Gehalts der Nahrungsumgebungssubstanzen verwenden; Integrationsbehandlung von Bereichen von Chromatographspitzen durchführen und mit Spitzenbereichen des internen Standards vergleichen, um den relativen Gehalt der Nahrungsumgebungssubstanzen zu erhalten;
Analyse der Hauptkomponenten:

(i) Durchführung einer Pareto-Skalierung der in Schritt (2) erhaltenen Daten über den relativen Gehalt der Nahrungsumgebungssubstanzen;
(ii) Durchführung der Analyse der Hauptkomponenten auf der Basis der Vorbehandlungsdaten aus Schritt (3)(i) mit Hilfe der Software Matlab 7.0 (Mathworks. Inc.), um die differentiellen Nahrungsumgebungsmarker zu erhalten;

Prozessanalyse
Graphische Darstellung des relativen Gehalts der differentiellen Nahrungsumgebungsmarker als Funktion verschiedener Subkultur-Zeiten, Beobachtung der variierenden Muster dieser Substanzen und Entdeckung von Änderungen der Nahrungsumgebung während der Subkultur von Vitamin C-Produktionsstämmen.
Diese Methode kann angewandt werden, um die Auswirkungen der Subkultur der Mischbakterien auf Bacillus megaterium, Gluconobacter oxydans und das Mischbakteriensystem zu offenbaren, wichtige Substanzen in der Nahrungsumgebung während der Subkultur zu zeigen, und die variierenden Muster des Gehalts dieser Substanzen bieten eine Basis für das Verständnis des Wirkmechanismus', der das Wachstum der Produktion des Gluconobacter oxydans und der 2-Keto-L-gulonsäure verursacht, um eine grundlegende Basis für die weitere Optimierung des Fermentationsprozesses zu bieten und die Vitamin C-Produktion zu steigern.
Der sechste Aspekt dieser Offenbarung bietet eine Methode für die Analyse und den Nachweis von Änderungen kleiner Moleküle (Metaboliten) während des Subkulturprozesses von Vitamin C-Produktionsstämmen, die die folgenden Schritte umfassen:
Subkultur von Mischbakterien:
Festkultur:
Bereitstellung von Gluconobacter oxydans, bewahrt in 15-30%iger Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%) und Bacillus megaterium, bewahrt in 15-30%iger Glyzerin-Wasser-Lösung (Volumen-%), die in flüssigem Stickstoff gelagert werden, wobei getrennt auf festem Nährmedium eingeimpft und bei 28-35°C 24-48 Std. kultiviert wird;
(ii) Anzuchtkultur:
Getrennte Überführung von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(i) kultiviert, in Anzuchtmedium, bei 28-35°C 24-48 Std. lang unter Schütteln mit 200-280 U/min kultivieren, um Bacillus megaterium - Anzuchtflüssigkeit und Gluconobacter oxydans - Anzuchtflüssigkeit zu erhalten;
Einimpfung von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in neues Anzuchtmedium bis zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷- 2×10¹⁰ cfu/ml für Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸- 2×10¹¹ cfu/ml für Gluconobacter oxydans, bei 28-35°C unter Schütteln mit 200-280 U/min kultivieren und in neues AnzuchtNährmedium einimpfen, mit einem Subkulturzyklus von 24 Std. bis 48 Std. und einem Volumenverhältnis von 1% zu 10%, um eine Subkultur über 100-150 Tage durchzuführen, um so Zellen von Mischbakterien zu erhalten, 3-5 Probenentnahmezeiten wählen und über 0-100 Tage oder 0-150 Tage 3-5 Proben nehmen;
(iii) Trennung und Reinigung:
Abstreifen der Mischbakterien der in Schritt (1)(ii) erhaltenen 3-5 Proben, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann getrennt auf festem Nährmedium einimpfen und bei 28-35°C 24-48 St. kultivieren; dann getrennt in Anzuchtmedium überführen und 24-48 Std. unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C kultivieren, um jeweils eine entwickelte Bacillus megaterium - Anzuchtflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans - Anzuchtflüssigkeit zu erhalten; in einer Glyzerin-Wasser-Lösung in einer Volumenkonzentration von 15-30% aufbewahren;
(iv) Fermentation
Einimpfen des entwickelten Bacillus megaterium und des Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(iii) erhalten, sowie der Mischbakterien der zwei Bakterien jeweils in neues Anzuchtmedium, bis eine Dichte von 2×10⁷ - 2×10¹⁰ cfu/ml für den entwickelten Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁸ - 2×10¹¹ cfu/ml für den entwickelten Gluconobacter oxydans erreicht ist, unter Schütteln bei 200-280 U/min bei 28-35°C 10-15 Std. lang kultivieren;
Vorbereitung und Nachweis der Proben intrazellulärer kleiner Moleküle (Metaboliten)

(i) Getrennt 100-200 mL von drei in Schritt (1)(iv) erhaltenen Zellsuspensionen nehmen, mit 1000-3000 U/min jeweils 3-10 min lang zentrifugieren, Überstand entfernen, Zellen behalten, die Zellen mit einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2-7,4 1-3 mal waschen, unter denselben Bedingungen zentrifugieren, Überstand entfernen, um die Zellen zu erhalten;
(ii) die Zellen aus Schritt (2)(i) trocknen, so dass sie ein trockenes Pulver bilden, getrennt 30-60mg trockenes Zellpulver nehmen, jeweils in 3 Zentrifugenröhrchen stecken, dann 0,5-1,5 mL Extraktionslösung hinzugeben, 30-70µL 0,020-0,060 mg/mL deuterierte Bernsteinsäure als internen Standard hinzufügen, gründlich durchmischen; mit 1000-3000 U/min 3-10 min lang zentrifugieren, Überstand abnehmen, in 3 neue Zentrifugenröhrchen füllen und gefriertrocknen;
(iii) In die in Schritt (2)(ii) erhaltenen 3 Zentrifugenröhrchen jeweils 40-100µL 10-30mg/mL Methoxyamin-Hydrochlorid-Pyridin-Lösung hinzugeben und die Oximationsreaktion in einem Wasserbad mit 30-40°C 60-120 min lang durchführen; dann 50-100 µL N-Methyl-N-Trimethylsilyltrifluoroacetamid hinzufügen und die Silanisierungsreaktion in einem Wasserbad mit 35-40°C 30-60min lang laufen lassen;

Die Extraktionslösung ist eine wässrige Methanollösung mit einem Volumenanteil von 50-70%;
(iv) GC-TOF/MS-Nachweis:
1 µL der in Schritt (2)(iii) erhaltenen Probe in einen Gaschromatograph laden, wobei die Chromatographiesäule DB-5MS eine Spezifikation von 30 m × 0,25 mm i.d. und der Injektionsport eine Temperatur von 250-280°C hat, das Trägergas hochreines Helium ist, mit konstantem Druck von 80-100 KPa, einem Teilungsverhältnis von 3:1-20:1, Säulenofentemperaturprogrammierung: Anfangs 50-80°C, 3-6 min lang halten, dann mit einer Rate von 4°C/min bis 8°C/min bis auf 260-300°C erhöhen, dies 3-8min lang halten, EI-Ionisationsquelle verwenden, Quellentemperatur 230-260°C, Detektorspannung 2300V bis 2700V, Ionisationsspannung 60-80eV, Strom 30-50µA; Massenspektrum-Nachweisbereich 50-800 m/z; NIST 2005-Datenbank für die Entdeckung kleiner Moleküle (Metaboliten) verwenden, die Software Masslynx 4.1 für die Verarbeitung der Massenspektrumsdaten und die Messung des relativen Gehalts der Metaboliten anwenden; Integrationsbehandlung von Bereichen chromatographischer Spitzen durchführen und mit Spitzenbereichen des internen Standards vergleichen, um den relativen Gehalt der kleinen Moleküle (Metaboliten) zu erhalten;
Analyse der Hauptkomponenten:

(i) Pareto-Skalierung der in Schritt (2)(iv) erhaltenen Daten des relativen Gehalts der kleinen Moleküle (Metaboliten) durchführen;
(ii) Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten auf der Basis der Vorbehandlungsdaten mit Hilfe der Software SIMCA-P 11.5, um kleine Molekül-(Metaboliten)-Marker für die Unterscheidung von Vitamin C-Produktionsstämmen verschiedener Subkulturzeiten zu erhalten;

Prozessanalyse
Graphische Darstellung des Gehalts der kleinen Molekül- (Metaboliten-) Marker als Funktion verschiedener Subkulturzeiten, Beobachtung der variierenden Muster der kleinen Molekül- (Metaboliten-) Marker und Entdeckung von Änderungen der intrazellulären kleinen Moleküle (Metaboliten) während der Subkultur von Vitamin C-Produktionsstämmen.
Die Methode für die Vorbereitung des Zelltrockenpulvers umfasst das Schleifen der Zellen in flüssigem Stickstoff.
Der siebente Aspekt dieser Offenbarung bietet eine Methode für die Modifikation des Gluconobacter oxydans durch Metabolic Engineering, um die Anzahl der Kopien des darin enthaltenen Sorboson-Dehydrogenase-Gens zu steigern und die Fähigkeit der Mischbakterienfermentation von Gluconobacter oxydans und Bacillus megaterium bei der Umwandlung von L-Sorbose in 2-Keto-L-gulonsäure zu erhöhen, die die folgenden Schritte umfasst:
In-vitro-Vermehrung des Sorboson-Dehydrogenase-Gens
Extraktion des Genoms des Gluconobacter oxydans mit einem Bakteriengenom-Extraktionsset; 1µl der Genomlösung, 4µl des 5xFastPfu-Puffers, 2µl von 20mM dNTP, 0,4µl des 20nM-Füllers 1, 0,4µl des 20nM Füllers 2, 11,8µl sterilisiertes Wasser, 0,4µl des FastPfu-Enzyms nehmen, gründlich in PCR-Gefäß mischen; das PCR-Gefäß in dem PCR-Instrument platzieren, um die Amplifikationszyklen zu durchlaufen, Amplifikationsprogrammierung: Bei 95°C 2min lang; 95°C 20s lang, 55°C 35s lang, 72°C 2min lang, insgesamt 25 Zyklen; 72°C 5min lang; 4°C 30min lang das PCR-Produkt dem Agarose-Gel-Elektrophorese aussetzen, PCR-Produktstreifen abschneiden und das PCR-Amplifikationsprodukt mit Hilfe des Agarosegel-Wiederherstellungssets reinigen.
Der Füller 1 hat eine Sequenz von: 5'- CCCAAGCTTGACTGGCAGCAGCGCAAC-3'
Der Füller 2 hat eine Sequenz von: 5'-CGCGGATCCCCGTGATAGCGGCACATGTC-3'
Aufbau des Vektors zur Codierung der Sorboson-Dehydrogenase:
8µl der in Schritt (1) erhaltenen PCR-Amplifikationsproduktlösung nehmen, gründlich mischen mit 1µl 10×Verdaupuffer, 0,5µl des Hindlll-Enzyms, 0,5µl des BamHI-Enzyms, enzymatische Verdaureaktion bei 37°C 2 Std. lang laufen lassen; das Reaktionsprodukt einer Agarosegel-Elektrophorese unterziehen, Produktstreifen aus der enzymatischen Verdaureaktion abschneiden, das PCR- Enzymverdauprodukt mit Hilfe des Agarosegel-Wiederherstellungssets reinigen. 8µl einer pBBR1MCS-Lösung nehmen, gründlich 1µl des 10×Verdaupulvers, 0,5µl des Kpnl-Enzyms und 0,5µl des Hindlll-Enzyms durchmischen, die enzymatische Verdaureaktion bei 37°C 2 Std. lang laufen lassen; das Produkt der Reaktion einer Agarosegel-Elektrophorese unterziehen, Produktstreifen aus der enzymatischen Verdaureaktion abschneiden, das Vektorprodukt des Enzymverdaus mit Agarosegel-Wiederherstellungsset reinigen. 5,5µl des PCR-Enzymverdauprodukts, 3µl des Enzymverdau-Vektorprodukts, 1µl des 10×Ligasepuffers und 0,5µl DNA-Ligase nehmen, gründlich durchmischen, Ligationsreaktion bei 22°C 30min lang durchführen. Umwandlung des Ligationsprodukts in E. coli DH5a mit Hilfe einer chemischen Transformationsmethode, Schichtauflage auf festes, Antibiotika enthaltendes LB-Nährmedium, bei 37°C 12 Std. lang kultivieren. Die erhaltene einzelne Kolonie bei 37°C in flüssigem LB-Nährmedium 12 Std. lang kultivieren, Plasmid mit Hilfe eines Plasmid-Minisets extrahieren, um den die Sorboson-Dehydrogenase codierenden Vektor zu erhalten.
Den die Sorboson-Dehydrogenase codierenden Vektor in Gluconobacter oxydans umwandeln
Gluconobacter oxydans auf feste Nährmedien schichten, bei 30°C 48 Std. lang kultivieren; die Bakterien mit 2ml sterilisiertem Wasser abwaschen, 10min lang einem Eisbad unterziehen, bei 4°C mit 4000U/min 5min lang zentrifugieren, dann die Zellen einsammeln, einmal mit vorgekühltem sterilisiertem Wasser waschen, zweimal mit 10%igem Glyzerin waschen, mit 100µl 10%igem Glyzerin resuspendieren; gründlich durchmischen mit 10µl der Lösung des die Sorboson-Dehydrogenase codierenden Vektors, wie in Schritt (2) erhalten, und in Elektrotransformationsbecher füllen, 5 min lang einem Eisbad unterziehen, den Elektrotransformationsbecher in das Elektrotransformationsinstrument setzen und einem 1800V-Schock aussetzen; das geschockte Produkt mit 900µl Anzuchtmedium vermischen, bei 30°C und 140U/min 2 Std. lang kultivieren, die Kultur auf feste Nährmedien schichten, bei 30°C 4 Tage lang kultivieren, die erhaltene einzelne Kolonie in Anzuchtmedium überführen, bei 30°C und 250U/min kultivieren, um Gluconobacter oxydans zu erhalten, das den die Sorboson-Dehydrogenase codierenden Vektor enthält.
Der feste Nährmedium enthält: 20g L-Sorbose, 3g Maisquellwasser, 3g Rindfleischextrakt, 3g Hefeextraktpulver, 1g Harnstoff, 10g Pepton, 20g Agar, 1g KH₂PO₄, 0,2g MgSO₄, 1g CaCO₃, bis zum 1L mit Wasser auffüllen, auf einen pH-Wert von 6,8 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren.
Das Anzuchtmedium enthält: 20g L-Sorbose, 3g Maisquellwasser, 3g Rindfleischextrakt, 3g Hefeextraktpulver, 1g Harnstoff, 10g Pepton, 1g KH₂PO₄, 0,2g MgSO₄, 1g CaCO₃, bis zum 1 L mit Wasser auffüllen, auf einen pH-Wert von 6,8 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren.
Fermentation mit Mischbakterien
Einimpfung des Gluconobacter oxydans, der den die Sorboson-Dehydrogenase codierenden Vektor enthält, wie in Schritt (3) erhalten, und des Bacillus megaterium in Fermentations-Nährmedium, um eine Dichte von 4×10⁸ cfu/ml für den Gluconobacter oxydans zu erhalten, der den die Sorboson-Dehydrogenase codierenden Vektor enthält, und eine Dichte von 4×10⁸ cfu/ml für den Bacillus megaterium, dann bei 30°C und 250U/min 120 Std. lang kultivieren, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Das Fermentations-Nährmedium wird folgendermaßen vorbereitet: Abwiegen von 80g L-Sorbose, 20g Maisquellwasser, 12g Harnstoff, 1g KH₂PO₄, 0,5g MgSO₄, 1g CaCO₃, bis zum 1L mit Wasser auffüllen, auf einen pH-Wert von 7,0 anpassen, bei 121°C 20 min lang sterilisieren.
Diese Methode kann die Zucker-Säure-Umwandlungsrate bei der Umwandlung von L-Sorbose in 2-Keto-L-gulonsäure durch Fermentation von Mischbakterien von Gluconobacter oxydans und Bacillus megaterium erhöhen.
Der achte Aspekt dieser Offenbarung bezieht sich auf eine Methode zum Nachweis von Änderungen intrazellulärer Proteine im Prozess der Anwendung von Glutathion zur Steigerung der Menge an 2-Keto-L-gulonsäure, die von Gluconobacter oxydans produziert wird, die die folgenden Schritte umfasst:
Feststellung der intrazellulären Proteine:
Einsammeln und Abschrecken der Zellen:
3-5 Teile von Gluconobacter oxydans nehmen und getrennt in einem Volumenverhältnis von 8-16% in Fermentations-Nährmedium A einimpfen, weitere 3-5 Teile des Gluconobacter oxydans nehmen und getrennt in einem Volumenverhältnis von 8-16% in das Fermentations-Nährmedium B einimpfen, die beiden geimpften Nährmedien einer Kultur und Fermentation bei 28°C bis 32°C mit 200-250 U/min unterziehen, nach 1 Std. und 15 Std. Fermentationsbrühenproben nehmen, bei 4°C und 4000-6000U/min zentrifugieren, Zellen der unteren Schicht einsammeln, mit einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2-7,4 waschen, mit flüssigem Stickstoff abschrecken, um die metabolische Reaktion zu beenden; Zellen durch Schleifen mit flüssigem Stickstoff zerbrechen, um 3-5 Teile der abgeschreckten zerbrochenen Zellen vom Nährmedium A nach 1 Std. Fermentation, 3-5 Teile der abgeschreckten zerbrochenen Zellen vom Nährmedium A nach 15 Std. Fermentation, 3-5 Teile der abgeschreckten zerbrochenen Zellen vom Nährmedium B nach 1 Std. Fermentation und 3-5 Teile der abgeschreckten zerbrochenen Zellen vom Nährmedium B nach 15 Std. Fermentation zu erhalten;
Das Fermentations-Nährmedium A enthält: 80 g·L^-1 Sorbose, 20 g·L^-1 Maisquellwasser, 1 g·L^-1 KH₂PO₄, 0,2 g·L^-1 MgSO₄, und 12 g·L^-1 Harnstoff, der Rest ist Wasser;
Das Fermentations-Nährmedium B enthält: 80 g·L^-1 Sorbose, 20 g·L^-1 Maisquellwasser, 1 g·L^-1 KH₂PO₄, 0,2 g·L^-1 MgSO₄, und 12 g·L^-1 Harnstoff, 0,8~1,5 mg·mL^-1 Glutathion, und der Rest ist Wasser;
(ii) Extraktion intrazellulärer Proteine:
Die zerbrochenen in Schritt (i) erhaltenen Zellen nehmen, jeden Teil in einer Menge von 100-200 mg in Zentrifugenröhrchen stecken, in jedes Röhrchen 0,5-2 ml Zell-Lyse-Lösung hinzugeben, gründlich durchmischen, auf Eis 20-50s lang mit Unterbrechungen mit Ultraschall behandeln; 5-15µL einer Mischenzymlösung aus DNase I/Rnase A in einem Massenverhältnis von 2-4:1 hinzugeben, gründlich durchmischen, bei 4°C 10-30min lang stehen lassen; 5-15µL 80-120mM Phenylmethylsulfonyl-Fluorid-Isopropanol-Lösung hinzufügen, bei 4°C 1-3 Std. lang stehen lassen; mit 15000 U/min 25-40 min lang zentrifugieren; Überstand wegnehmen, um eine Proteinlösung zu erhalten; wobei die Zell-Lyse-Lösung Folgendes enthält: 8 mol.L^-1 Harnstoff, 3-[(3-Cholamidopropyl) - Diethylamin]-Propansulfonsäure in einer Massenkonzentration von 4%, 40 mM Tris, und der Rest ist Wasser;
(iii) Messung der Proteinkonzentrationen
Mit Hilfe eines Bradford-Sets, Rinderserum-Albumin von niedriger Konzentration bis zu hoher Konzentration in eine Coomassie-Brilliant-Blau-G-250- Lösung hinzugeben, die Absorptionswerte bei 595nm der in Schritt (ii) erhaltenen Proteinlösungen messen, Standardkurve erstellen; Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen messen;
(iv) Präzipitation der Proteine:
Getrennt die Proteinlösungen, die 50-150µg Protein, wie in Schritt (iii) erhalten, nehmen, Aceton mit -20°C bis -40°C in 4-6-fachem Volumen zu jeder der Lösungen hinzufügen, 12-20 Std. lang präzipitieren; zentrifugieren, Überstand entfernen, das Präzipitat mit wässriger Acetonlösung mit -20°C bis -40°C mit einer Volumenkonzentration von 70-85% waschen; zur Anwendung gefriertrocknen; bei -80°C lagern;
Reduktion und Enzymolyse der Proteine
Getrennt zu jedem der in Schritt (iv) erhaltenen trockenen Proteine 10-40µL 40-60 mM wässrige Triethyl-Ammoniumbicarbonat-Lösung hinzufügen, um die Proteine aufzulösen;
1-4µL Tri(2-Carboxylethyl)-Phosphin hinzugeben, Reduktionsreaktion jedes Proteins bei 50-60°C 1 Std. lang durchführen, dann 1-2µL Methylthiosulfonsäure-Methylester hinzufügen, bei Zimmertemperatur 10-15 min lang reagieren lassen, um die Reduktionsreaktion zu beenden;
Zu obiger Lösung 20-30 µL wässrige Trypsinlösung in einer Konzentration von 0,2-0,3µg/µL hinzufügen und Proteolyse bei 37°C 12-18 Std. lang durchführen;
(vi) Markerproteine
Zu jeder der in Schritt (v) erhaltenen Proteolyselösungen getrennt iTRAQ-Markerreagenz, in 60-80µL Ethanol aufgelöst, hinzufügen und 1 Std. lang bei Zimmertemperatur reagieren lassen;
(vii) Mischen der Lösungen
Die in Schritt (vi) erhaltenen Lösungen mischen, um 3-5 gemischte Lösungen zu erhalten, so dass jede der gemischten Lösungen die markierten Proteine enthält, die durch 1 Std. Fermentation in Nährmedium A erhalten und den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurden, sowie die markierten Proteine, die durch 15 Stunden Fermentation in Nährmedium A erhalten und den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurden, die markierten Proteine, die durch 1 Std. Fermentation in Nährmedium B erhalten und den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurden und die die markierten Proteine, die durch, die durch 15 Std. Fermentation in Nährmedium B erhalten und den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurden; dann bei -20°C lagern;
(viii) Identifikation differentiell exprimierter Proteine
Die in Schritt (vii) erhaltene gemischte Lösung einer Q-TOF-Massenspektrums-Identifikation unterziehen, um das Proteomprofil zu erhalten, wobei man differentiell exprimierte Proteine von Proben jeder gemischten Gruppe durch Quantifizierung erhält;
Analysis der Hauptkomponenten:
Standardisierung der in Schritt (1)(viii) erhaltenen Daten mit Hilfe von Matlab, dann einer Analyse der Hauptkomponenten unterziehen, um Datenklassen mit variierenden Mustern und Kandidaten für differentielle Proteine zu erhalten;
Prozessanalyse
Graphische Darstellung des Gehalts der in Schritt (2) erhaltenen Kandidaten für differentielle Proteine als Funktion der Zeit, Beobachtung der variierenden Muster dieser Proteine und dann Nachweis der Wirkungen des Glutathions im Prozess der Steigerung der Menge an 2-Keto-L-gulonsäure, die durch Gluconobacter oxydans produziert wird.
Die Methode zeigt die variierenden Muster intrazellulärer Proteine von Gluconobacter oxydans im Beisein der Wirkung des Glutathion, um wichtige Proteine im Fermentationsprozess zu finden. Diese variierenden Proteingehaltsmuster bieten eine Basis für das Verständnis des inhärenten Mechanismus' des Fermentationsprozesses und somit eine fundamentaale Grundlage für die Optimierung des Fermentationsprozesses und die Steigerung der Vitamin C-Produktion und der molekularen Modifikation von Gluconobacter oxydans. Sie liefern auch Einsichten und Methoden für die Untersuchung des industriellen Fermentationsprozesses von Mischbakterien.
Der neunte Aspekt dieser Offenbarung bezieht sich auf eine Methode zur Ermittlung von Qualitätskontrollindizes von Maisquellwasser als Rohstoff für die Fermentation, die die folgenden Schritte umfasst:
Ermittlung der chemischen Bestandteile des Maisquellwassers:
Vorbereitung der Proben:
0,5-2g homogenes Maisquellwasser als Fermentationsrohstoff in Zentrifugenröhrchen füllen, zentrifugieren und Überstand einsammeln; den erhaltenen Überstand mit Reinstwasser um das 10-40-fache Volumen verdünnen, 10-40µL entnehmen und in ein anderes Zentrifugenröhrchen füllen, 30-50µL 0,040 mg/ml mit Deuterium markierte Bernsteinsäure-Methanollösung als interne Standardsubstanz hinzugeben; gefriertrocknen, dann 50-100µL einer 20 mg/mL Methoxyamin-Hydrochlorid-Pyridin-Lösung hinzugeben und Oximationsreaktion in einem Wasserbad mit 30-40°C 60-120 min lang laufen lassen; dann 60-100µL N-Methyl-N-Trimethylsilyltrifluoroacetamid hinzufügen und Silanisierungsreaktion in Wasserbad mit 35-40°C 20-50min lang durchführen;
(ii) Gaschromatograph-Flugzeit-Massenspektrometrie- Untersuchungsmethode:
1 µL der in Schritt (i) erhaltenen Probe in einen Gaschromatograph laden, wobei die Chromatographiesäule DB-5MS eine Spezifikation von 30 m × 0,25 mm i.d. und der Injektionsport eine Temperatur von 250-280°C hat, das Trägergas hochreines Helium ist, Flussrate 0,6-0,8 m/min, Teilungsverhältnis 30:1-10:1, Säulenofentemperaturprogrammierung: Anfangs 50-80°C, 2-5 min lang halten, dann mit einer Rate von 4°C/min bis 8°C/min bis auf 250-300°C erhöhen, dies 8-10min lang halten, EI-Ionisationsquelle verwenden, Quellentemperatur 230-280°C, Detektorspannung 2300V bis 2700V, Ionisationsspannung 60-80eV, Strom 30-50µA; Massenspektrums-Nachweisbereich 50-800 m/z; die Datenbank NIST verwenden, um die Komponenten zu entdecken, die Software Masslynx 4.1 für die Verarbeitung der Massenspektrumsdaten und die Messung des relativen Gehalts der Komponenten anwenden; Integrationsbehandlung von chromatographischen Spitzenbereichen durchführen und mit Spitzenbereichen des internen Standards vergleichen, um den relativen Gehalt der chemischen Komponenten des Maisquellwassers als Fermentationsrohstoff zu erhalten;
Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate

(i) Standardisierung und Vorbehandlung der in Schritt (1) erhaltenen Daten;
(ii) Anwendung der Software SIMCA-P 11.5, um die Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate mit den vorbehandelten Daten durchzuführen, um Punktwert-Diagramme, Lastdiagramme und VIP-Diagramme zu erhalten, um die Ähnlichkeit und die Abweichungen der Proben zu zeigen; in den Punktwertdiagrammen ist die Ähnlichkeit der Proben umso größer, je näher die Entfernung zwischen den Proben ist, und je weiter die Entfernung, desto größer die Abweichungen zwischen den Proben, so dass sie verwendet werden können, um Ähnlichkeiten und Abweichungen zwischen den Substanzen der verschiedenen Lose des Maisquellwassers zu suchen; in den Lastdiagrammen stellt jeder Punkt eine Substanz dar, je weiter die Entfernung der Substanz vom Mittelpunkt, umso größer die Differenz im Gehalt zwischen den verschiedenen Losen, so dass sie als Qualitätskontrollindex für Maisquellwasser verwendet werden können; während VIP den Beitrag jeder Substanz zur Unterscheidung der Proben darstellt, und ein VIP>1 kann als bedeutendster Index zur Beeinflussung der Qualität des Maisquellwassers betrachtet werden.

Diese Methode verwendet eine Hochdurchsatz- und hochauflösende Nachweismethode, kann gleichzeitig viele chemische Bestandteile des Maisquellwassers feststellen und ist daher eine einfache und leicht wiederholbare Methode, wie mit zahlreichen Rohstoffen bestätigt wurde. Die Methode hat eine hohe Auflösung und hohe Sensibilität, gute Reproduzierbarkeit und Stabilität. Die Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate kann schnell und effizient chemische Substanzen verschiedener Rohstofflose aus Hochdurchsatzdaten durchforsten, wobei die folgenden 9 chemischen Substanzen als Qualitätskontrollindizes für Maisquellwasser verwendet werden können: Glukose, Milchsäure, Prolin, Phosphorsäure, Galaktose, Alanin, Fruktose, 5-Ketoprolin und Glycin, und daher kann die Methode diese Qualitätsinspektion des Maisquellwassers ergänzen.
Figurenliste

zeigt Änderungen der Konversionsrate von 2-Keto-L-gulonsäure während der Subkultivierung gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Offenbarung. Legende: ♦: 2-Keto-L-gulonsäure Konversionsrate.
zeigt die Ergebnisse der Fermentierung von Stämmen nach 50 Tagen Subkultivierung gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt die Ergebnisse der Crossmatching-Fermentierung nach 100 Tagen Subkultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung.
zeigt die Ergebnisse der Crossmatching-Fermentierung nach 150 Tagen Subkultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung.
zeigt Cluster-Analysen der Proteine des Gluconobacter oxydans von 0, 50, 100, 150 Subkulturen nach der Subkultivierung gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt relative Expressions-Werte der Sorbose/Sorboson-Dehydrogenase in Zellen des Gluconobacter oxydans von 0, 50, 100, 150 Subkulturen nach der Subkultivierung gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt die Cluster-Analyse von Proteinen des Bacillus megatherium von 0, 50, 100, 150 Subkulturen nach der Subkultivierung gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt Klasse 2 der Cluster-Analyse des Bacillus megatherium von 0, 50, 100, 150 Subkulturen nach der Subkultivierung gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt Gehaltsveränderungen der Phospholipide des Bacillus megatherium zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Score-Diagramm ( - ) und das Loadings-Diagramm ( - ) der Hauptkomponenten des Bacillus megatherium zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt Gehaltsveränderungen der Phospholipid-Molekularmarker des Bacillus megatherium zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt Gehaltsveränderungen der Phospholipide des Gluconobacter oxydans zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Score-Diagramm ( - ) und das Loadings-Diagramm ( - ) der Hauptkomponenten des Gluconobacter oxydans zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt Gehaltsveränderungen der Phospholipid-Molekularmarker des Gluconobacter oxydans zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt Gehaltsveränderungen der Phospholipide von Mischbakterien zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Score-Diagramm ( - ) und das Loadings-Diagramm ( - ) der Hauptkomponenten von Mischbakterien zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt Gehaltsveränderungen der Phospholipid-Molekularmarker von Mischbakterien zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Score-Diagramm ( - ) und das Loadings-Diagramm ( - ) der Hauptkomponenten der Nährumgebung des Gluconobacter oxydans zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Veränderungsdiagramm der Nährumgebungs-Marker während des Subkultivierungs-Prozesses von Gluconobacter oxydans zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Score-Diagramm ( - ) und das Loadings-Diagramm ( - ) der Hauptkomponenten der Nährumgebung des Bacillus megatherium zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Änderungsdiagramm der Nährumgebungs-Marker während des Subkultivierungs-Prozesses des Bacillus megatherium zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Score-Diagramm ( - ) und das Loadings-Diagramm ( - ) der Hauptkomponenten der Nährumgebung von Mischbakterien zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Änderungsdiagramm differenzieller Substanzen in der Nährumgebung während des Subkultivierungs-Prozesses von Mischbakterien zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Score-Diagramm ( - ) und das Loadings-Diagramm ( - ) der Hauptkomponenten kleinmolekularer Stoffwechselprodukte des Gluconobacter oxydans zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Veränderungsdiagramm kleinmolekularer Stoffwechsel-Marker während des Subkultivierungs-Prozesses von Gluconobacter oxydans zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Score-Diagramm ( - ) und das Loadings-Diagramm ( - ) der Hauptkomponenten kleinmolekularer Stoffwechselprodukte des Bacillus megatherium zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Veränderungsdiagramm kleinmolekularer Stoffwechsel-Marker während des Subkultivierungs-Prozesses von Bacillus megatherium zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Score-Diagramm ( - ) und das Loadings-Diagramm ( - ) der Hauptkomponenten kleinmolekularer Stoffwechselprodukte von Mischbakterien zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt das Veränderungsdiagramm kleinmolekularer Stoffwechsel-Marker während des Subkultivierungs-Prozesses von Mischbakterien zu verschiedenen Subkultivierungs-Zeiten gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt die Fermentierungsergebnisse von Mischbakterien aus Gluconobacter oxydans, die einen Vektor zur Codierung von Sorboson-Dehydrogenase enthalten, sowie Bacillus megatherium gemäß dem siebenten Aspekt der vorliegenden Offenbarung.
zeigt Analysen der Hauptkomponenten anhand der Daten von 4 Gruppen von Probenproteinen (gemischte Lösungen) gemäß dem achten Aspekt der vorliegenden Offenbarung: A, Score-Diagramm, in welchem „▲“ das Verhältnis der Probe vom Nährmedium B 1h zur Probe vom Nährmedium A 1h darstellt; „○“ das Verhältnis der Probe vom Nährmedium A 15h zur Probe vom Nährmedium A 1h darstellt, „■“ das Verhältnis der Probe vom Nährmedium B 15h zur Probe vom Nährmedium A 1h darstellt; B, Loadings-Diagramm der Substanzen.
zeigt die Expression des Thiamin-Transportproteins und wichtiger Enzyme, die dieses als Koenzym verwenden, gemäß dem achten Aspekt der vorliegenden Offenbarung: GSH-1h/KV-1h repräsentiert das Verhältnis der Probe von Nährmedium B 1h zur Probe vom Nährmedium A 1h; KV-15h/KV-1h repräsentiert das Verhältnis der Probe vom Nährmedium A 15h zur Probe vom Nährmedium A 1h; GSH-15h/KV-1h repräsentiert das Verhältnis der Probe vom Nährmedium B 15h zur Probe vom Nährmedium A 1h.
zeigt die Expression wichtiger Enzyme im Zitratzyklus und dem Pentosephosphatweg gemäß dem achten Aspekt der vorliegenden Offenbarung: GSH-1h/KV-1 h repräsentiert das Verhältnis der Probe vom Nährmedium B 1h zur Probe vom Nährmedium A 1h; KV-15h/KV-1 h repräsentiert das Verhältnis der Probe vom Nährmedium A 15h zur Probe vom Nährmedium A 1h; GSH-15h/KV-1h repräsentiert das Verhältnis der Probe vom Nährmedium B 15h zur Probe vom Nährmedium A 1h.
zeigt das Score-Diagramm der Regressionsanalyse nach Methode der kleinsten Quadrate von Maisquellwasser verschiedener Chargen gemäß dem neunten Aspekt der vorliegenden Offenbarung, wobei - das t[1]-t[2] Diagramm der Hauptkomponentenanalyse von Maisquellwasser verschiedener Chargen zeigt; und - das t[1]-u[1] Diagramm der Hauptkomponentenanalyse von Maisquellwasser verschiedener Chargen zeigt.
zeigt das Loadings-Diagramm der Regressionsanalyse nach Methode der kleinsten Quadrate von Maisquellwasser verschiedener Chargen gemäß dem neunten Aspekt der vorliegenden Offenbarung, wobei - das w*c[1]-w*c[2] Streudiagramm von Maisquellwasser verschiedener Chargen zeigt; und - das p-p(corr)S Diagramm der ersten Hauptkomponente von Maisquellwasser verschiedener Chargen zeigt.
zeigt das VIP-Diagramm der Regressionsanalyse nach Methode der kleinsten Quadrate von Maisquellwasser verschiedener Chargen gemäß dem neunten Aspekt der vorliegenden Offenbarung (VIP>1).

Beispiele
Die Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung werden ausführlich in Verbindung mit den unten stehenden Beispielen beschrieben. Sachkundige würden verstehen, dass die unten stehenden Beispiele lediglich zur Darstellung der vorliegenden Erfindung herangezogen werden, und nicht um die Reichweite der vorliegenden Erfindung zu beschränken. Bei den verwendeten Reagenzien beziehungsweise Instrumenten, bei denen kein Hersteller angegeben ist, handelt es sich um konventionelle, auf dem Markt gekaufte Produkte.
Beispiel 1-1 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure bei der Entwicklung einer Subkultur von Mischbakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Herstellung eines festen Nährmediums, bestehend aus: Abwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 20 g Agar, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das feste Nährmedium zu erhalten;
Bereitstellung von 150 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 20 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 150 µl Bacillus megaterium präserviert in 20 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf das feste Nährmedium, Kultivierung bei 30°C für 48 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Herstellung eines Anzuchtnährmediums, bestehend aus: Abwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 30°C 48 h Stunden lang unter Schütteln mit 250 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁹ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 30°C unter Schütteln mit 250 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 24 h und einem Volumenverhältnis von 4 %, um die Subkultivierung 50 Tage lang durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C 48 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 250 U/min bei 30°C 48 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentierung:
Herstellung eines Fermentationskulturmediums, bestehend aus: Abwiegen von 80 g L-Sorbose, 20 g Maisquellwasser, 12 g Harnstoff, 1 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 7,0, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Fermentationskulturmedium zu erhalten.
(4) Fermentierung:
Inokulation von original Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei original Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 250 U/min bei 30°C 96 h lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Messung des Gehalts an 2-Keto-L-gulonsäure und L-Sorbose:
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde eingesetzt.
Herstellung von Proben: Entnahme von 1 ml von Fermentationslösungen, die einer Fermentation unterzogen wurden, und Kultivierung während unterschiedlich langer Zeiträume, Einfüllen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen, Zentrifugieren bei 10.000 U/min für einen Zeitraum von 3 min, Entnahme von 100 µl Überstand und Einfüllen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 900 µl von mobiler Phase (5mM H₂SO₄), um 10-fach verdünnte Proben zu erhalten, sorgfältiges Mischen durch Schütteln, Filterung mit 0,22 µm Cellulose Millipore-Filter, um zu testende Proben zu erhalten.
Bedingungen für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Chromatograph-Säule: BIO-RAD HPX-87H, mobile Phase: 5mM H₂SO₄, Durchflussrate: 0,6 ml/min, Säulentemperatur: 65°C, Differentialdetektor.
Die Testergebnisse wurden in dargestellt.
Legenden: ◇: Original Gluconobacter oxydans in Kombination mit original Bacillus megaterium; △: Gluconobacter oxydans, 50 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit original Bacillus megaterium.
Die Fermentation von Mischbakterien von original Gluconobacter oxydans und original Bacillus megaterium unter Anwendung der Fermentationsbedingungen von Schritt (4) von Beispiel 1-1 ergab eine Säureproduktionsrate von 78 % bei 2-Keto-L-gulonsäure;
Die Fermentation von Mischbakterien von Gluconobacter oxydans, 50 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit original Bacillus megaterium ergab eine Säureproduktionsrate von 88,2 % bei der 2-Keto-L-gulonsäure, einen Anstieg von 10,2 %.
Beispiel 1-2 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure bei der Entwicklung einer Subkultur von Mischbakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Bereitstellung von 10 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 30 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 10 µl Bacillus megaterium präserviert in 30 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 35°C für 24 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 35°C 24 h Stunden lang unter Schütteln mit 200 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 35°C unter Schütteln mit 200 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 24 h und einem Volumenverhältnis von 2 %, um die Subkultivierung 60 Tage lang durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 35°C 24 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 200 U/min bei 35°C 24 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Inokulation von original Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei original Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 200 U/min bei 35°C 96 h lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Die bei diesem Beispiel verwendeten Nährmedien stellen sich folgendermaßen dar:
Die Herstellung des Feststoffkulturmediums bestand aus: Abwiegen von 10 g L-Sorbose, 10 g Maisquellwasser, 5 g Rindfleischextrakt, 2 g Hefeextraktpulver, 5 g Harnstoff, 5 g Pepton, 10 g Agar, 5 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 0,5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 6,5, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Feststoffkulturmedium zu erhalten;
Die Herstellung des Anzuchtnährmediums bestand aus: Abwiegen von 10 g L-Sorbose, 10 g Maisquellwasser, 8 g Rindfleischextrakt, 2 g Hefeextraktpulver, 5 g Harnstoff, 2 g Pepton, 5 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 0,5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,5, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Die Herstellung des Fermentationskulturmediums bestand aus: Abwiegen von 40 g L-Sorbose, 50 g Maisquellwasser, 20 g Harnstoff, 0,5 g KH₂PO₄, 1,2 g MgSO₄, 2 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,5, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Fermentationskulturmedium zu erhalten.
Beispiel 1-3 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure bei der Entwicklung einer Subkultur von Mischbakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Bereitstellung von 200 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 200 µl Bacillus megaterium präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C für 36 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 30°C 36 Stunden lang unter Schütteln mit 240 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁸CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 30°C unter Schütteln mit 240 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 36 h und einem Volumenverhältnis von 1 %, um die Subkultivierung 70 Tage lang durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C 36 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 240 U/min bei 30°C 36 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Inokulation von original Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei original Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 240 U/min bei 30°C 96 h lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Die bei diesem Beispiel verwendeten Nährmedien stellen sich folgendermaßen dar:
Die Herstellung des Feststoffkulturmediums bestand aus: Abwiegen von 30 g L-Sorbose, 2 g Maisquellwasser, 10 g Rindfleischextrakt, 5 g Hefeextraktpulver, 0,5 g Harnstoff, 12 g Pepton, 30 g Agar, 0,5 g KH₂PO₄, 0,7 g MgSO₄, 3 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Feststoffkulturmedium zu erhalten;
Die Herstellung des Anzuchtnährmediums bestand aus: Abwiegen von 30 g L-Sorbose, 2 g Maisquellwasser, 10 g Rindfleischextrakt, 8 g Hefeextraktpulver, 0,5 g Harnstoff, 8 g Pepton, 0,5 g KH₂PO₄, 0,7 g MgSO₄, 3 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Die Herstellung des Fermentationskulturmediums bestand aus: Abwiegen von 80 g L-Sorbose, 10 g Maisquellwasser, 25 g Harnstoff, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Fermentationskulturmedium zu erhalten.
Beispiel 1-4 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure bei der Entwicklung einer Subkultur von Mischbakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Bereitstellung von 500 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 20 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 500 µl Bacillus megaterium präserviert in 20%iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 28°C für 48 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 28°C 48 Stunden lang unter Schütteln mit 280 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 28°C unter Schütteln mit 280 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 48 h und einem Volumenverhältnis von 10%, um die Subkultivierung 80 Tage lang durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 28°C 48 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 280 U/min bei 28°C 48 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Inokulation von original Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei original Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 280 U/min bei 28°C 72 h lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Die bei diesem Beispiel verwendeten Nährmedien stellen sich folgendermaßen dar:
Die Herstellung des Feststoffkulturmediums bestand aus: Abwiegen von 50 g L-Sorbose, 5 g Maisquellwasser, 2 g Rindfleischextrakt, 10 g Hefeextraktpulver, 3 g Harnstoff, 2 g Pepton, 50 g Agar, 3 g KH₂PO₄, 0,1 g MgSO₄, 5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 7,0, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Feststoffkulturmedium zu erhalten;
Die Herstellung des Anzuchtnährmediums bestand aus: Abwiegen von 50 g L-Sorbose, 8 g Maisquellwasser, 2 g Rindfleischextrakt, 10 g Hefeextraktpulver, 3 g Harnstoff, 12 g Pepton, 3 g KH₂PO₄, 0,1 g MgSO₄, 0,5-5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 7,0, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Die Herstellung des Fermentationskulturmediums bestand aus: Abwiegen von 120 g L-Sorbose, 30 g Maisquellwasser, 10 g Harnstoff, 3 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 0,5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 7,5, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Fermentationskulturmedium zu erhalten.
Beispiel 2-1
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Fördern der Interaktion von zwei Bakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Herstellung eines Feststoffkulturmediums, bestehend aus: Abwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 20 g Agar, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Feststoffkulturmedium zu erhalten;
Bereitstellung von 150 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 20 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 150 µl Bacillus megaterium präserviert in 20 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C für 48 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Herstellung eines Anzuchtnährmediums, bestehend aus: Abwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 30°C 48 h Stunden lang unter Schütteln mit 250 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁹ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 30°C unter Schütteln mit 250 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 24 h und einem Volumenverhältnis von 4 %, um die Subkultivierung 100 Tage lang durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C 48 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 250 U/min bei 30°C 48 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Herstellung eines Fermentationskulturmediums, bestehend aus: Abwiegen von 80 g L-Sorbose, 20 g Maisquellwasser, 12 g Harnstoff, 1 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 7,0, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Fermentationskulturmedium zu erhalten.
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 250 U/min bei 30°C 96 Stunden lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Beispiel 2-2
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Fördern der Interaktion von zwei Bakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
Schritt (1), (2) und (3), wie bei Beispiel 2-1;
(4) Fermentation
Inokulation von original Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei original Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 250 U/min bei 30°C 96 h lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Messung des Gehalts an 2-Keto-L-gulonsäure und L-Sorbose:
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde eingesetzt.
Herstellung von Proben: Entnahme von 1 ml bei den einzelnen Fermentationslösungen, die einer Fermentation unterzogen wurden, und Kultivierung während unterschiedlich langer Zeiträume, Einfüllen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen, Zentrifugieren bei 10.000 U/min für einen Zeitraum von 3 min, Entnahme von 100 µl Überstand und Einfüllen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 900 µl von mobiler Phase (5mM H₂SO₄), um 10-fach verdünnte Proben zu erhalten, sorgfältiges Mischen durch Schütteln, Filterung mit 0,22 µm Cellulose Millipore-Filter, um zu testende Proben zu erhalten.
Bedingungen für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Chromatograph-Säule: BIO-RAD HPX-87H, mobile Phase: 5mM H₂SO₄, Durchflussrate: 0,6 ml/min, Säulentemperatur: 65°C, Differentialdetektor.
Die Testergebnisse von Beispiel 2-1 und 2-2 wurden in dargestellt.
Legenden: ◇: Original Gluconobacter oxydans in Kombination mit original Bacillus megaterium;□: Gluconobacter oxydans, 100 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit Bacillus megaterium, 100 Tage lang subkultiviert; △: Gluconobacter oxydans, 100 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit original Bacillus megaterium.
Die Fermentation von Mischbakterien von original Gluconobacter oxydans in Kombination mit original Bacillus megaterium unter Anwendung der Fermentationsbedingungen von Schritt (4) von Beispiel 2-1 ergab eine Säureproduktionsrate von 78 % bei 2-Keto-L-gulonsäure, während die Fermentation von Mischbakterien von Gluconobacter oxydans, 100 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit Bacillus megaterium, 100 Tage lang subkultiviert, eine Säureproduktionsrate von bis zu 91 bis 92 % bei 2-Keto-L-gulonsäure ergab, die bezogen auf die Säureproduktionsrate von 2-Keto-L-gulonsäure bei der Fermentation von Mischbakterien von original Gluconobacter oxydans in Kombination mit original Bacillus megaterium um 13 - 14 % anstieg;
Die Säureproduktionsrate von 2-Keto-L-gulonsäure bei der Fermentation von Mischbakterien von Gluconobacter oxydans, 100 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit original Bacillus megaterium (Beispiel 2-2) war vergleichbar mit dem Wert bei der Fermentation von Mischbakterien von Gluconobacter oxydans, 100 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit Bacillus megaterium, 100 Tage lang subkultiviert.
Beispiel 2-3
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Fördern der Interaktion von zwei Bakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Bereitstellung von 10 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 30 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 10 µl Bacillus megaterium präserviert in 30 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 35°C für 24 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 35°C 24 h Stunden lang unter Schütteln mit 200 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 35°C unter Schütteln mit 200 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 24 h und einem Volumenverhältnis von 2%, um die Subkultivierung 150 Tage lang durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 35°C 24 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 200 U/min bei 35°C 24 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 200 U/min bei 35°C 96 Stunden lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Die bei diesem Beispiel verwendeten Nährmedien stellen sich folgendermaßen dar:
Die Herstellung des Feststoffkulturmediums bestand aus: Abwiegen von 10 g L-Sorbose, 10 g Maisquellwasser, 5 g Rindfleischextrakt, 2 g Hefeextraktpulver, 5 g Harnstoff, 5 g Pepton, 10 g Agar, 5 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 0,5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 6,5, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Feststoffkulturmedium zu erhalten;
Die Herstellung des Anzuchtnährmediums bestand aus: Abwiegen von 10 g L-Sorbose, 10 g Maisquellwasser, 8 g Rindfleischextrakt, 2 g Hefeextraktpulver, 5 g Harnstoff, 2 g Pepton, 5 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 0,5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,5, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Die Herstellung des Fermentationskulturmediums bestand aus: Abwiegen von 40 g L-Sorbose, 50 g Maisquellwasser, 20 g Harnstoff, 0,5 g KH₂PO₄, 1,2 g MgSO₄, 2 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,5, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Fermentationskulturmedium zu erhalten.
Beispiel 2-4
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Fördern der Interaktion von zwei Bakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
Schritt (1), (2) und (3), wie bei Beispiel 2-3;
(4) Fermentation
Inokulation von original Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei original Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 200 U/min bei 35°C 96 h lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Die verwendeten Nährmedien waren dieselben wie bei Beispiel 2-2.
Die Testergebnisse von Beispiel 2-3 und 2-4 wurden in dargestellt.
Legenden: ◇: Original Gluconobacter oxydans in Kombination mit original Bacillus megaterium; □: Gluconobacter oxydans, 150 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit Bacillus megaterium, 150 Tage lang subkultiviert; △: Gluconobacter oxydans, 150 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit original Bacillus megaterium; ○: original Gluconobacter oxydans in Kombination mit Bacillus megaterium, 150 Tage lang subkultiviert.
Die Fermentation von Mischbakterien von original Gluconobacter oxydans in Kombination mit original Bacillus megaterium unter Anwendung der Fermentationsbedingungen von Schritt (4) von Beispiel 2-3 ergab eine Säureproduktionsrate von 78 % bei 2-Keto-L-gulonsäure. Die Fermentation von Mischbakterien von Gluconobacter oxydans, 150 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit Bacillus megaterium, 150 Tage lang subkultiviert, ergab eine Säureproduktionsrate von bis 95 % bei 2-Keto-L-gulonsäure, die bezogen auf die Säureproduktionsrate von 2-Keto-L-gulonsäure bei der Fermentation von Mischbakterien von original Gluconobacter oxydans in Kombination mit original Bacillus megaterium, um 17 % anstieg, wobei der Fermentationszyklus im Vergleich zu den original Mischbakterien um 9 % verkürzt wurde. Die Säureproduktionsrate von 2-Keto-L-gulonsäure bei der Fermentation von Mischbakterien von Gluconobacter oxydans, 150 Tage lang subkultiviert, in Kombination mit original Bacillus megaterium (Beispiel 2-4) stieg um 16 % im Vergleich zur Fermentation von original Mischbakterien, während der Fermentationszyklus mit dem Zyklus bei den 150 Tage lang subkultivierten Mischbakterien vergleichbar war.
Beispiel 2-5
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Fördern der Interaktion von zwei Bakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Bereitstellung von 200 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 200 µl Bacillus megaterium präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C für 36 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 30°C 36 h Stunden lang unter Schütteln mit 240 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 30°C unter Schütteln mit 240 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 36 h und einem Volumenverhältnis von 1%, um die Subkultivierung 200 Tage lang durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C 36 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 240 U/min bei 30°C 36 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 240 U/min bei 30°C 96 Stunden lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Die bei diesem Beispiel verwendeten Nährmedien stellen sich folgendermaßen dar:
Die Herstellung des Feststoffkulturmediums bestand aus: Abwiegen von 30 g L-Sorbose, 2 g Maisquellwasser, 10 g Rindfleischextrakt, 5 g Hefeextraktpulver, 0,5 g Harnstoff, 12 g Pepton, 30 g Agar, 0,5 g KH₂PO₄, 0,7 g MgSO₄, 3 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Feststoffkulturmedium zu erhalten;
Die Herstellung des Anzuchtnährmediums bestand aus: Abwiegen von 30 g L-Sorbose, 2 g Maisquellwasser, 10 g Rindfleischextrakt, 8 g Hefeextraktpulver, 0,5 g Harnstoff, 8 g Pepton, 0,5 g KH₂PO₄, 0,7 g MgSO₄, 3 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Die Herstellung des Fermentationskulturmediums bestand aus: Abwiegen von 80 g L-Sorbose, 10 g Maisquellwasser, 25 g Harnstoff, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Fermentationskulturmedium zu erhalten.
Beispiel 2-6
Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch Fördern der Interaktion von zwei Bakterien, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Bereitstellung von 500 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 20%iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 500 µl Bacillus megaterium präserviert in 20%iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 28°C für 48 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 28°C 48 h Stunden lang unter Schütteln mit 280 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 28°C unter Schütteln mit 280 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 48 h und einem Volumenverhältnis von 10%, um die Subkultivierung 180 Tage lang durchzuführen;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 28°C 48 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 280 U/min bei 28°C 48 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans im Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 280 U/min bei 28°C 72 Stunden lang, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Die bei diesem Beispiel verwendeten Nährmedien stellen sich folgendermaßen dar:
Die Herstellung des Feststoffkulturmediums bestand aus: Abwiegen von 50 g L-Sorbose, 5 g Maisquellwasser, 2 g Rindfleischextrakt, 10 g Hefeextraktpulver, 3 g Harnstoff, 2 g Pepton, 50 g Agar, 3 g KH₂PO₄, 0,1 g MgSO₄, 5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 7,0, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Feststoffkulturmedium zu erhalten;
Die Herstellung des Anzuchtnährmediums bestand aus: Abwiegen von 50 g L-Sorbose, 8 g Maisquellwasser, 2 g Rindfleischextrakt, 10 g Hefeextraktpulver, 3 g Harnstoff, 12 g Pepton, 3 g KH₂PO₄, 0,1 g MgSO₄, 0,5-5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 7,0, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Die Herstellung des Fermentationskulturmediums bestand aus: Abwiegen von 120 g L-Sorbose, 30 g Maisquellwasser, 10 g Harnstoff, 3 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 0,5 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 7,0, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Fermentationskulturmedium zu erhalten.
Beispiel 3-1 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Feststellung von Proteinveränderungen bei verschiedenen Vitamin C-Bildungen mit industriellen Mischbakterien während der Subkultivierung, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Subkultivierung von Mischbakterien:
Feste Kultur:
Bereitstellung von 20 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 20 µl Bacillus megaterium präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 28°C für 24 Stunden;
(ii) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(i) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 28°C 24 Stunden lang unter Schütteln mit 200 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 28°C unter Schütteln mit 200 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 24 h und einem Volumenverhältnis von 1 %, um die Subkultivierung 150 Tage lang durchzuführen, Auswählen von vier Probenentnahmezeitpunkten, das heißt, 0. Tag, 50. Tag, 100. Tag und 150. Tag, und Nehmen von vier Proben;
(iii) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der Mischbakterien der in Schritt (1)(ii) erhaltenen vier Proben, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 28°C 24 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 200 U/min bei 28°C 24 Stunden lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten; Präservierung in einer Glycerol-Wasser-Lösung mit einer Volumenkonzentration von 15 %;
(iv) Kultivierung von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans aus verschiedenen Entwicklungsperioden:
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(iii) gesondert im Fermentationskulturmedium erhalten, um eine Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 200 U/min bei 28°C 10 Stunden lang;
(2) Feststellung von intrazellulären Proteinen:
Sammlung und Quenchen von Zellen:
Separates Zentrifugieren der Bacillus megaterium-Kultur und der Gluconobacter oxydans-Kultur, erhalten in Schritt (1)(iv) bei 4°C und 4000 U/min, Sammlung von Zellen von unterer Schicht, Waschen mit Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2, Quenchen mit flüssigem Stickstoff zum Beenden der Stoffwechselreaktion; Aufbrechen von Zellen durch Zermahlen mit flüssigem Stickstoff;
(ii) Extrahieren von intrazellulären Proteinen:
Nehmen der aufgebrochenen Zellen, separates Einlegen in Zentrifugenröhrchen mit einer Menge von 80 mg pro Röhrchen, Hinzugeben von 0,5 ml Zell-Lyse-Lösung in die einzelnen Röhrchen, Mischen, Durchführen einer Ultraschallbehandlung auf Eis für 20 s intermittierend; Hinzugeben von 5 µl einer Mischenzym-Lösung aus DNase I/Rnase A in einem Massenverhältnis von 2:1, Mischen, 10 Minuten bei 4°C Stehen lassen; Hinzugeben von 5 µl 80mM Phenylmethylsulfonylfluorid Isopropanol-Lösung; 1 Stunde bei 4°C Stehen lassen; Zentrifugieren bei 15.000 U/min 25 min lang; Entnehmen von Überstand, um eine Proteinlösung zu erhalten;
wobei die Zell-Lyse-Lösung sich zusammensetzte aus: 8 mol/l^-1 Harnstoff, 3-[(3-Cholamidopropyl)-Diethylamino]-Propansulfonsäure in einer Massenkonzentration von 4 %, 40 mM Tris, der Rest ist Wasser;
(iii) Messung von Proteinkonzentrationen:
Unter Verwendung eines Bradford-Kit, Hinzugeben von bovinem Serumalbumin mit niedriger Konzentration bis hoher Konzentration in eine Coomassie-Brillant-Blau G-250-Lösung, Messung des Absorptionswerts bei 595 nm der in Schritt (2)(ii) erhaltenen Proteinlösungen, Erstellung einer Standardkurve; Messung der Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen;
(iv) Präzipitation von Proteinen:
Separates Entnehmen der Proteinlösungen mit 50 µg Protein, wie in Schritt (2)(ii) erhalten, Hinzugeben von Aceton mit einer Temperatur von -20°C in 4-fachem Volumen in die einzelnen Lösungen, 12 Stunden bei -20°C Stehen lassen, Zentrifugieren, Abpipettieren des Überstands, Waschen des Präzipitats mit wässriger Aceton-Lösung mit einer Temperatur von -20°C mit einer Volumenkonzentration von 70 %; Trocknen, um trockene Proteinpulver zu erhalten;
Reduktion und Enzymolyse von Proteinen
Separates Hinzugeben von 20 µl 40 mM wässriger Triethylammoniumbicarbonat-Lösung in die einzelnen trockenen Proteinpulver, um die Proteine zu lösen; dann Hinzugeben von 1 µl Tri(2-Carboxylethyl)-Phosphin, Durchführen der Reduktionsreaktion bei 50°C 1 Stunde lang, dann Hinzugeben von 1 µl Methylthiosulfonsäure-Methylester, Reaktion bei Raumtemperatur 10 min lang, um die Reduktionsreaktion zu beenden; dann versetzt mit 20 µl wässriger Trypsin-Lösung mit einer Konzentration von 0,2 µg/µl, Durchführung der Proteolyse bei 37°C 12 h lang, um enzymatische Hydrolysate zu erhalten;
(vi) Markierung von Proteinen
Separates Hinzugeben zu den in Schritt (2)(v) erhaltenen enzymatischen Hydrolysaten von iTRAQ-Markierungsreagenz, aufgelöst in 60 µl Ethanol, Reaktion bei Raumtemperatur, eine Stunde lang;
(vii) Mischen von Lösungen
Mischen der aus Bacillus megaterium erhaltenen Proteinlösungen, gemäß Markierung in Schritt (2)(vi); Mischen der aus Gluconobacter oxydans erhaltenen Proteinlösungen, gemäß Markierung in Schritt (2)(vi); Präservierung bei -40°C;
(viii) Identifikation von differentiell exprimierten Proteinen
Durchführung einer Identifikation mit Hilfe eines Q-Tof-Massenspektrometers an den beiden Gruppen von in Schritt (2)(vii) erhaltenen Mischlösungen, um ein Proteomprofil zu erhalten, und Erhalten von differentiell exprimierten Proteinen aus Proben von Mischgruppen durch Quantifizierung;
(3) Clusteranalyse:
Standardisierung der in Schritt (2)(viii) erhaltenen Daten mit Expander 4.0, dann Durchführen der k-Means-Clusteranalyse, um Datenklassen mit unterschiedlichen variierenden Mustern und differentielle Kandidatenproteine zu erhalten;
(4) Prozessanalyse
Aufzeichnung des Gehalts der in Schritt (3) erhaltenen differentiellen Kandidatenproteine in Abhängigkeit von Zeit, Beobachtung und Analyse der variierenden Muster dieser Proteine und anschließend Erforschung der Effekte der Entwicklung der Subkultur der Mischbakterien im Prozess der Erhöhung der durch Gluconobacter oxydans produzierten 2-Keto-L-gulonsäure.
Bei der Subkultivierung der Mischbakterien wies Gluconobacter oxydans eine Vielzahl von Entwicklungsrichtungen auf, die sich in unterschiedlichen Expressionsmustern von intrazellulären Proteinen in verschiedenen Generation zeigte, wie in dargestellt. Im Rahmen der Clusteranalyse wurde herausgefunden, dass deren variierende Muster von Expressionsmengen in sechs Klassen unterteilt werden konnten, wobei Klasse 1, Klasse 3 und Klasse 5 weniger Veränderungen bei der Proteinexpression aufwiesen; Klasse 2 und Klasse 4 wiesen nach der Subkultivierung einen Anstieg der Proteinexpression in unterschiedlichen Ausmaßen auf, wobei dies Sorbose/Sorbosone-Dehydrogenase umfasst, welche für die Umwandlung von Sorbose in 2-Keto-L-gulonsäure verantwortlich ist. Die Expression dieses Enzyms in unterschiedlichen Generationen wurde in dargestellt, wobei die 50. Generation eine leicht nach unten regulierte Expression aufwies, während bei der 100. und der 150. Generation eine stufenweise erhöhte Expression zu verzeichnen war. Die Gründe für diese Phänomene könnten in der drastischen Interaktion zwischen den Mischbakterien, wie diese in der 50. Generation stattfand, in der stattgefundenen adaptiven Selektion liegen, wobei mit Förderung der Interaktion Gluconobacter oxydans eine immer größer werdende Anpassungsfähigkeit an die Umgebung von Mischbakterien aufwies und sich die Produktivität folglich erhöht hatte.
In der Zwischenzeit wurde die Clusteranalyse von Bacillus megaterium in verschiedenen Subkultivierungsperioden durchgeführt, und die Ergebnisse wurden in dargestellt. Die 131 Proteine von Klasse 1 wiesen bei der Expressionsmenge keine bedeutenden Veränderungen auf; die neun Proteine von Klasse 2 zeigten eine nach oben regulierte Expression mit einem Anstieg der Subkulturzahl; die 88 Proteine von Klasse 3 zeigten einen schwachen Trend hin zu nach oben regulierter Expression mit einem Anstieg der Subkulturzahl; und die 25 Proteine von Klasse 4 zeigten eine leicht nach unten regulierte Expression in der 50. Generation, jedoch eine leicht nach oben regulierte Expression in der 100. und 150. Generation. Bei diesen vier Klassen wies Klasse 2 die bedeutendste Veränderung auf. Die Expression von Proteinen wurde in dargestellt. Unter neun Proteinen von Klasse 2, gehörten vier Proteine zu Immuninhibitor A (Immuninhibitor A; Immuninhibitor A Metalloprotease; Immuninhibitor A Vorstufe; Peptid M6 Immuninhibitor A), und ein Protein gehört zum Oligopeptid-Transport (Oligopeptid-bindendes Protein oppA), und ebenfalls zu Superoxid-Dismutase (Superoxid-Dismutase, Mn) gegen aktiven Sauerstoff. Bei Immuninhibitor A handelt es sich um ein Protein-abbauendes antimikrobielles Peptid in Bazillus, Immuninhibitor A spielte eine wichtige Rolle bei Bazillus für die Widerstandsfähigkeit des externen Immunsystems und ist ebenfalls ein wichtiger Bestandteil der äußeren Schale von Bazillus. Seine Expressionsmenge stieg mit der Erhöhung der Generationszahl während der Subkultivierung an, wies einen Trend hin zur Aufwärtsregulierung auf, was auf eine Verbesserung der Stressresistenz bei Sporen von Bacillus megaterium schließen ließ. In der Zwischenzeit wurde ebenfalls die Fähigkeit zum Transferieren von Oligopeptid verbessert, wodurch Selbstwachstum ermöglicht wurde.
Insgesamt gesehen war die Subkultivierung der Mischbakterien für das Wachstum sowohl von Gluconobacter oxydans als auch Bacillus megaterium von Vorteil, was sich in der Erhöhung der Produktivität von Gluconobacter oxydans und in der Verbesserung der Stressresistenz von Bacillus megaterium zeigte. Diese Feststellung stellt eine Grundlage für eine anschließende genetische Modifikation von Gluconobacter oxydans sowie eine Grundlage für Prozessstudien und die Kontrolle von industriellen Mischbakterien dar.
Beispiel 3-2 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Feststellung von Proteinveränderungen bei verschiedenen Vitamin C-Bildungen mit industriellen Mischbakterien während der Subkultivierung, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Subkultivierung von Mischbakterien:
Feste Kultur:
Bereitstellung von 10 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 20 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 10 µl Bacillus megaterium präserviert in 20 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C für 36 Stunden;
(ii) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(i) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 30°C 36 Stunden lang unter Schütteln mit 250 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁹ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 30°C unter Schütteln mit 250 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 36 h und einem Volumenverhältnis von 5%, um die Subkultivierung 100 Tage lang durchzuführen; Auswählen von drei Probenentnahmezeitpunkten und nehmen von drei Proben, am 0. Tag, am 50. Tag beziehungsweise am 100. Tag.
(iii) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der Mischbakterien der in Schritt (1)(ii) erhaltenen drei Proben, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C 36 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 250 U/min bei 30°C 36 Stunden lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten; Präservierung in einer Glycerol-Wasser-Lösung mit einer Volumenkonzentration von 20 %;
(iv) Kultivierung von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans aus verschiedenen Entwicklungsperioden:
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(iii) gesondert im Fermentationskulturmedium erhalten, um eine Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 250 U/min bei 30°C 12 Stunden lang;
(2) Feststellung von intrazellulären Proteinen:
Sammlung und Quenchen von Zellen:
Separates Zentrifugieren der Bacillus megaterium-Kultur und der Gluconobacter oxydans-Kultur, erhalten in Schritt (1)(iv) bei 4°C und 5000 U/min, Sammlung von Zellen von unterer Schicht, Waschen mit Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,3, Quenchen mit flüssigem Stickstoff zum Beenden der Stoffwechselreaktion; Aufbrechen von Zellen durch Zermahlen mit flüssigem Stickstoff;
(ii) Extrahieren von intrazellulären Proteinen:
Nehmen der aufgebrochenen Zellen, separates Einlegen in Zentrifugenröhrchen mit einer Menge von 90 mg pro Röhrchen, Hinzugeben von 0,8 ml Zell-Lyse-Lösung in die einzelnen Röhrchen, Mischen, Durchführen einer Ultraschallbehandlung auf Eis für 40 s intermittierend; Hinzugeben von 10 µl einer Mischenzym-Lösung aus DNase I/Rnase A in einem Massenverhältnis von 3:1, sorgfältiges Mischen, 20 Minuten bei 4°C Stehen lassen; Hinzugeben von 10 µl 100mM Phenylmethylsulfonylfluorid Isopropanol-Lösung; 2 Stunden bei 4°C Stehen lassen; Zentrifugieren bei 15.000 U/min 30 min lang; Entnehmen von Überstand, um eine Proteinlösung zu erhalten;
wobei die Zell-Lyse-Lösung sich zusammensetzt aus: 8 mol/l^-1 Harnstoff, 3-[(3-Cholamidopropyl)-Diethylamino]-Propansulfonsäure in einer Massenkonzentration von 4 %, 40 mM Tris, der Rest ist Wasser;
(iii) Messung von Proteinkonzentrationen:
Unter Verwendung eines Bradford-Kit, Hinzugeben von bovinem Serumalbumin mit niedriger Konzentration bis hoher Konzentration in eine Coomassie-Brillant-Blau G-250-Lösung, Messung des Absorptionswerts bei 595 nm der in Schritt (2)(ii) erhaltenen Proteinlösungen, Erstellung einer Standardkurve; Messung der Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen;
(iv) Präzipitation von Proteinen:
Separates Entnehmen der Proteinlösungen mit 80 µg Protein, wie in Schritt (2)(ii) erhalten, Hinzugeben von Aceton mit einer Temperatur von -40°C in 5-fachem Volumen in die einzelnen Lösungen, 15 Stunden bei -40°C Stehen lassen, Zentrifugieren, Abpipettieren des Überstands, Waschen des Präzipitats mit wässriger Aceton-Lösung mit einer Temperatur von -40°C mit einer Volumenkonzentration von 80 %; Trocknen, um trockene Proteinpulver zu erhalten;
Reduktion und Enzymolyse von Proteinen
separates Hinzugeben von 20 µl 50 mM wässriger Triethylammoniumbicarbonat-Lösung in die einzelnen trockenen Proteinpulver, um die Proteine zu lösen; dann Hinzugeben von 2 µl Tri(2-carboxylethyl)-Phosphin, Durchführen der Reduktionsreaktion bei 55°C 1,2 Stunden lang, dann Hinzugeben von 1 µl Methylthiosulfonsäure-Methylester, Reaktion bei Raumtemperatur 10 min lang, um die Reduktionsreaktion zu beenden; dann versetzt mit 25 µl wässriger Trypsin-Lösung mit einer Konzentration von 0,2 µg/µl, Durchführung der Proteolyse bei 37°C 16 h lang, um enzymatische Hydrolysate zu erhalten;
(vi) Markierung von Proteinen
Separates Hinzugeben zu den in Schritt (2)(v) erhaltenen enzymatischen Hydrolysaten von iTRAQ-Markierungsreagenz, aufgelöst in 70 µl Ethanol, Reaktion bei Raumtemperatur, 1,2 Stunden lang;
(vii) Mischen von Lösungen
Mischen der aus Bacillus megaterium erhaltenen Proteinlösungen, gemäß Markierung in Schritt (2)(vi); Mischen der aus Gluconobacter oxydans erhaltenen Proteinlösungen, gemäß Markierung in Schritt (2)(vi); Präservierung bei -40°C;
(viii) Identifikation von differentiell exprimierten Proteinen
Durchführung einer Identifikation mit Hilfe eines Q-Tof-Massenspektrometers an den beiden Gruppen von in Schritt (2)(vii) erhaltenen Mischlaugen, um ein Proteomprofil zu erhalten, und Erhalten von differentiell exprimierten Proteinen aus Proben von Mischgruppen durch Quantifizierung;
(3) Clusteranalyse:
Standardisierung der in Schritt (2)(viii) erhaltenen Daten mit Expander 4.0, dann Durchführen der k-Means-Clusteranalyse, um Datenklassen mit unterschiedlichen variierenden Mustern und differentielle Kandidatenproteine zu erhalten;
(4) Prozessanalyse
Aufzeichnung des Gehalts der in Schritt (3) erhaltenen differentiellen Kandidatenproteine in Abhängigkeit von Zeit, Beobachtung der variierenden Muster dieser Proteine und anschließend Erforschung der Effekte der Entwicklung der Subkultivierung der Mischbakterien im Prozess der Erhöhung der durch Gluconobacter oxydans produzierten 2-Keto-L-gulonsäure.
Beispiel 3-3 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Feststellung von Proteinveränderungen bei verschiedenen Vitamin C-Bildungen mit industriellen Mischbakterien während der Subkultivierung, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Subkultivierung von Mischbakterien:
Feste Kultur:
Bereitstellung von 200 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 30%iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 200 µl Bacillus megaterium präserviert in 30 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C für 48 Stunden;
(ii) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(i) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 35°C 48 Stunden lang unter Schütteln mit 280 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans' Kultivierung bei 35°C unter Schütteln mit 280 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 48 h und einem Volumenverhältnis von 10 %, um die Subkultivierung 150 Tage lang durchzuführen; Auswählen von vier Probenentnahmezeitpunkten und nehmen von vier Proben, am 0. Tag, am 50. Tag, am 100. Tag beziehungsweise am 150. Tag.
(iii) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der Mischbakterien der in Schritt (1)(ii) erhaltenen vier Proben, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 35°C 48 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 280 U/min bei 35°C 48 Stunden lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten; Präservierung in einer Glycerol-Wasser-Lösung mit einer Volumenkonzentration von 30 %;
(iv) Kultivierung von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans aus verschiedenen Entwicklungsperioden:
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(iii) gesondert im Fermentationskulturmedium erhalten, um eine Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 280 U/min bei 35°C 15 Stunden lang;
(2) Feststellung von intrazellulären Proteinen:
Sammlung und Quenchen von Zellen:
Separates Zentrifugieren der Bacillus megaterium-Kultur und der Gluconobacter oxydans-Kultur, erhalten in Schritt (1)(iv) bei 4°C und 6000 U/min, Sammlung von Zellen von unterer Schicht, Waschen mit Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4, Quenchen mit flüssigem Stickstoff zum Beenden der Stoffwechselreaktion; Aufbrechen von Zellen durch Zermahlen mit flüssigem Stickstoff;
(ii) Extrahieren von intrazellulären Proteinen:
Nehmen der aufgebrochenen Zellen, separates Einlegen in Zentrifugenröhrchen mit einer Menge von 100 mg pro Röhrchen, Hinzugeben von 1 ml Zell-Lyse-Lösung in die einzelnen Röhrchen, sorgfältiges Mischen, intermittentes Durchführen einer Ultraschallbehandlung auf Eis für 50 s intermittierend; Hinzugeben von 15 µl einer Mischenzym-Lösung aus DNase I/Rnase A in einem Massenverhältnis von 4:1, sorgfältiges Mischen, 30 Minuten bei 4°C Stehen lassen; Hinzugeben von 15 µl 120mM Phenylmethylsulfonylfluorid Isopropanol-Lösung; 3 Stunden bei 4°C Stehen lassen; Zentrifugieren bei 15.000 U/min 40 min lang; Entnehmen von Überstand, um eine Proteinlösung zu erhalten;
wobei die Zell-Lyse-Lösung sich zusammensetzt aus: 8 mol/l^-1 Harnstoff, 3-[(3-Cholamidopropyl)-Diethylamino]-Propansulfonsäure in einer Massenkonzentration von 4 %, 40 mM Tris, der Rest ist Wasser;
(iii) Messung von Proteinkonzentrationen:
Unter Verwendung eines Bradford-Kit, Hinzugeben von bovinem Serumalbumin mit niedriger Konzentration bis hoher Konzentration in eine Coomassie-Brillant-Blau G-250-Lösung, Messung des Absorptionswerts bei 595 nm der in Schritt (2)(ii) erhaltenen Proteinlösungen, Erstellung einer Standardkurve; Messung der Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen;
(iv) Präzipitation von Proteinen:
Separates Entnehmen der Proteinlösungen mit 100 µg Protein, wie in Schritt (2)(ii) erhalten, Hinzugeben von Aceton mit einer Temperatur von -40°C in 6-fachem Volumen in die einzelnen Lösungen, 20 Stunden bei -40°C Stehen lassen, Zentrifugieren, Abpipettieren des Überstands, Waschen des Präzipitats mit wässriger Aceton-Lösung mit einer Temperatur von -40°C mit einer Volumenkonzentration von 85 %; Trocknen, um trockene Proteinpulver zu erhalten;
Reduktion und Enzymolyse von Proteinen
separates Hinzugeben von 40 µl 60 mM wässriger Triethylammoniumbicarbonat-Lösung in die einzelnen trockenen Proteinpulver, um die Proteine zu lösen; dann Hinzugeben von 4 µl Tri(2-carboxylethyl)-Phosphin, Durchführen der Reduktionsreaktion bei 60°C 1,5 Stunden lang, dann Hinzugeben von 2 µl Methylthiosulfonsäure-Methylester, Reaktion bei Raumtemperatur 15 min lang, um die Reduktionsreaktion zu beenden; dann versetzt mit 30 µl wässriger Trypsin-Lösung mit einer Konzentration von 0,3 µg/µl, Durchführung der Proteolyse bei 37°C 18 h lang, um enzymatische Hydrolysate zu erhalten;
(vi) Markierung von Proteinen
Separates Hinzugeben zu den in Schritt (2)(v) erhaltenen enzymatischen Hydrolysaten von iTRAQ-Markierungsreagenz, aufgelöst in 80 µl Ethanol, Reaktion bei Raumtemperatur, 1,5 Stunden lang;
(vii) Mischen von Lösungen
Mischen der aus Bacillus megaterium erhaltenen Proteinlösungen, gemäß Markierung in Schritt (2)(vi); Mischen der aus Gluconobacter oxydans erhaltenen Proteinlösungen, gemäß Markierung in Schritt (2)(vi); Präservierung bei -40°C;
(viii) Identifikation von differentiell exprimierten Proteinen
Durchführung einer Identifikation mit Hilfe eines Q-Tof-Massenspektrometers an den beiden Gruppen von in Schritt (2)(vii) erhaltenen Mischlaugen, um ein Proteomprofil zu erhalten, und Erhalten von differentiell exprimierten Proteinen aus Proben von Mischgruppen durch Quantifizierung;
(3) Clusteranalyse:
Standardisierung der in Schritt (2)(viii) erhaltenen Daten mit Expander 4.0, dann Durchführen der k-Means-Clusteranalyse, um Datenklassen mit unterschiedlichen variierenden Mustern und differentielle Kandidatenproteine zu erhalten;
(4) Prozessanalyse
Aufzeichnung des Gehalts der in Schritt (3) erhaltenen differentiellen Kandidatenproteine in Abhängigkeit von Zeit, Beobachtung der variierenden Muster dieser Proteine und anschließend Erforschung der Effekte der Entwicklung der Subkultivierung der Mischbakterien im Prozess der Erhöhung der durch Gluconobacter oxydans produzierten 2-Keto-L-gulonsäure.
Diese Tests bestätigten, dass Beispiel 3-2 und Beispiel 3-3 Ergebnisse erbrachten, die mit denen von Beispiel 3-1 vergleichbar sind.
Die Zusammensetzungen von bei der vorliegenden Offenbarung verwendeten festen Nährmedien und Anzuchtnährmedien wurden anhand der Medien ausgewählt, die in der chinesischen Patentanmeldung Nummer: 201110314740.9 bekannt gegeben wurden, wie beispielsweise:
Feststoffkulturmedium: Abwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 20 g Agar, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Feststoffkulturmedium zu erhalten.
Anzuchtnährmedium: Abwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Beispiel 4-1 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Analyse von Veränderungen von Phospholipidom im Subkultivierungsprozess von Vitamin-C-Produktionsstämmen, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Bereitstellung von 100 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 20%iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 100 µl Bacillus megaterium präserviert in 20%iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C für 36 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 30°C 36 h Stunden lang unter Schütteln mit 240 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁸CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans' Kultivierung bei 30°C unter Schütteln mit 240 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 36 h und einem Volumenverhältnis von 5%, um die Subkultivierung 150 Tage lang durchzuführen; Nehmen von vier Proben, am 0. Tag, am 50. Tag, am 100. Tag beziehungsweise am 150. Tag.
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien der vier Proben, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C 36 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 240 U/min bei 30°C 36 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium, entwickeltem Gluconobacter oxydans und einer Mischung aus entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans in Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 240 U/min bei 30°C 13 Stunden lang.
(5) Extrahieren von zellulärem Phospholipidom

(i) Entnehmen von drei Zellsuspensionen mit einem Volumen von 150 ml, unter Schütteln 13 Stunden kultiviert in Schritt (4), Zentrifugieren mit 2000 U/min 5 min lang, Abpipettieren des Überstands, Beibehalten von Zellen, Waschen der Zellen mit Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3, zwei Mal, Zentrifugieren unter denselben Bedingungen, Abpipettieren des Überstands, um Zellen zu erhalten;
(ii) Zermahlen der drei Typen von Zellen aus Schritt (i) durch Zermahlen mit flüssigem Stickstoff, um Pulver zu erhalten, Entnehmen von 250 mg des Zellpulvers pro Typ, separates Einlegen in drei Zentrifugenröhrchen A, Hinzugeben von 0,6 ml ultrareinem Wasser, sorgfältiges Mischen;
(iii) Hinzugeben von 3 ml Extraktionslösung in die drei Zentrifugenröhrchen A, sorgfältiges Mischen, Zentrifugieren bei 2000 U/min 5 min lang, Schichten der Lösung, Entnehmen der organischen Lösungsmittelschicht von der unteren Schicht, Einlegen in drei Zentrifugenröhrchen B;
(iv) Wiederholen von Schritt (iii), drei Mal, bis die Sedimentierung der Zellen abgeschlossen ist;
(v) Hinzugeben von 1,0 ml einer wässrigen KCI-Lösung mit einer Konzentration von 1,0 mol/l in die drei Zentrifugenröhrchen B, sorgfältiges Mischen, Zentrifugieren bei 3000 U/min 5 min lang, Abpipettieren des Überstands, der wasserlösliche Verunreinigungen enthält;
(v) Hinzugeben von 2 ml ultrareinem Wasser in die drei Zentrifugenröhrchen B, sorgfältiges Mischen, Zentrifugieren bei 3000 U/min 5 min lang, Abpipettieren des Überstands,
(vii) Trocknung des organischen Lösungsmittels in der, in Schritt (vi) erhaltenen Mischung durch Destillation bei 30°C bei reduziertem Druck, um eine Extraktmischung der gesamten Phospholipiden zu erhalten;
(viii) Lösen der Extraktmischung der gesamten Phospholipiden in 1 ml Aufbewahrungslösung, um eine Probe zu erhalten, Lagern bei unter -40°C;
(ix) (ix) Hinzugeben von Normalmaßen von Phospholipiden zur Probe, vor der Detektion, wobei es sich bei den Normalmaßen um bisdodecylacylphosphatidyl glycerol, bisdodecylacylphosphatidyl ethanolamine, bisdodecylacyl(hemolytic)phosphatidyl ethanolamine und bisdodecylacylphosphatidic acid handelte, so dass die letztendliche Konzentration der einzelnen der vier Normalmaße von Phospholipiden 1,0 µg/ml betrug;

(6) LC-MS-Detektion:
Detektieren der drei in Schritt (5) erhaltenen Proben, denen Normalmaße von Phospholipiden hinzu gegeben wurden, mit LC-MS, um die Molekularstruktur (dargestellt in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3) und Gehaltsdaten (dargestellt in , und ) des Phospholipidoms bei der Subkultivierung der Mischbakterien für die Vitamin C-Produktion zu erhalten;
Die Bedingungen für die LC-MS-Detektion waren wie folgt:

Chromatographie-Säule: Hypersil GOLD Silica, mit der Spezifikation: 150 mm × 2,1 mm, 5 µm;
Probenmenge: 10 µl;
Säulentemperatur: 25°C;
Mobile Phase A (in %): Chloroform (89,5), Methanol (10), Ammoniumhydroxid (0,5);
Mobile Phase B (in %): Chloroform (55), Methanol (39), Ammoniumhydroxid (0,5), Wasser (5,5);
Gradientenprogramm: 0-7 min, 20-30 % B; 7-15 min 30-40 % B; 15-20 min 40-50 % B; 20-25 min 50 % B; 25-35min, 50-20 % B; 35-45min, 20 % B;
Ionisationsverfahren: ESI (Negativ-Ionen-Verfahren);
Abtastverfahren: MS Scan;
Abtastbereich: m/z 400-900;
Abtastgeschwindigkeit: 1000 Scan/s;
Kapillarspannung: 3 kV;
Konusspannung: 30 V;
Extraktionsspannung 3 V;
Ionenquellentemperatur: 100°C;
Desolvationsgastemperatur: 350°C;
Gasdurchsatz Konus: 50 l/h
Durchsatz Desolvationsgas: 400 l/h;
Eingangs-/Ausgangsenergie: 50;
Kollisionsenergie: 2;
HM1/LM1/HM2/LM2: 15,0;
Ionenenergie 1: 1,0;
Ionenenergie 2: 2,0;

(7) Multivariate Analyse
Unterziehen der Daten zum Molekülgehalt des Phospholipidom beim Subkultivierungsprozess der Mischbakterien für die Vitamin C-Produktion, wie diese in Schritt (6) erhalten wurden, einer multivariaten Analyse, um differentielle Phospholipid-Marker zur Unterscheidung von Vitamin C-Produktionsstämmen in unterschiedlichen Subkultivierungsperioden zu erhalten; wobei die multivariate Analyse die Durchführung einer Analyse der Hauptbestandteile nach erfolgter Pareto-Skalierung umfasste; siehe , und ;
(8) Prozessanalyse

Aufzeichnung des Gehalts der differentiellen Phospholipid-Marker, wie diese in Schritt (7) erhalten wurden, in Abhängigkeit der verschiedenen Subkultivierungszeiten gemäß , und , Beobachtung und Analyse der variierenden Muster dieser Phospholipid-Moleküle, anschließend Erforschung der Phospholipid-Moleküle und der relevanten zugehörigen Stoffwechselwege, die eine entscheidende Rolle bei der Subkultivierung der Mischbakterien spielten, dadurch Bereitstellen einer Orientierungshilfe für die Optimierung der Stammmodifikation und der Kultivierungsbedingungen mit dem Ziel einer Erhöhung der 2-Keto-L-gulonsäure. Tabelle 4-1: Bacillus megaterium - Tabelle zur Identifikation von Phospholipid-Molekülen

Phospholipid-Molekül	Bacillus megaterium
Phosphatidyl glycerol (PG)	PG27:0, PG28:1, PG28:0, PG29:1, PG29:0, PG30:1, PG30:0, PG31:2, PG31:1, PG31:0, PG32:2, PG32:1, PG32:0, PG33:2, PG33:1, PG33:0, PG34:2, PG34:1, PG34:0, PG35:1, PG35:0
Phosphatidyl ethanolamine (PE)	PE27:0, PE28:1, PE28:0, PE29:1, PE29:0, PE30:1, PE30:0, PE31:2, PE31:1, PE31:0, PE32:2, PE32:1, PE32:0, PE33:2, PE33:1, PE33:0, PE34:2, PE34:1, PE35:0, PE36:0, PE37:0, PE38:0
Lysophosphati dyl ethanolamine (LPE)	LPE13:0, LPE14:0, LPE15:0, LPE16:0
Phosphatidic acid (PA)	PA28:0, PA29:1, PA29:0, PA30:1, PA30:0, PA31:1, PA31:0, PA32:1, PA32:0, PA33:1, PA33:0

Wie in Tabelle 4-1 dargestellt, lagen 58 Phospholipid-Moleküle von Phospholipidom vor, welche mit Hilfe des Verfahrens gemäß vorliegender Offenbarung bei der Subkultivierung von Vitamin C-Produktionsstämmen (Bacillus megaterium) extrahiert und festgestellt wurden, bestehend aus 21 Phosphatidylglycerol-Molekülen, 22 Phosphatidyl-Ethanolamin-Molekülen, 4 Lysophosphatidyl-Ethanolamin-Molekülen und 11 Phosphatidsäure-Molekülen. Tabelle 4-2: Gluconobacter oxydans - Tabelle zur Identifikation von Phospholipid-Molekülen

Phospholipid-Molekül	Gluconobacter oxydans
	PG28:1, PG28:0, PG29:0, PG31:0, PG32:1, PG32:0, PG33:1,
Phosphatidyl glycerol (PG)	PG33:0, PG34:2, PG34:1, PG34:0, PG35:2, PG35:1, PG35:0,
	PG36:3, PG36:2, PG36:1, PG37:2, PG37:1, PG38:1, PG38:0
Phosphatidic acid (PA)	PA28:0

Wie in Tabelle 4-2 dargestellt, lagen 22 Phospholipid-Moleküle vor, welche mit Hilfe des Verfahrens gemäß vorliegender Offenbarung bei der Subkultivierung von Vitamin C-Produktionsstämmen (Gluconobacter oxydans) extrahiert und festgestellt wurden, bestehend aus 21 Phosphatidylglycerol-Molekülen und einem Phosphatidsäure-Moleküle. Tabelle 4-3: Tabelle zur Identifikation von Phospholipid-Molekülen der Mischbakterien

Phospholipid-Molekül	Bacillus megaterium
	PG27:0, PG28:1, PG28:0, PG29:1, PG29:0, PG30:1, PG30:0,
Phosphatidyl glycerol (PG)	PG31:2, PG31:1, PG31:0, PG32:2, PG32:1, PG32:0, PG33:2,
	PG33:1, PG33:0, PG34:2, PG34:1, PG34:0, PG35:1, PG35:0
Phosphatidyl ethanolamine (PE)	PE27:0, PE28:1, PE28:0, PE29:1, PE29:0, PE30:1, PE30:0,
	PE31:2, PE31:1, PE31:0, PE32:2, PE32:1, PE32:0, PE33:2,
	PE33:1, PE33:0, PE34:2, PE34:1, PE35:2, PE37:0
Lysophosphatidyl ethanolamine (LPE)	LPE13:0, LPE14:0, LPE15:0, LPE16:0, LPE17:0, LPE18:1
Phosphatidic acid (PA)	PA27:0, PA28:0, PA29:1, PA29:0, PA30:1, PA30:0, PA31:1,
	PA31:0, PA32:1, PA32:0, PA33:1, PA33:0, PA34:3, PA34:2,
	PA34:1, PA35:3

Wie in Tabelle 4-3 dargestellt, lagen 63 Phospholipid-Moleküle vor, welche mit Hilfe des Verfahrens gemäß vorliegender Offenbarung bei der Subkultivierung von Vitamin C-Produktionsstämmen (Mischbakterien) extrahiert und festgestellt wurden, bestehend aus 21 Phosphatidylglycerol-Molekülen, 20 Phosphatidyl-Ethanolamin-Molekülen, 6 Lysophosphatidyl-Ethanolamin-Molekülen und 16 Phosphatidsäure-Molekülen.
In wiesen Bacillus megaterium-Zellen am 0., 50., 100. und 150. Tag einen Gehalt an Phospholipid-Zellen von insgesamt 10,89, 6,80, 7,06 beziehungsweise 8,64 nmol/mg Zelltrockengewicht auf, wobei eine signifikante Verringerung des Gesamt-Phospholipid-Gehalts an Bacillus megaterium-Zellen am 50. Tag, als die beiden Bakterien einer gemeinsamen Subkultivierung unterzogen wurden, und - bei größer werdender Zahl von Subkultivierungstagen (100. Tag, 150. Tag) - ein leicht ansteigender Trend festzustellen waren. Der gesamte Gehalt an Phospholipid-Molekülen von Bacillus megaterium gemäß Matrix wurde einer Analyse der Hauptbestandteile unterzogen ( ). Das Auswertungsdiagramm zeigte, dass die Phospholipid-Zellkomponenten am 0. Tag und am 50. Tag den größten Unterschied (den weitesten Abstand) aufwiesen, während die vom 100. Tag und vom 150. Tag sich nach und nach an den der Zellen des 0. Tages annäherten; das Belastungsdiagramm zeigte, dass die meisten PG-Moleküle in positiver Korrelation zu den Zellen vom 0. Tag standen, während der Gehalt von einigen PE- und LPE-Molekülen am 50. Tag nach der Subkultivierung signifikant anstieg und der Gehalt von PA-Molekülen am 100. Tag relativ hoch war. zeigte Veränderungen beim Gehalt von Streuungspunkten (Molekülmarker) im Belastungsdiagramm der Hauptkomponentenanalyse, bei welcher PE34:2, PE34:1 und LPE16:0 bei den Zellen des 50. Tags die höchsten Gehaltswerte zeigten; Eine Reihe von PG-Molekülen zeigte den geringsten Gehalt am 50. Tag, dann einen schrittweisen Anstieg; Eine Reihe von PA-Molekülen wies eine signifikante Verringerung am 50. Tag und einen starken Anstieg am 100. Tag auf. Die oben erwähnten Veränderungen zeigten, dass mit der Erhöhung der Zeit für die Co-Subkultivierung der beiden Bakterien der Stoffwechselprozess der Phospholipide sich signifikant veränderte. Bei Bacillus megaterium nahmen die LPE- und PA-Moleküle zu, was der Anstieg der Eintrittswahrscheinlichkeit von Zelltod herbeiführenden Signalübertragungen zeigte, während diese Signalübertragungen möglicherweise in engem Zusammenhang stehen mit der Sporenbildung von Bacillus megaterium, und folglich das Wachstum und die Produktion von kleinen Bakterien, das heißt, Gluconobacter oxydans, beeinflussten.
In wiesen Gluconobacter oxydans-Zellen am 0., 50., 100. und 150. Tag der Subkultivierung einen Gehalt an Phospholipid-Zellen von insgesamt 5,92, 1,42, 0,96 beziehungsweise 0,85 nmol/mg Zelltrockengewicht auf, wobei eine signifikante Verringerung des Gesamt-Phospholipid-Gehalts an Gluconobacter oxydans-Zellen 50. Tag der Subkultivierung festzustellen war. Der gesamte Gehalt an Phospholipid-Molekülen von Gluconobacter oxydans am 0., 50., 100. und 150. Tag gemäß Matrix wurde einer Analyse der Hauptbestandteile unterzogen ( ). Das Auswertungsdiagramm zeigte, dass die Phospholipid-Zellkomponenten am 0. Tag und am 50. Tag einen signifikanten Unterschied aufwiesen, während der Unterschied zwischen den Zellen des 100. Tags und denen des 150. Tags nicht signifikant war; Das Belastungsdiagramm zeigte, dass der Gehalt von PA-Molekülen nach 50 Tagen Subkultivierung signifikant anstieg. zeigte Veränderungen beim prozentualen Gehalt von Molekülmarkern zur Unterscheidung verschiedener Subkultivierungszeiten, wobei der PA28:0-Gehalt bei Erhöhung der Subkultivierungszeit einen Anstiegstrend aufwies.
In wiesen die Zellen der Mischbakterien am 0., 50., 100. und 150. Tag der Subkultivierung einen Gehalt an Phospholipid-Zellen von insgesamt 8,39, 6,33, 6,62 beziehungsweise 7,91 nmol/mg Zelltrockengewicht auf, wobei eine signifikante Verringerung des Gesamt-Phospholipid-Gehalts an Zellen am 50. Tag der Subkultivierung und danach ein Anstiegstrend festzustellen waren. Der gesamte Gehalt an Phospholipid-Molekülen der Mischbakterien am 0., 50., 100. und 150. Tag gemäß Matrix wurde einer Analyse der Hauptbestandteile unterzogen ( ). Das Auswertungsdiagramm zeigte, dass die Phospholipid-Zellkomponenten am 0., 50., 100. und 150. Tag einen signifikanten Unterschied aufwiesen und dass eine sequentielle Verteilung entlang der ersten Hauptkomponente vorlag, was auf einen Trend dahin hinwies, dass die Phospholipid-Zellkomponenten der Mischbakterien sich mit Erhöhung der Subkulturzahl nach und nach veränderten; Das Belastungsdiagramm zeigte, dass die meisten PG- und LPE-Moleküle in positiver Korrelation zu den Zellen vom 0. Tag standen, während der Gehalt von einigen PE- und PA-Molekülen bei voranschreitender Subkultivierung anstieg. zeigte Phospholipid-Molekülmarker der Mischbakterien von verschiedenen Subkulturzahlen, wobei sich eine Reihe von PG- und LPE-Molekülen mit der Subkultivierung verringerten, während PE- und PA-Moleküle einen Anstiegstrend aufwiesen. Dies wies darauf hin, dass - mit der Erhöhung der Subkultivierungszeit für die beiden Bakterien und der Verlängerung der Interaktionszeit - sich der Stoffwechsel von Phospholipiden veränderte; Die LPE-Verringerung und der PA-Anstieg ließen vermuten, dass verschiedene zum Phospholipid-Stoffwechsel gehörende Enzyme unterschiedliche Auswirkungen auf die Co-Subkultivierung von zwei Bakterien und die Zellmembran-Signalübertragung hatten.
Beispiel 4-2 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Analyse von Veränderungen von Phospholipidom im Subkultivierungsprozess von Vitamin-C-Produktionsstämmen, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Bereitstellung von 10 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 10 µl Bacillus megaterium präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 28°C für 48 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 28°C 48 h Stunden lang unter Schütteln mit 200 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 28°C unter Schütteln mit 240 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 24 h und einem Volumenverhältnis von 1 %, um die Subkultivierung 130 Tage lang durchzuführen, Nehmen von fünf Proben, am 0. Tag, 20. Tag, 40. Tag, 80. Tag und am 130·Tag;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien der fünf Proben, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 28°C 24 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 200 U/min bei 28°C 48 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium, entwickeltem Gluconobacter oxydans und einer Mischung aus entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans in Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10⁷ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 200 U/min bei 28°C 15 Stunden lang.
(5) Extrahieren von zellulärem Phospholipidom

(i) Entnehmen von drei Zellsuspensionen mit einem Volumen von 100 ml, unter Schütteln 10 Stunden kultiviert in Schritt (4), Zentrifugieren mit 1000 U/min 10 min lang, Abpipettieren des Überstands, Beibehalten von Zellen, Waschen der Zellen mit Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2, ein Mal, Zentrifugieren unter denselben Bedingungen, Abpipettieren des Überstands, um Zellen zu erhalten;
(ii) Zermahlen der Zellen aus Schritt (i) durch Zermahlen mit flüssigem Stickstoff, um Pulver zu erhalten, Entnehmen von 200 mg des Zellpulvers, Einlegen in Zentrifugenröhrchen A, Hinzugeben von 0,5 ml ultrareinem Wasser, sorgfältiges Mischen;
(iii) Hinzugeben von 2 ml Extraktionslösung in das Zentrifugenröhrchen A, sorgfältiges Mischen, Zentrifugieren bei 1000 U/min 10 min lang, Schichten der Lösung, Entnehmen der organischen Lösungsmittelschicht von der unteren Schicht, Einlegen in Zentrifugenröhrchen B;
(iv) Wiederholen von Schritt (iii), zwei Mal, bis die Sedimentierung der Zellen abgeschlossen ist;
(v) Hinzugeben von 0,5 ml einer wässrigen KCI-Lösung mit einer Konzentration von 0,8 mol/l in Zentrifugenröhrchen B, sorgfältiges Mischen, Zentrifugieren bei 2000 U/min 10 min lang, Abpipettieren des Überstands, der wasserlösliche Verunreinigungen enthält;
(v) Hinzugeben von 1 ml ultrareinem Wasser in Zentrifugenröhrchen B, sorgfältiges Mischen, Zentrifugieren bei 2000 U/min 10 min lang, Abpipettieren des Überstands,
(vii) Entfernung des organischen Lösungsmittels in der, in Schritt (vi) erhaltenen Mischung durch Destillation bei 40°C bei reduziertem Druck, um eine Extraktmischung der gesamten Phospholipiden zu erhalten;
(viii) Lösen der Extraktmischung der gesamten Phospholipiden in 0,2 ml Aufbewahrungslösung, um eine Probe zu erhalten, Lagern bei unter -40°C;
(ix) (ix) Hinzugeben von Normalmaßen von Phospholipiden zur Probe, vor der Detektion, wobei es sich bei den Normalmaßen um bisdodecylacylphosphatidyl glycerol und bisdodecylacylphosphatidyl ethanolamine handelte, so dass die letztendliche Konzentration der einzelnen der beiden Normalmaße von Phospholipiden 0,5 µg/ml betrug;

1

(6) LC-MS-Detektion:
Detektieren der in Schritt (5) erhaltenen Probe, der Normalmaße von Phospholipiden hinzu gegeben wurden, mit LC-MS, um die Molekularstruktur und Gehaltsdaten des Phospholipidoms bei der Subkultivierung der Mischbakterien für die Vitamin C-Produktion zu erhalten;
Die Bedingungen für die LC-MS-Detektion waren dieselben wie in Beispiel 4-1:
(7) Multivariate Analyse
Unterziehen der Daten zum Molekülgehalt des Phospholipidom beim Subkultivierungsprozess der Vitamin C-Produktionsstämme, wie in Schritt (6) erhalten, einer multivariaten Analyse, um differentielle Phospholipid-Marker zur Unterscheidung von Vitamin C-Produktionsstämmen in unterschiedlichen Subkultivierungsperioden zu erhalten; wobei die multivariate Analyse die Durchführung einer Analyse der Hauptbestandteile nach erfolgter Pareto-Skalierung umfasste;
(8) Prozessanalyse
Aufzeichnung eines Diagramms des Gehalts der differentiellen Phospholipid-Marker, wie diese in Schritt (7) erhalten wurden, in Abhängigkeit der verschiedenen Subkultivierungszeiten, Beobachtung und Analyse der variierenden Muster dieser Phospholipid-Moleküle, anschließend Erforschung der Phospholipid-Moleküle und der relevanten zugehörigen Stoffwechselwege, die eine entscheidende Rolle bei der Subkultivierung der Mischbakterien spielten, dadurch Bereitstellen einer Orientierungshilfe für die Optimierung der Stammmodifikation und der Kultivierungsbedingungen mit dem Ziel einer Erhöhung der 2-Keto-L-gulonsäure.
Beispiel 4-3 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Analyse von Veränderungen von Phospholipidom im Subkultivierungsprozess von Vitamin-C-Produktionsstämmen, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Feste Kultur:
Bereitstellung von 500 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 30%iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 500 µl Bacillus megaterium präserviert in 30 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 30°C für 24 Stunden;
(2) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 35°C 24 h Stunden lang unter Schütteln mit 280 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans, Kultivierung bei 35°C unter Schütteln mit 280 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 48 h und einem Volumenverhältnis von 10 % um die Subkultivierung 100 Tage lang durchzuführen, nehmen von drei Proben, am 0. Tag, 50. Tag und am 100. Tag;
(3) Trennung und Reinigung:
Ausstreichung der durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien der drei Proben, um die Trennung und Reinigung durchzuführen, dann separate Inokulierung auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 35°C 48 h lang; dann separate Übertragung in Anzuchtnährmedium, Kultivierung unter Schütteln mit 280 U/min bei 35°C 24 h lang, um eine entwickelte Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und eine entwickelte Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
(4) Fermentation
Inokulation von entwickeltem Bacillus megaterium, entwickeltem Gluconobacter oxydans und einer Mischung aus entwickeltem Bacillus megaterium und entwickeltem Gluconobacter oxydans in Fermentationskulturmedium, um eine Dichte von 2×10¹⁰ CFU/ml bei entwickeltem Bacillus megaterium und eine Dichte von 2×10¹¹ CFU/ml bei entwickeltem Gluconobacter oxydans zu erreichen, Kultivierung unter Schütteln mit 280 U/min bei 35°C 10 Stunden lang.
(5) Extrahieren von zellulärem Phospholipidom

(i) Entnehmen von drei Zellsuspensionen mit einem Volumen von 200 ml, unter Schütteln 10 Stunden kultiviert in Schritt (4), Zentrifugieren mit 3000 U/min 3 min lang, Abpipettieren des Überstands, Beibehalten von Zellen, Waschen der Zellen mit Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4, ein Mal, Zentrifugieren unter denselben Bedingungen, Abpipettieren des Überstands, um Zellen zu erhalten;
(ii) Zermahlen der Zellen aus Schritt (i) durch Zermahlen mit flüssigem Stickstoff, um Pulver zu erhalten, Entnehmen von 300 mg des Zellpulvers, Einlegen in Zentrifugenröhrchen A, Hinzugeben von 0,8 ml ultrareinem Wasser, sorgfältiges Mischen;
(iii) Hinzugeben von 4 ml Extraktionslösung in das Zentrifugenröhrchen A, sorgfältiges Mischen, Zentrifugieren bei 3000 U/min 3 min lang, Schichten der Lösung, Entnehmen der organischen Lösungsmittelschicht von der unteren Schicht, Einlegen in Zentrifugenröhrchen B;
(iv) Wiederholen von Schritt (iii), vier Mal, bis die Sedimentierung der Zellen abgeschlossen ist;
(v) Hinzugeben von 1,5 ml einer wässrigen KCI-Lösung mit einer Konzentration von 1,2 mol/l in Zentrifugenröhrchen B, sorgfältiges Mischen, Zentrifugieren bei 4000 U/min 3 min lang, Abpipettieren des Überstands, der wasserlösliche Verunreinigungen enthält;
(v) Hinzugeben von 3 ml ultrareinem Wasser in Zentrifugenröhrchen B, sorgfältiges Mischen, Zentrifugieren bei 4000 U/min 3 min lang, Abpipettieren des Überstands,
(vii) Entfernung des organischen Lösungsmittels in der, in Schritt (vi) erhaltenen Mischung durch Stripping mit Stickstoffgas, um eine Extraktmischung der gesamten Phospholipiden zu erhalten;
(viii) Lösen der Extraktmischung der gesamten Phospholipiden in 2 ml Aufbewahrungslösung, um eine Probe zu erhalten, Lagern bei unter -40°C;
(ix) (ix) Hinzugeben von Normalmaßen von Phospholipiden zur Probe, vor der Detektion, wobei es sich bei den Normalmaßen um bisdecylacylphosphatidyl glycerol, bisdecylacylphosphatidyl ethanolamine und bisdecylacylphosphatidic acid, handelte, so dass die letztendliche Konzentration der einzelnen der drei Normalmaße von Phospholipiden 1,5 µg/ml betrug;

2

(6) LC-MS-Detektion:
Detektieren der in Schritt (5) erhaltenen Probe, der Normalmaße von Phospholipiden hinzu gegeben wurden, mit LC-MS, um die Molekularstruktur und Gehaltsdaten des Phospholipidoms bei der Subkultivierung der Mischbakterien für die Vitamin C-Produktion zu erhalten;
Die Bedingungen für die LC-MS-Detektion waren dieselben wie in Beispiel 4-1:
(7) Multivariate Analyse
Unterziehen der Daten zum Molekülgehalt des Phospholipidom beim Subkultivierungsprozess der Vitamin C-Produktionsstämme, wie in Schritt (6) erhalten, einer multivariaten Analyse, um differentielle Phospholipid-Marker zur Unterscheidung von Vitamin C-Produktionsstämmen in unterschiedlichen Subkultivierungsperioden zu erhalten; wobei die multivariate Analyse die Durchführung einer Analyse der Hauptbestandteile nach erfolgter Pareto-Skalierung umfasste;
(8) Prozessanalyse
Aufzeichnung eines Diagramms des Gehalts der differentiellen Phospholipid-Marker, wie diese in Schritt (7) erhalten wurden, in Abhängigkeit der verschiedenen Subkultivierungszeiten, Beobachtung und Analyse der variierenden Muster dieser Phospholipid-Moleküle, anschließend Erforschung der Phospholipid-Moleküle und der relevanten zugehörigen Stoffwechselwege, die eine entscheidende Rolle bei der Subkultivierung der Mischbakterien spielten, dadurch Bereitstellen einer Orientierungshilfe für die Optimierung der Stammmodifikation und der Kultivierungsbedingungen mit dem Ziel einer Erhöhung der 2-Keto-L-gulonsäure.
Diese Tests bestätigten, dass Beispiel 4-2 und Beispiel 4-3 Ergebnisse erbrachten, die mit denen von Beispiel 4-1 vergleichbar sind.
Die Zusammensetzungen von bei der vorliegenden Offenbarung verwendeten festen Nährmedien, Anzuchtnährmedien und Fermentationskulturmedien wurden anhand der Medien ausgewählt, die in der chinesischen Patentanmeldung Nummer: 201110314740.9 bekannt gegeben wurden, wie beispielsweise:
Feststoffkulturmedium: Abwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 20 g Agar, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassen des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Feststoffkulturmedium zu erhalten.
Anzuchtnährmedium: Abwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 6,8, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Fermentationskulturmedium: Abwiegen von 80 g L-Sorbose, 20 g Maisquellwasser, 12 g Harnstoff, 1 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Anpassung des pH-Werts auf 7,0, 20 Minuten lang bei 121°C sterilisieren, um das Anzuchtnährmedium zu erhalten.
Beispiel 5-1 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Feststellung von Veränderungen der Nahrungsumgebung im Subkultivierungsprozess von Vitamin-C-Produktionsstämmen, bestehend aus den unten stehenden Schritten:
(1) Subkultivierung von Mischbakterien:
Feste Kultur:
Bereitstellung von 500 µl Gluconobacter oxydans, präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), und 500 µl Bacillus megaterium präserviert in 15 %iger Glycerol-Wasser-Lösung (%-Volumen), die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, gesonderte Inokulation auf festem Nährmedium, Kultivierung bei 28°C für 24 Stunden;
(ii) Anzuchtkultur:
Separate Übertragung von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans, wie in Schritt (1)(i) kultiviert, in Anzuchtnährmedium, Kultivierung bei 28°C 24 h Stunden lang unter Schütteln mit 200 U/min, um Bacillus megaterium-Samenflüssigkeit und Gluconobacter oxydans-Samenflüssigkeit zu erhalten;
Inokulation von Bacillus megaterium und von Gluconobacter oxydans in neuem Anzuchtnährmedium, zum Erreichen einer Dichte von 2×10⁷CFU/ml bei Bacillus megaterium und einer Dichte von 2×10⁸ CFU/ml bei Gluconobacter oxydans Kultivierung bei 28°C unter Schütteln mit 200 U/min, und Inokulation in neuem Anzuchtnährmedium mit einem Subkulturzyklus von 24 h und einem Volumenverhältnis von 1%, um die Subkultivierung 150 Tage lang durchzuführen; Auswählen von vier Probenentnahmezeitpunkten und nehmen von vier Proben, am 0. Tag, am 50. Tag, am 100. Tag beziehungsweise am 150. Tag.
(iii) Trennung und Reinigung:
Ausstreichen der Mischbakterien der in Schritt (1)(ii) gewonnen 4 Proben zur Durchführung der Trennung und Reinigung; separates Beimpfen eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 28°C über einen Zeitraum von 24 h; anschließend Überführen in die Anzuchtkultur, Bebrüten bei 200 U/min bei einer Temperatur von 28°C über einen Zeitraum von 24 h zur Gewinnung einer flüssigen Anzuchtkultur mit Bacillus megaterium und einer flüssigen Anzuchtkultur für Gluconobacter oxydans; Konservieren in einer Glycerin-Wasser-Lösung bei einer Volumenkonzentration von 15%;
(iv) Fermentation
Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit in Schritt (1)(iii) gewonnenem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans sowie den Mischbakterien dieser beiden Bakterien in einem neuen Anzuchtmedium, um eine Dichte von 2 × 10⁷ KBE/ml für das entstandene Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10⁸ KBE/ml für das entstandene Gluconobacter oxydans zu erhalten, Kultivieren bei 200 U/min bei einer Temperatur von 28°C über einen Zeitraum von 10 h;
(2) Bestimmung der Substanzen im Nährmilieu:
Gewinnung der Kulturlösungen:
separate Entnahme von je 1 ml der in den Schritten (1)(iv)-(v) gewonnen Kulturlösung mit Bacillus megaterium, der Kulturlösung mit Gluconobacter oxydans und der Kulturlösung mit den Mischbakterien, Zentrifugieren bei 5000 U/min, Auffangen des Überstands, Filtrieren mit einer 0,22 µm Cellulose-Millipore-Filtermembran zur Gewinnung eines Filtrats;
(ii) Vorbereitung der Proben:
Vorbereitung der Proben
(iii) GC-TOF/MS-Nachweis:
Beladen von 1 µl der in Schritt (2)(iii) gewonnenen Probe in einen Gaschromatographen mit einer DB-5MS Chromatographiesäule mit den folgenden Spezifikationen: 30 m × 0,25 mm i.d., Temperatur am Injektionsport: 250°C, hochreines Helium als Trägergas, Fließgeschwindigkeit: 0,6 m/min, Teilungsverhältnis von 3:1, Temperaturprogrammierung des Säulenofens: Initialtemperatur 50°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 2 Minuten, schrittweises Erhöhen der Temperatur auf 260°C in Schritten von 4°C/min, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 3 Minuten, Verwenden einer Elektronen-Ionisierungsquelle, Temperatur der Quelle: 230°C, Detektorspannung: 2300 V, Ionisierungsspannung: 60 eV, Strom: 30 µA; massenspektrometrischer Nachweisbereich: 50-800 m/z; Heranziehen der Datenbank NIST 2005 für den Nachweis von Substanzen im Nährmilieu, Verwenden der Software Masslynx 4.1 für die Bearbeitung der massenspektrometrisch erhobenen Daten und der Messungen des relativen Gehalts der Substanzen im Nährmilieu; Integration der chromatographischen Peak-Bereiche und Vergleich der Peak-Bereiche mit dem internen Standard zur Ermittlung des relativen Gehalts von Substanzen im Nährmilieu;
(3) Analyse der Hauptkomponenten:

(i) Durchführung einer Skalierung der Daten zum relativen Gehalt der in Schritt (2) gewonnenen Substanzen im Nährmilieu nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto;
(ii) Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten anhand der Daten der Vorbehandlung aus Schritt (3)(i) unter Verwendung der Software Matlab 7.0 (mathworks; Inc.) zur Ermittlung differentieller Marker für das Nährmilieu;

Erstellung eines Punktdiagramms und eines Belastungsdiagramms, um die Ähnlichkeiten und Unterschiede der Proben aufzuzeigen; je geringer der Abstand zwischen den die Proben repräsentierenden Punkten, desto höher die Ähnlichkeit der Proben, und je größer dieser Abstand, desto größer die Variabilität der Proben, welche herangezogen wurden, um Ähnlichkeit und Unterschiede im Nährmilieu von Bacillus megaterium, Gluconobacter oxydans und dem Mischbakteriensystem während der Subkultivierung zu vergleichen. Im Belastungsdiagramm stand jeder Punkt für eine Substanz; dabei war die Differenz während der Subkultivierung umso größer, je weiter die Substanz vom Mittelpunkt entfernt lag, eine Beobachtung, die als Marker für Veränderungen im Nährmilieu des Subkultivierungsprozesses herangezogen werden könnte (vgl. , und );
(4) Prozessanalyse

Erstellen eines Kurvendiagramms zum relativen Gehalt der differentiellen Marker für das Nährmilieu gegen unterschiedliche Subkultivierungszeiten, wie in , und veranschaulicht, das Beobachten und Analysieren der variierenden Muster dieser Substanzen, der Nachweis der Veränderungen im Nährmilieu während der Subkultivierung von Vitamin C-produzierenden Bakterienstämmen und auf diese Weise der Entdeckung von Komponenten im Nährmilieu, die bei der Subkultivierung der Mischbakterien eine wichtige Rolle spielen, sowie der Bereitstellung einer Orientierungshilfe in Bezug auf die Offenlegung von Wechselwirkungsmechanismen sowie der Optimierung von Kulturbedingungen für diese beiden Bakterien während der Subkultivierung. Tabelle 5-1: Tabelle zur Identifizierung von Substanzen im Nährmilieu während der Subkultivierung von Gluconobacter oxydans

Saccharide	Erythrose	Glucose	Ribofuranose
	Xylulose	Sorbose	Sedoheptose
	Ribose	N-Acetylamino-glucose	Turanose
	Fructose	Galactose
Am inosäuren	Alanin	Threonin	Glutaminsäure
	Valin	Prolin	Phenylalanin
	Isoleucin	Asparaginsäure	Cystein
	Glycin	4-Aminobuttersäure	Lysin
	Serin	Ornithin	Tyrosin
	Methionin	4-Hydroxylprolin	Arginin
	5-Ketoprolin	Tryptophan
Saccharidderivate	Xylitol	Mannitol	Ribitol
	2-Keto-L-Gluonsäure	Gluconsäure	2-Ketogluconsäure
	Erythritol	Galactonsäure	Glucitol
Organische	Benztraubensäure	Milchsäure	Oxalsäure
Säuren	Glycerinsäure	2,3,4-trihydroxylbuttersäure	Butendisäure
	Phosphorsäure	Apfelsäure	Citronensäure
	α-Aminobernsteinsäure	2-Aminocaprylsäure	2-Ketohexansäure
	3- Hydroxypropansäure	3-Hydroxybuttersäure	Hydroxyessigsäure
	2,4-Dihydroxybuttersäure	2-Ketoglutarsäure	Hydroxyphenylessigs äure
	2-Hydroxy-3-methylbuttersäure	2-Hydroxy-4-methylpentansäure	Pyrrol-2-Carbonsäure
Fettsäuren	n-C₁₆-Fettsäuren	n-C₁₈-Fettsäuren
Sonstige	Harnstoff	2-Hydroxyethylamin	1,4-Butanediamin
	1,5-Pentanediamin	Uracil	Thymin
	Glycerin	Asparagin	Harnsäure
	Inositol	Glycerin

Wie in Tabelle 5-1 gezeigt, waren während der Subkultivierung Vitamin C-produzierender Stämme (Gluconobacter oxydans) 74 Substanzen im Nährmilieu vorhanden, die mit dem offenbarten Verfahren nachgewiesen wurden, einschließlich 11 Saccharide, 20 Aminosäuren, 9 Saccharidderivate, 21 organischen Säuren, 2 Fettsäuren sowie 11 weitere Substanzen wie beispielsweise Amine und stickstoffhaltige Verbindungen. Tabelle 5-2: Tabelle zur Identifizierung von Substanzen im Nährmilieu während der Subkultivierung von Bacillus megaterium

Saccharide	Erythrose	Glucose	Ribofuranose
	Xylulose	Sorbose	Sedoheptose
	Ribose	N-Acetylaminoglucose	Turanose
	Fructose	Galactose
Amino acids	Alanin	Threonin	Glutaminsäure
	Valin	Prolin	Phenylalanin
	Isoleucin	Asparaginsäure	Cystein
	Glycin	4-Aminobuttersäure	Lysin
	Serin	Ornithin	Tyrosin
	Methionin	4-Hydroxylprolin	Arginin
	5-Ketoprolin	Tryptophan
Saccharidderiv ate	Xylitol	Mannitol	Ribitol
	Glucitol	Gluconsäure	2-Ketogluconsäure
	Erythritol	Galactonsäure
Organische Säuren	Benztraubensäure	Milchsäure	Oxalsäure
	Glycerinsäure	2,3,4-trihydroxylbuttersäur e	Butendisäure
	Phosphorsäure	Apfelsäure	Citronensäure
	α-Aminobernsteinsäure	2-Aminocaprylsäure	2-Ketohexansäure
	3-Hydroxypropansäure	3-Hydroxybuttersäure	Hydroxyessigsäure
	2,4-Dihydroxybuttersäure	2-Ketoglutarsäure	4-Hydroxyphenylessigs äure
	2-Hydroxy-4-methyl pentansäure	2-Am inobenzoesäure	Pyrrol-2-Carbonsäure
	2-Hydroxy-3-methyl buttersäure
Fettsäuren	n-C₁₆-Fettsäuren	n-C₁₈-Fettsäuren
Sonstige	Harnstoff	2-Hydroxyethylamin	1, 4-butanediamine
	1, 5-pentanediamine	Uracil	Thymin
	Glycerin	Asparagin	Harnsäure
	Inositol	Hypoxanthin

Wie in Tabelle 5-2 gezeigt, waren während der Subkultivierung Vitamin C-produzierender Stämme (Bacillus megaterium) 74 Substanzen im Nährmilieu vorhanden, die mit dem offenbarten Verfahren nachgewiesen wurden, einschließlich 11 Saccharide, 20 Aminosäuren, 8 Saccharidderivate, 22 organischen Säuren, 2 Fettsäuren sowie 11 weitere Substanzen wie beispielsweise Amine und stickstoffhaltige Verbindungen. Tabelle 5-3: Tabelle zur Identifizierung von Substanzen im Nährmilieu während der Subkultivierung von Mischbakterien

Saccharide	Erythrose	Glucose	Ribofuranose
	Xylulose	Sorbose	Sedoheptose
	Ribose	N-Acetylaminoglucose	Turanose
	Fructose	Galactose
Amino acids	Alanin	Threonin	Glutaminsäure
	Valin	Prolin	Phenylalanin
	Isoleucin	Asparaginsäure	Cystein
	Glycin	4-Aminobuttersäure	Lysin
	Serin	Ornithin	Tyrosin
	Methionin	4-Hydroxylprolin	Arginin
	5-Ketoprolin	Tryptophan
Saccharidderivate	Xylitol	Mannitol	Ribitol
	Glucitol	Gluconsäure	2-Ketogluconsäure
	Erythritol	Galactonsäure	2-Keto-L-Gluonsäure
Organische Säuren	Benztraubensäure	Milchsäure	Oxalsäure
	Glycerinsäure	2,3,4-trihydroxylbuttersäure	Butendisäure
	Phosphorsäure	Apfelsäure	Citronensäure
	α-Am inobernsteinsäure	2-Aminocaprylsäure	2-Ketohexansäure
	3-Hydroxypropansäure	3-Hydroxybuttersäure	Hydroxyessigsäure
	2,4-Dihydroxybuttersäure	2-Ketoglutarsäure	4-Hydroxyphenylessigsäure
	Malonsäure	2-Aminobenzoesäure	Pyrrol-2-Carbonsäure
	2-Hydroxy-3-methylbuttersäure	2-Hydroxy-4-methylpentansäure	2-Keto-3-methylbuttersäure
Fettsäuren	n-C₁₆-Fettsäuren	n-C_18-Fettsäuren
Sonstige	Harnstoff	2-Hydroxyethylamin	1,4-Butanediamin
	1,5-Pentanediamin	Uracil	Thymin
	Glycerin	Asparagin	Harnsäure
	Inositol	Hypoxanthin

Wie in Tabelle 5-3 gezeigt, waren während der Subkultivierung Vitamin C-produzierender Stämme der Mischbakterien 77 Substanzen im Nährmilieu vorhanden, die mit dem offenbarten Verfahren nachgewiesen wurden, einschließlich 11 Saccharide, 20 Aminosäuren, 9 Saccharidderivate, 24 organischen Säuren, 2 Fettsäuren sowie 11 weitere Substanzen wie beispielsweise Amine und stickstoffhaltige Verbindungen.
Der relative Gehalt von Substanzen im Nährmilieu von Zellen der 0., 50., 100. und 150. Generation von subkultiviertem Gluconobacter oxydans wurde als Probenmatrix zur Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten herangezogen ( ). Das Punktdiagramm machte deutlich, dass sich diese Substanzen offensichtlich in 4 Klassen unterteilen ließen; aus dem Belastungsdiagramm ging hervor, dass der Gehalt an Aminosäuren im Nährmilieu der Kulturlösung mit fortschreitender Subkultivierung in signifikanter Weise anstieg. Bei handelt es sich um ein Diagramm, welches die Veränderungen des relativen Gehalts an molekularen Markern anzeigt, welche zur Unterscheidung der unterschiedlichen Subkultivierungszeiten herangezogen wurden; dabei zeigte sich für Valin, Isoleucin, Prolin, Glycin, Alanin, Serin, 5-Ketoprolin, Tyrosin und Tryptophan mit zunehmender Subkultivierungszeit eine steigende Tendenz, die höher lag als bei den leeren Kulturmedien. Dies war ein Ergebnis eines Proteinabbaus durch Gluconobacter oxydans; darüber hinaus sorgte die Akkumulierung dieser Substanzen auch für ein für das Wachstum großer Bakterien ausreichendes Nährstoffangebot.
Wie in gezeigt, wurde der relative Gehalt von Substanzen im Nährmilieu von Zellen der 0., 50., 100. und 150. Generation von subkultiviertem Bacillus megaterium als Probenmatrix zur Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten herangezogen. Aus dem Punktdiagramm wurde ersichtlich, dass sich diese Substanzen sinnvoll in 4 Klassen unterteilen ließen; im Belastungsdiagramm verteilten sich 5 molekulare Marker sequentiell entlang der Aufwärtsrichtung der ersten Hauptkomponente, was auf die Tendenz einer graduellen Veränderung dieser Marker mit zunehmender Generationenzahl hindeutete. zeigte die Tendenz einer Veränderung der molekularen Marker im Nährmilieu bei der Subkultivierung von Bacillus megaterium zu unterschiedlichen Subkultivierungszeiten. Mit Ausnahme von Erythrose und 4-Hydroxylprolin war der Gehalt weiterer Marker niedriger als in den leeren Medien. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass diese Substanzen von den großen Bakterien für das Wachstum und die Stoffsynthese von Stoffen verbraucht wurden. Mit steigenden Subkultivierungszeiten nahm der Gehalt von Prolin und Glycin graduell ab; der niedrigste Gehalt wurde dabei im Kulturmilieu der großen Bakterien der 150. Generation beobachtet, welcher deutlich niedriger lag als im Ausgangsstamm. Die Akkumulierung von Prolin im Körper großer Bakterien unterstützte deren Resistenz gegenüber umweltbedingtem Stress; Glycin spielte dabei eine wichtige Rolle für die Zellmembran, und in hohen Konzentrationen trug Glycin zur Förderung der Durchlässigkeit der Zellmembran bei. Die Akkumulierung von Prolin im Körper großer Bakterien unterstützte deren Resistenz gegenüber umweltbedingtem Stress; Glycin spielte dabei eine wichtige Rolle für die Zellmembran, und in hohen Konzentrationen trug Glycin zur Förderung der Durchlässigkeit der Zellmembran bei. Im Nährmilieu war die Konzentration von Erythrose und 4-Hydroxylprolin höher als in den leeren Kulturmedien; daher sind diese höheren Konzentrationen als das Ergebnis der extrazellulären Akkumulierung großer Bakterien anzusehen. Die Konzentrationen dieser beiden Marker stiegen mit zunehmender Subkultivierungsdauer an und erreichten ein Maximum im Subkultivierungsmilieu großer Bakterien der 150. Generation. Erythrose ist ein Präkursor der Synthese von aromatischen Aminosäuren und Vitamin B₆ und kann Gluconobacter oxydans bei der Synthese von Aminosäuren unterstützen und die Verstoffwechselung von Kohlenhydrate optimieren.
In wurde der relative Gehalt von Substanzen im Nährmilieu der Zellen der 0., 50., 100. und 150. Generation der subkultivierten Mischbakterien als Probenmatrix zur Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten herangezogen. Das Punktdiagramm zeigte, dass die 50. und die 100. Generation relativ dicht beieinander lagen; die 0. Generation der gemischten Bakterien unterschied sich hingegen in signifikanter Weise von den entstandenen Mischbakterien. Das Belastungsdiagramm zeigte wichtige differentielle molekulare Marker, die zur Unterscheidung der Proben herangezogen wurden, d. h. Oxalsäure, Prolin, Malonsäure, 5-Ketoprolin, Fructose, Tyrosin, Galactonsäure, Hexadecansäure, 1,5-Pentanediamin, Octadecansäure und Tryptophan. Der Gehalt dieser Marker im Kulturmilieu stieg mit zunehmender Subkultivierungsdauer graduell an. Insbesondere Prolin und 5-Ketoprolin erreichten die höchsten Konzentrationen in den Mischbakterien der 150. Generation ( ); bei diese beiden Substanzen handelte es sich um wichtige Substanzen, welche die Bildung von 2-KLG bei der Fermentation der Mischbakterien beeinflussten. Die oben geschilderten Veränderungen zeigten, dass sich mit zunehmender Subkultivierungsdauer die Zeit, in der die beiden Bakterien miteinander wechselwirkten, verlängerte, sich das Nährmilieu der beiden Bakterien veränderte und sich der Gehalt dieser Nährstoffe verringerte, was auf eine bessere Kooperation der entstandenen Bakterien hindeutet.
Beispiel 5-2 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zum Nachweis von Veränderungen im Nährmilieu von Vitamin C-produzierenden Stämmen während der Subkultivierung, das die folgenden Schritte umfasst:
(1) Subkultivierung der Mischbakterien:
Feste Kultur:
Bereitstellen von 10 µl Gluconobacter oxydans, konserviert in einer 20% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen) und 10 µl Bacillus megaterium, konserviert in einer 20% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen), gelagert in Flüssigstickstoff, separates Beimpfen je eines festen Kulturmediums, anschließend Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 36 h;
(ii) Anzuchtkultur:
separates Überführen von in Schritt (1)(i) gewonnenem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in eine Anzuchtkultur, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 36 h bei 250 U/min zur Gewinnung eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Gluconobacter oxydans;
Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans, um eine Dichte von 2 × 10⁸ KBE/ml für Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10⁹ KbE/ml für Gluconobacter oxydans zu erzielen, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C bei 250 U/min, anschließend Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit einem Subkulturzyklus von 36 h und einem Volumenverhältnis von 5%, um eine Subkultur von 100 Tagen anzulegen, der Festlegung von 3 Zeitpunkte der Probenentnahme und der Entnahme von 3 Proben an den Tagen 0 bis 100 der Kultur, und zwar jeweils einzeln an den Tagen 0, 50 und 100;
(iii) Trennung und Reinigung:
Ausstreichen der gemischten Bakterien der in Schritt (1)(ii) gewonnen 3 Proben zur Durchführung der Auftrennung und Reinigung; anschließend Beimpfen jeweils eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 36 h; anschließend separates Überführen in das Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 36 h bei 250 U/min, um ein flüssiges Anzuchtnährmedium mit Bacillus megaterium und ein flüssiges Anzuchtmedium mit dem sich gebildeten Gluconobacter oxydans zu erhalten; Konservierung in einer Glycerin-Wasser-Lösung in einer Volumenkonzentration von 20%;
(iv) Fermentation:
Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit in Schritt (1)(iii) gewonnenem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans sowie den Mischbakterien dieser beiden Bakterien in einem neuen Anzuchtnährmedium, um eine Dichte von 2 × 10⁸ KBE/ml für das entstandene Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10⁹ KBE/ml für das entstandene Gluconobacter oxydans zu erhalten, Bebrüten bei 250 U/min bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 12 h;
(2) Bestimmung der Substanzen im Nährmilieu:
Gewinnung der Kulturlösungen:
Entnehmen von je 1 ml der in Schritt (1)(iv) gewonnenen Kulturlösung mit Bacillus megaterium, der Kulturlösung mit Gluconobacter oxydans und der Kulturlösung mit den Mischbakterien, Zentrifugieren bei 8000 U/min, Auffangen des Überstands, Filtrieren mit einer 0,22 µm Cellulose-Millipore-Filtermembran zur Gewinnung eines Filtrats;
(ii) Vorbereitung der Proben:
Entnehmen von je 20 µl des in Schritt (2)(i) gewonnenen Filtrats und Hineingeben in ein Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 100 µl einer mit Deuterium markierten 0,10 mg/ml Bernsteinsäure-Methanol-Lösung als interner Standardsubstanz, gefriertrocknen; Hinzufügen von 80 µl einer 20 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid-Pyridin-Lösung und Durchführen einer Oximierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 90 Minuten im Anschluss daran Hinzufügen von 80 µl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid und Durchführen einer Silanisierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 40 Minuten;
(iii) GC-TOF/MS-Nachweis:
Beladen von 1 µl der in Schritt (2)(iii) gewonnenen Probe in einen Gaschromatographen mit einer DB-5MS Chromatographiesäule mit den folgenden Spezifikationen: 30 m × 0,25 mm i.d., Temperatur am Injektionsport: 270°C, hochreines Helium als Trägergas, Fließgeschwindigkeit: 0,8 m/min, Teilungsverhältnis von 20:1, Temperaturprogrammierung des Säulenofens: initial 60°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 3 Minuten, stufenweises Erhöhen der Temperatur bei einer Rate von 6°C/min auf 280°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 3 Minuten, Verwenden einer EI Ionisierungsquelle, Temperatur der Quelle von 250°C, Detektorspannung 2500 V, Ionisierungsspannung 70 eV, Strom 40 µA; massenspektrometrischer Nachweisbereich von 50-800 m/z; Heranziehen der Datenbank NIST 2005 für den Nachweis von Substanzen im Nährmilieu, Verwenden der Software Masslynx 4.1 für die Bearbeitung der massenspektrometrisch erhobenen Daten und der Messungen des relativen Gehalts der Substanzen im Nährmilieu; Integration der chromatographischen Peak-Bereiche und Vergleich der Peak-Bereiche mit dem internen Standard zur Ermittlung des relativen Gehalts von Substanzen im Nährmilieu;
(3) Analyse der Hauptkomponenten:

(i) Durchführung einer Skalierung der Daten zum relativen Gehalt der in Schritt (2) gewonnenen Substanzen im Nährmilieu nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto;
(ii) Durchführung der Analyse der Hauptkomponenten anhand der Daten der Vorbehandlung aus Schritt (3)(i) unter Verwendung der Software Matlab 7.0 (mathworks. Inc.) , um differentielle Marker für das Nährmilieu zu gewinnen, die für ein Punktdiagramm und ein Belastungsdiagramm herangezogen wurden, um Ähnlichkeiten und Unterschiede von Proben aufzuzeigen; im Punktdiagramm war dabei der Abstand zwischen den die Proben repräsentierenden Punkten umso geringer, je höher die Ähnlichkeit der Proben; je größer dieser Abstand, desto größer die Variabilität der Proben, welche herangezogen wurden, um die Ähnlichkeit und Variabilität des Nährmilieus von Bacillus megaterium, Gluconobacter oxydans und dem Mischbakteriensystem während der Subkultivierung zu vergleichen. Im Belastungsdiagramm stand jeder Punkt für eine Substanz; dabei war die Differenz während der Subkultivierung umso größer, je weiter die Substanz vom Mittelpunkt entfernt lag. Dies könnte als Marker für Veränderungen im Nährmilieu der Subkultivierung herangezogen werden;

(4) Prozessanalyse
Erstellen eines Kurvendiagramms zum relativen Gehalt der differentiellen Marker für das Nährmilieu bei unterschiedlichen Subkultivierungszeiten, das Beobachten und Analysieren der variierenden Muster dieser Substanzen und auf diese Weise die Identifizierung von Komponenten im Nährmilieu, die während der Subkultivierung der Mischbakterien eine wichtige Rolle spielten, und der Bereitstellung einer Orientierungshilfe in Bezug auf die Offenlegung von Wechselwirkungsmechanismen sowie der Optimierung von Kulturbedingungen für die beiden Bakterien während der Subkultivierung.
Beispiel 5-3 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zum Nachweis von Veränderungen im Nährmilieu von Vitamin C-produzierenden Stämmen während der Subkultivierung, das die folgenden Schritte umfasst:
(1) Subkultivierung von Mischbakterien:
Feste Kultur:
Bereitstellen von 200 µl Gluconobacter oxydans, konserviert in einer 30% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen) und 200 µl Bacillus megaterium, konserviert in einer 30% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen), gelagert in Flüssigstickstoff, separates Beimpfen jeweils eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 48 h;
(ii) Anzuchtkultur:
separates Übertragen von in Schritt (1)(i) kultiviertem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in das Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 48 h bei 280 U/min zur Gewinnung eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Gluconobacter oxydans;
separates Übertragen von in Schritt (1)(i) kultiviertem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in das Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 48 h bei 280 U/min zur Gewinnung eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Gluconobacter oxydans;
(iii) Trennung und Reinigung:
Ausstreichen der gemischten Bakterien der in Schritt (1)(ii) gewonnen 4 Proben zur Durchführung der Trennung und Reinigung; im Anschluss daran Beimpfen jeweils eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 48 h; im Anschluss daran separates Überführen in das Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 48 h bei 280 U/min, um ein flüssiges Anzuchtnährmedium mit Bacillus megaterium und ein flüssiges Anzuchtmedium mit dem sich gebildeten Gluconobacter oxydans zu erhalten; Konservierung in einer Glycerin-Wasser-Lösung in einer Volumenkonzentration von 30%;
(iv) Fermentation
Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit in Schritt (1)(iii) gewonnenem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans sowie den Mischbakterien dieser beiden Bakterien in einem neuen Anzuchtnährmedium, um eine Dichte von 2 × 10¹⁰ KBE/ml für das entstandene Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10¹¹ KBE/ml für das entstandene Gluconobacter oxydans zu erhalten, Bebrüten bei 280 U/min bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 15 h;
(2) Bestimmung der Substanzen im Nährmilieu:
Gewinnung der Kulturlösungen:
separate Entnahme von je 1 ml der in Schritt (1)(iv) gewonnenen Kulturlösungen mit Bacillus megaterium, Gluconobacter oxydans und den Mischbakterien, Zentrifugieren bei 1000 U/min, dem Auffangen des Überstands, der Filtrierung mit einer 0,22 µm Cellulose-Millipore-Filtermembran zur Gewinnung eines Filtrats;
(ii) Vorbereitung der Proben:
Entnehmen von 50 µl des in Schritt (2)(i) gewonnenen Filtrats und Gabe in ein Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 200 µl einer mit Deuterium markierten 0,14 mg/ml Bernsteinsäure-Methanol-Lösung als interner Standardsubstanz, gefriertrocknen; 100 µl einer 20 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid-Pyridin-Lösung hinzugeben und Durchführen einer Oximierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 40°C über einen Zeitraum von 120 Minuten; im Anschluss daran Hinzufügen von 100 µl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid und Durchführen einer Silanisierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 40°C über einen Zeitraum von 60 Minuten;
(iii) GC-MS/TOF-Nachweis:
Beladen von 1 µl der in Schritt (2)(iii) gewonnenen Probe in einen Gaschromatographen mit einer DB-5MS Chromatographiesäule mit den folgenden Spezifikationen: 30 m × 0,25 mm i.d., Temperatur am Injektionsport: 280°C, hochreines Helium als Trägergas, Fließgeschwindigkeit: 0,7 m/min, Teilungsverhältnis von 5:1, Temperaturprogrammierung des Säulenofens: Initialtemperatur 80°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 5 Minuten, schrittweises Erhöhen der Temperatur auf 300°C in Schritten von 8°C/min, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 8 Minuten, Verwenden einer Elektronen-Ionisierungsquelle, Temperatur der Quelle: 260°C, Detektorspannung: 2700 V, Ionisierungsspannung: 80 eV, Strom: 50 µA; massenspektrometrischer Nachweisbereich: 50-800 m/z; Heranziehen der Datenbank NIST 2005 für den Nachweis von Substanzen im Nährmilieu, Verwenden der Software Masslynx 4.1 für die Bearbeitung der massenspektrometrisch erhobenen Daten und der Messungen des relativen Gehalts der Substanzen im Nährmilieu; Integration der chromatographischen Peak-Bereiche und Vergleich der Peak-Bereiche mit dem internen Standard zur Ermittlung des relativen Gehalts von Substanzen im Nährmilieu;
(3) Analyse der Hauptkomponenten:

(i) Durchführung einer Skalierung der Daten zum relativen Gehalt der in Schritt (2) gewonnenen Substanzen im Nährmilieu nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto;
(ii) Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten anhand der in Schritt (3)(i) gewonnenen Daten zur Vorbehandlung unter Verwendung der Software Matlab 7.0 (mathworks. Inc.) zur Erstellung eines Punktdiagramms und eines Belastungsdiagramms, die die Ähnlichkeiten und Unterschiede von Proben aufzeigen; im Punktdiagramm war dabei der Abstand zwischen den die Proben repräsentierenden Punkten umso geringer, je höher die Ähnlichkeit der Proben; je größer dieser Abstand, desto größer die Variabilität der Proben, welche herangezogen wurden, um die Ähnlichkeiten und Unterschiede im Nährmilieu von Bacillus megaterium, Gluconobacter oxydans und dem Mischbakteriensystem während der Subkultivierung zu vergleichen. Im Belastungsdiagramm stand jeder Punkt für eine Substanz; dabei war der Unterschied während der Subkultivierung umso größer, je weiter die Substanz vom Mittelpunkt entfernt lag. Dies könnte als Marker für Veränderungen im Nährmilieu während der Subkultivierung herangezogen werden;

(4) Prozessanalyse
Erstellen eines Kurvendiagramms zum relativen Gehalt der differentiellen Marker für das Nährmilieu bei unterschiedliche Subkultivierungszeiten, das Beobachten und Analysieren der variierenden Muster dieser Substanzen und auf diese Weise der Identifizierung von Komponenten im Nährmilieu, die bei der Subkultivierung der Mischbakterien eine wichtige Rolle spielten, sowie der Bereitstellung einer Orientierungshilfe in Bezug auf die Offenlegung von Wechselwirkungsmechanismen sowie der Optimierung von Kulturbedingungen für die beiden Bakterien während der Subkultivierung.
Diese Tests bestätigten, dass die Beispiele 5-2 und 5-3 zu den gleichen Ergebnissen führten wie Beispiel 5-1.
Die Zusammensetzung der festen Kulturmedien und der flüssigen Anzuchtkulturmedien der vorliegenden Offenbarung wurden aus den in der Anmeldung des chinesischen Patents Nr.: 201110314740.9 offengelegten Medien ausgewählt, wie beispielsweise:
Festes Kulturmedium: Einwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rinderextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 20 g Agar, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen mit Wasser auf 1 l, Einstellen des pH-Werts auf 6,8, Sterilisieren bei einer Temperatur von 121°C über einen Zeitraum von 20 Minuten zur Gewinnung eines festes Kulturmediums.
Anzuchtnährmedium: Einwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rinderextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen mit Wasser auf 1 l, Einstellen des pH-Werts auf 6,8, Sterilisieren bei einer Temperatur von 121°C über einen Zeitraum von 20 Minuten zur Gewinnung eines Anzuchtnährmediums.
Beispiel 6-1 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Analyse von Veränderungen niedermolekularer Metabolite während der Subkultivierung von Vitamin-C-produzierenden Stämmen, die durch die folgenden Schritte beschrieben wird:
(1) Subkultivierung von Mischbakterien:
Feste Kultur:
Bereitstellen von 100 µl Gluconobacter oxydans, konserviert in einer 20% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen) und 100 µl Bacillus megaterium, konserviert in einer 20% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen), gelagert in Flüssigstickstoff, separates Beimpfen eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 36 h;
(ii) Anzuchtkultur:
separates Übertragen von in Schritt (1)(i) kultiviertem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in jeweils ein Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 36 h bei 240 U/min zur Gewinnung einer flüssigen Anzuchtkultur mit Bacillus megaterium und einer flüssigen Anzuchtkultur mit Gluconobacter oxydans;
Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans, um eine Dichte von 2 × 10⁸ KBE/ml für Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10¹⁰ KBE/ml für Gluconobacter oxydans zu erzielen, Kultivieren bei einer Temperatur von 30°C bei 240 U/min, im Anschluss daran Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit einem Subkultivierungszyklus von 36 h und einem Volumenverhältnis von 5% zur Anlegung einer Subkultur von 150 Tagen zur Gewinnung von Zellen der Mischbakterien, Entnahme von 4 Proben an den Tagen 0, 50, 100 und 150;
(iii) Trennung und Reinigung:
Ausstreichen der Mischbakterien der in Schritt (1)(ii) gewonnen 4 Proben zur Durchführung der Trennung und Reinigung; im Anschluss daran separates Beimpfen eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 36 h; im Anschluss daran separates Übertragen in das flüssige Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 36 h bei 240 U/min zur Gewinnung einer flüssigen Anzuchtkultur mit Bacillus megaterium und einer flüssigen Anzuchtkultur mit Gluconobacter oxydans; Konservieren in einer Glycerin-Wasser-Lösung in einer Volumenkonzentration von 20%;
(iv) Fermentation
Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit in Schritt (1)(iii) gewonnenem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans sowie mit den Mischbakterien dieser beiden Bakterien, um eine Dichte von 2 × 10⁸ KBE/ml für das gebildete Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10¹⁰ KBE/ml für das gebildete Gluconobacter oxydans zu erhalten, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 13 h bei 240 U/min;
(2) Vorbereitung von Proben und Nachweis intrazellulärer niedermolekularer Metabolite

(i) separate Entnahme von je 150 ml von 3 in Schritt (1)(iv) gewonnenen Zellsuspensionen, Zentrifugieren bei 2000 U/min über einen Zeitraum von jeweils 5 Minuten, Abschütten des Überstands, Zurückbehalten der Zellen, 2-faches Waschen der Zellen mit einer Phosphatpufferlösung mit einem ph-Wert von 7,3, Zentrifugieren unter den gleichen Bedingungen, Abschütten des Überstands zur Gewinnung von Zellen;
(ii) Trocknen der in Schritt (2)(i) gewonnen Zellen zur Gewinnung eines trockenen Pulvers, und zwar durch Zermahlen mit Flüssigstickstoff, Entnehmen von jeweils 50 mg des getrockneten Zellpulvers, Gabe in 3 Zentrifugenröhrchen, im Anschluss daran Hinzufügen von 1,0 ml der Extraktionslösung, Hinzufügen von 50 µl einer mit Deuterium markierten 0,040 mg/ml Bernsteinsäurelösung als interner Standardsubstanz, gründlich mischen; Zentrifugieren bei 2000 U/min über einen Zeitraum von 5 Minuten, Entnehmen des Überstands und der Gabe desselben in 3 neue Zentrifugenröhrchen, Gefriertrocknen;
(iii) Hinzufügen von jeweils 50 µl einer 20 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid-Pyridin-Lösung in die in Schritt (2)(ii) gewonnenen 3 Zentrifugenröhrchen, Durchführen einer Oximierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 90 min; im Anschluss daran Hinzufügen von 80 µl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluorocetamid und Durchführen einer Silanisierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 50 min; bei der Extraktionslösung handelt es sich um eine wässrige Methanollösung mit einer Volumenfraktion von 50;
(iv) GC-TOF/MS-Nachweis: Laden von 1 µl der in Schritt 2 (iii) gewonnenen Probe in einen Gaschromatographen mit einer DB-5MS Chromatographiesäule, die eine Spezifikation von 30 m × 0,25 mm i.d. aufweist, einer Temperatur am Injektonsport von 280°C, hochreinem Helium als Trägergas, einem konstanten Druck von 91 kPa, einem Teilungsverhältnis von 10:1, Temperaturprogrammierung des Säulenofens: Initialtemperatur 70°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 5 Minuten, Erhöhung der Temperatur in einer Rate von 5°C/min., Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 10 Minuten, Verwendung einer Elektronen-Ionisierungsquelle, Temperatur der Quelle: 250°C, Detektorspannung: 2500 V, Ionisierungsspannung: 70 eV, Strom: 40 µA; massenspektrometrischer Nachweisbereich: 50-800 m/z; Heranziehen der NIST-Datenbank für den Nachweis der niedermolekularen Metabolite unter Verwendung der Software Masslynx 4.1 für die Bearbeitung der massenspektrometrisch erhobenen Daten zum relativen Gehalt der Metabolite; Integration der chromatographischen Peak-Bereiche und Vergleich der Peak-Bereiche mit dem internen Standard zur Ermittlung des relativen Gehalts niedermolekularer Metabolite.

(3) Analyse der Hauptkomponenten:

(i) Durchführung einer Skalierung der Daten zum relativen Gehalt der in Schritt (2) gewonnenen niedermolekularen Metabolite nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto;
(ii Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten anhand der Daten zur Vorbehandlung unter Verwendung der Software SIMCA-P 11.5 zur Ermittlung niedermolekulare Metabolite als Marker für die Unterscheidung von Vitamin C-produzierenden Bakterienstämme bei verschiedenen Subkultivierungszeiten;

(4) Prozessanalyse
Erstellen eines Kurvendiagramms zum Gehalt niedermolekularer Metabolite als Marker bei unterschiedlichen Subkultivierungszeiten, das Beobachten der variierenden Muster der niedermolekularen Metabolite als Marker, und dem Nachweis der Veränderungen bei den intrazellulären niedermolekularen Metaboliten als Markern während der Subkultivierung von Vitamin C produzierenden Bakterienstämmen, der Entdeckung von Metabolit-Molekülen, die bei der Subkultivierung der Mischbakterien und bei relevanten Stoffwechselwegen eine wichtige Rolle spielen und auf diese Weise Bereitstellung einer Orientierungshilfe bei der Offenlegung von Wechselwirkungsmechanismen der beiden Bakterien während der Subkultivierung und bei der Optimierung der Modifizierung von Bakterienstämmen sowie den Kulturbedingungen, mit der Zielsetzung, die Bildung von 2-Keto-L-Gluonsäure zu erhöhen.
Der relative Gehalt niedermolekularer Metabolite von Gluconobacter oxydans der 0., 50., 100. und 150. Generation während der Subkultivierung wurde als Probenmatrix zur Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten ( ) herangezogen; dabei zeigten sich im Punktdiagramm ( - ) deutlich 4 Klassen, in denen die 150. Generation sich hinsichtlich des Metabolitspektrums sichtlich unterschied von der 0., 50. oder 100. Generation. Die 0. Generation und die 50. Generation lagen hingegen relativ dicht beieinander, was darauf hindeutet, dass die sich im Laufe der Subkultivierung herausgebildeten Unterschiede nicht signifikant waren. Bei handelte es sich um ein Diagramm des relativen Gehalts der molekularen Marker von Gluconobacter oxydans, die zur Unterscheidung unterschiedlicher Subkultivierungszeiten herangezogen wurden, wobei der Gehalt von Hexadecansäure, Octadecansäure und Octadecansäure mit zunehmender Subkultivierungsdauer abfiel. Dies deutet darauf hin, dass während des Zellwachstums mehr Fettsäuren für die Bildung von Phospholipiden für die Zellmembran verbraucht wurden, so dass der Gehalt freier Fettsäuren nach der 100. Generation signifikant verringert war.
Der relative Gehalt niedermolekularer Metabolite von Bacillus megaterium in der 0., 50., 100. und 150. Generation während der Subkultivierung wurden als Probenmatrix zur Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten herangezogen ( ). Dabei zeigte sich im Punktdiagramm ( - ) deutlich ein signifikanter Unterschied im Metabolitspektrum von Bacillus megaterium während der unterschiedlichen Subkultivierungsstadien, welche offensichtlich in 4 Klassen unterteilt werden konnten. Bei handelte es sich um ein Diagramm, das die Veränderungen des relativen Gehalts niedermolekularer Metabolite von Bacillus megaterium zeigte, die zur Unterscheidung die verschiedenen Subkultivierungszeiten herangezogen wurden, wobei der Gehalt von Hexadecansäure und Octadecansäure mit zunehmender Subkultivierungsdauer signifikant abfiel. Dies deutet darauf hin, dass während des Zellwachstums mehr Fettsäuren für die Bildung von Phospholipiden zum Aufbau von Zellmembranen verbraucht wurden, so dass der Gehalt freier Fettsäuren signifikant verringert war. Darüber hinaus war der Gehalt vieler Aminosäuren, wie beispielsweise Prolin oder 4-Hydroxyprolin, signifikant reduziert und der Gehalt von beispielsweise 5-Oxoprolin oder Glutamin deutlich reduziert. Dies zeigt ebenfalls an, dass große Mengen Aminosäuren von Bacillus megaterium verbraucht wurden, um während der Subkultivierung das Wachstum aufrecht zu erhalten und die intrazellulären Proteine zu synthetisieren.
Der relative Gehalt niedermolekularer Moleküle der Zellen der Mischbakterien der 0., 50., 100. und 150. Generation während der Subkultivierung wurden bei der Durchführung einer Analyse der Hauptkomponenten als Probenmatrix herangezogen ( ). Dabei zeigte sich im Punktdiagramm ( - ), dass die Proben der 0., 50, 100. und 150. Generation der Mischbakterien sich offensichtlich voneinander unterschieden. Dies zeigte an, dass die während der Subkultivierung entstandenen Bakterienstämme sich infolge der Wechselwirkung der beiden Bakterien bei der Subkultivierung der Mischbakterien in signifikanter Weise von den Ausgangsstämmen unterschieden. Die 50. Generation lag dabei jedoch dicht bei der 100. Generation und konnte bei der ersten Hauptkomponenten nicht von dieser unterschieden werden. Bei handelte es sich um ein Diagramm, das die Tendenz der Veränderung des relativen Gehalts niedermolekularer Metabolite der Mischbakterien als Marker für die Unterscheidung verschiedener Subkultivierungszeiten zeigte. Von diesen Markern nahm der Gehalt vieler Aminosäuren, wie beispielsweise Prolin, Glycin, 4-Hydroxylprolin, 5-Oxoprolin und Glutamin, mit längerer Subkultivierungszeit ab. Insbesondere Prolin und 5-Oxoprolin wiesen bei den Mischbakterien der 150. Generation die niedrigsten Konzentrationen auf, so dass diese beiden Substanzen als wichtige Substanzen anzusehen sind, die die Bildung von 2-Keto-L-Gluonsäure bei der Fermentation der Mischbakterien beeinflussten. Diese Veränderungen zeigten, dass sich mit zunehmender Subkultivierungsdauer der Mischbakterien die Wechselwirkungen dieser beiden Bakterien harmonischer gestalteten, was die Erzeugung von Produkt erleichterte.
Beispiel 6-2 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Analyse von Veränderungen niedermolekularer Metabolite während der Subkultivierung von Vitamin-C-produzierenden Stämmen, die durch die folgenden Schritte beschrieben wird:
(1) Subkultivierung der Mischbakterien:
Feste Kultur:
Bereitstellen von 10 µl Gluconobacter oxydans, konserviert in einer 15% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen) und 10 µl Bacillus megaterium, konserviert in einer 15% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen), gelagert in Flüssigstickstoff, separates Beimpfen eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 28°C über einen Zeitraum von 48 h;
(ii) Anzuchtkultur:
separate Übertragung von in Schritt (1) (i) kultiviertem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in das Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 28°C über einen Zeitraum von 48 h bei 200 U/min zur Gewinnung eines flüssigen Anzuchtnährmedium mit Bacillus megaterium und eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Gluconobacter oxydans;
Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans, um eine Dichte von 2×10⁷ KBE/ml für Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10⁸ KBE/ml für Gluconobacter oxydans zu erzielen, Bebrüten bei einer Temperatur von 28°C bei 200 U/min, Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit einem Subkultivierungszyklus von 48 h und einem Volumenverhältnis von 1% zur Durchführung einer Subkultur mit einer Dauer von 100 Tagen zur Gewinnung von Zellen von Mischbakterien, der Festlegung von 2 Zeitpunkten der Probenentnahme in den Tagen 0-100 der Subkultur, und zwar jeweils einzeln an den Tagen 0, 50, 100 und 150;
(iii) Trennung und Reinigung:
Ausstreichen der gemischten Bakterien der in Schritt (1)(ii) gewonnen 3 Proben zur Durchführung der Auftrennung und Reinigung; im Anschluss daran separates Beimpfen eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 28°C über einen Zeitraum von 48 h; im Anschluss daran separates Übertragen in ein flüssiges Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 28°C über einen Zeitraum von 48 h bei 200 U/min zur Gewinnung eines flüssiges Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Gluconobacter oxydans; Konservieren in einer Glycerin-Wasser-Lösung in einer Volumenkonzentration von 15%;
(iv) Fermentation
separates Beimpfen von in Schritt (1)(iii) gewonnenem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans sowie der Mischbakterien dieser beiden Bakterien eines neuen flüssigen Anzuchtnährmediums, um eine Dichte von 2 × 10⁷ KBE/ml für das entstandene Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10⁸ KBE/ml für entstandene Gluconobacter oxydans zu erzielen, Bebrüten bei einer Temperatur von 28°C über einen Zeitraum von 15 h unter Schütteln bei 200 U/min;
(2) Vorbereitung von Proben und Nachweis intrazellulärer niedermolekularer Metabolite

(i) separate Entnahme von je 100 ml von 3 in Schritt (1)(iv) gewonnenen Zellsuspensionen, Zentrifugieren bei 1000 U/min über einen Zeitraum von jeweils 10 Minuten, Abschütten des Überstands, Zurückbehalten der Zellen, 1-faches Waschen der Zellen mit einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2, Zentrifugieren unter den gleichen Bedingungen, Abschütten des Überstands zur Gewinnung von Zellen;
(ii) Trocknen der in Schritt (2)(i) gewonnenen Zellen zur Gewinnung eines trockenen Pulvers durch Zermahlen mit Flüssigstickstoff, Gabe von je 30 mg getrocknetem Zellpulver in 3 verschiedene Zentrifugenröhrchen, anschließend Hinzufügen von 0,5 ml der Extraktionslösung, Hinzufügen von 30 µl von mit Deuterium markierter 0,020 mg/ml Bernsteinsäurelösung als interner Standardsubstanz, gründliches Mischen; Zentrifugieren bei 1000 U/min über einen Zeitraum von 10 Minuten, Entnehmen des Überstands und Gabe desselben in 3 neue Zentrifugenröhrchen, Gefriertrocknen;
(iii) Hinzufügen von jeweils 40 µl von 10 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid-Pyridin-Lösung zu den 3 in Schritt (2)(ii) vorbereiteten Zentrifugenröhrchen, Durchführen einer Oximierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 60 Minuten; im Anschluss daran Hinzufügen von 50 µl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid und Durchführen einer Silanisierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 30 Minuten; bei der Extraktionslösung handelt es sich um eine wässrige Methanollösung mit einer Volumenfraktion von 70%;
(iv) GC-TOF/MS-Nachweis: Laden von 1 µl der in Schritt 2 (iii) gewonnenen Probe in einen Gaschromatograph mit einer DB-5MS Chromatographiesäule mit einer Spezifikation von 30 m × 0,25 mm i.d., einer Temperatur am Injektionsport von 250°C, hochreinem Helium als Trägergas, einem konstanten Druck von 80 KPa, einem Teilungsverhältnis von 3:1, Temperaturprogrammierung des Säulenofens auf eine Initialtemperatur von 50°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 3 Minuten, stufenweiser Erhöhung auf eine endgültige Temperatur von 260°C in Schritten von 4°C/min, Beibehalten der Temperatur für einen Zeitraum von 10 Minuten, Verwenden einer Elektronen-Ionisierungsquelle, einer Temperatur der Quelle von 230°C, einer Detektorspannung von 2300 V, einer Ionisierungsspannung von 60 eV, einem Strom von 30 µA; einem massenspektrometrischen Nachweisbereich von 50-800 m/z; Heranziehen der NIST-Datenbank für den Nachweis niedermolekularer Metabolite unter Verwendung der Software Masslynx 4.1 für die Bearbeitung der massenspektrometrisch erhobenen Daten und Messungen des relativen Gehalt der Metabolite; Integration der chromatographischen Peak-Bereiche und der Vergleich der Peak-Bereiche mit dem internen Standard zur Ermittlung des relativen Gehalts niedermolekularer Metabolite;

(3) Analyse der Hauptkomponenten:

(i) Durchführen einer Skalierung der Daten zum relativen Gehalt der in Schritt (2)(iv) gewonnenen niedermolekularen Metabolite nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto;
(ii Durchführen einer Analyse der Hauptkomponenten anhand der Daten zur Vorbehandlung, unter Verwendung der Software SIMCA-P 11.5, um niedermolekulare Metabolite als Marker für die Unterscheidung von Vitamin C-produzierenden Bakterienstämmen bei verschiedenen Subkultivierungszeiten zu erhalten;

(4) Prozessanalyse
Erstellen eines Kurvendiagramms des Gehalts niedermolekularer Metabolite als Marker bei unterschiedlichen Subkultivierungszeiten, das Beobachten und die Analyse der variierenden Muster niedermolekularer Metabolite als Marker und der Nachweis der Veränderungen bei den intrazellulären niedermolekularen Metabolite als Marker während der Subkultivierung von Vitamin-C-produzierenden Bakterienstämmen.
Beispiel 6-3
Ein Verfahren zur Analyse von Veränderungen niedermolekularer Metabolite während der Subkultivierung von Vitamin-C-produzierenden Stämmen, die durch die folgenden Schritte beschrieben wird:
(1) Subkultivierung der Mischbakterien:
Feste Kultur:
Bereitstellen von 500 µl Gluconobacter oxydans, konserviert in einer 30% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen) und 500 µl Bacillus megaterium, konserviert in einer 30% Glycerin-Wasser-Lösung (% Volumen), gelagert in Flüssigstickstoff, separates Beimpfen eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 24 h;
(ii) Anzuchtkultur:
separate Übertragung von in Schritt (1)(i) kultiviertem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans in das Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 24 h bei 280 U/min zur Gewinnung eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Gluconobacter oxydans;
Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans, um eine Dichte von 2 × 10¹⁰ KBE/ml für Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10¹¹ KBE/ml für Gluconobacter oxydans zu erzielen, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C bei 280 U/min, Beimpfen eines neuen Anzuchtnährmediums mit einem Subkultivierungszyklus von 24 h und einem Volumenverhältnis von 10% zur Durchführung einer Subkultur mit einer Dauer von 150 Tagen zur Gewinnung von Zellen von Mischbakterien, der Festlegung von 4 Zeitpunkten der Probenentnahme in den Tagen 0-150 der Subkultur, und zwar jeweils einzeln an den Tagen 0, 50, 100 und 150;
(iii) Trennung und Reinigung:
Ausstreichen der Mischbakterien der in Schritt (1)(ii) gewonnen 4 Proben zur Durchführung der Trennung und Reinigung; im Anschluss daran separates Beimpfen eines festen Kulturmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 24 h; im Anschluss daran separates Übertragen in ein flüssiges Anzuchtnährmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 24 h bei 280 U/min zur Gewinnung eines flüssiges Anzuchtnährmediums mit Bacillus megaterium und eines flüssigen Anzuchtnährmediums mit Gluconobacter oxydans; Konservieren in einer Glycerin-Wasser-Lösung in einer Volumenkonzentration von 30%;
(iv) Fermentation
separates Beimpfen eines neuen flüssigen Anzuchtnährmediums mit in Schritt (1)(iii) gewonnenem Bacillus megaterium und Gluconobacter oxydans sowie mit den Mischbakterien dieser beiden Bakterien, um eine Dichte von 2 × 10¹⁰ KBE/ml für das entstandene Bacillus megaterium und eine Dichte von 2 × 10¹¹ KBE/ml für entstandene Gluconobacter oxydans zu erzielen, Bebrüten bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 10 h bei 280 U/min;
(2) Vorbereitung von Proben und Nachweis intrazellulärer niedermolekularer Metabolite

(i) separates Entnahmen von je 200 ml von 3 in Schritt (1)(iv) gewonnen Zellsuspensionen, Zentrifugieren bei 3000 U/min über einen Zeitraum von jeweils 3 Minuten, Abschütten des Überstands, Zurückbehalten der Zellen, 1-faches Waschen der Zellen mit einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4, Zentrifugieren unter den gleichen Bedingungen, Abschütten des Überstands zur Gewinnung von Zellen;
(ii) Trocknen der Schritt (2)(i) gewonnenen Zellen zur Gewinnung eines trockenen Pulvers durch Zermahlen mit Flüssigstickstoff, separates Entnehmen von je 60 mg trockenem Zellpulver und Gabe des Zellpulvers in 3 verschiedene Zentrifugenröhrchen, im Anschluss daran Hinzufügen von 1,5 ml der Extraktionslösung, Hinzufügen von 70 µl von mit Deuterium markierter 0,060 mg/ml Bernsteinsäurelösung als interner Standardsubstanz, gründliches Mischen; Zentrifugieren bei 3000 U/min über einen Zeitraum von 3 Minuten, Entnahmen des Überstands und der Gabe desselben in 3 neue Zentrifugenröhrchen, Gefriertrocknen;
(iii) Hinzufügen von jeweils 100 µl von 30 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid-Pyridin-Lösung zu den 3 in Schritt (2)(ii) vorbereiteten Zentrifugenröhrchen, Durchführen einer Oximierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 40°C über einen Zeitraum von 120 Minuten; im Anschluss daran Hinzufügen von 100 µl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid und Durchführen einer Silanisierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 40°C über einen Zeitraum von 60 Minuten; bei der Extraktionslösung handelt es sich um eine wässrige Methanollösung mit einer Volumenfraktion von 60%;
(iv) GC-TOF/MS-Nachweis: Laden von 1 µl der in Schritt 2 (iii) gewonnenen Probe in einen Gaschromatographen mit einer DB-5MS Chromatographiesäule, die eine Spezifikation von 30 m × 0,25 mm i.d. aufweist, einer Temperatur am Injektionsport von 280°C, hochreinem Helium als Trägergas, einem konstanten Druck von 100 KPa, einem Teilungsverhältnis von 20:1, Temperaturprogrammierung für den Säulenofen: Initialtemperatur 80°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 6 Minuten, Erhöhung auf eine endgültige Temperatur von 300°C in Schritten von 8°C/min, Halten der Temperatur für einen Zeitraum von 8 Minuten, Verwendung einer Elektronen-Ionisierungsquelle, einer Temperatur der Quelle von 260°C, einer Detektorspannung von 2700 V, einer Ionisierungsspannung von 80 eV, einem Strom von 50 µA; einer massenspektrometrischen Nachweisbereich von 50-800 m/z; Heranziehen der NIST-Datenbank für den Nachweis niedermolekularer Metabolite unter Verwendung der Software Masslynx 4.1 für die Bearbeitung der massenspektrometrisch erhobenen Daten zum relativen Gehalt der Metabolite; Integration der chromatographischen Peak-Bereiche und Vergleich der Peak-Bereiche mit dem internen Standard zur Ermittlung des relativen Gehalts niedermolekularer Metabolite;

(3) Analyse der Hauptkomponenten:

(i) Durchführen einer Skalierung der Daten zum relativen Gehalt der in Schritt (2)(iv) gewonnenen niedermolekularen Metabolite nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto;
(ii) Durchführen einer Analyse der Hauptkomponenten anhand der Daten zur Vorbehandlung, unter Verwendung der Software SIMCA-P 11.5, um niedermolekulare Metabolite als Marker für die Unterscheidung von Vitamin C-produzierenden Bakterienstämmen bei verschiedenen Subkultivierungszeiten zu erhalten;

(4) Prozessanalyse
Erstellen eines Kurvendiagramms des Gehalts niedermolekularer Metabolite als Marker bei unterschiedlichen Subkultivierungszeiten, das Beobachten und die Analyse der variierenden Muster der niedermolekularen Metabolite als Marker und der Nachweis der Veränderungen bei den intrazellulären niedermolekularen Metabolite als Marker während der Subkultivierung von Vitamin-C-produzierenden Bakterienstämmen.
Diese Tests bestätigten, dass die Beispiele 6-2 und 6-3 zu den gleichen Ergebnissen führten wie Beispiel 6-1.
Die Zusammensetzung der festen Kulturmedien und der flüssigen Anzuchtkulturmedien der vorliegenden Offenbarung wurden aus den in der Anmeldung des chinesischen Patents Nr. 201110314740.9 offenbarten Medien ausgewählt, wie beispielsweise:
Festes Kulturmedium: Einwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rinderextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 20 g Agar, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 6,8, Sterilisieren bei einer Temperatur von 121°C über einen Zeitraum von 20 Minuten zur Gewinnung eines festen Kulturmediums.
Anzuchtnährmedium: Einwiegen von 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rinderextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 6,8, Sterilisieren bei einer Temperatur von 121°C über einen Zeitraum von 20 Minuten zur Gewinnung eines Anzuchtnährmediums.
Bacillus megaterium CGMCC Nr. 1.459 und Gluconobacter oxydans CGMCC Nr. 1.110 werden in der vorliegenden Offenbarung lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung herangezogen, nicht, um die vorliegende Offenbarung einzuschränken Experimente haben bestätigt, dass auch andere Stämme von Bacillus megaterium oder Gluconobacter oxydans im Sinne dieser Offenbarung verwendet werden können.
Beispiel 7 (nicht erfindungsgemäß)
Die Verwendung von Gluconobacter oxydans, der einen Vektor enthält, welcher für Sorbosone-Dehydrogenase codiert, mit der Zielsetzung, die Fähigkeit von Mischbakterien zur Fermentation bei der Produktion von 2-Keto-L-Gluonsäure zu erhöhen, wie durch die folgenden Schritte beschrieben:
(1) Amplifikation des Sorbosone-Dehydrogenase-Gens in vitro
Extrahierung des Genoms von Gluconobacter oxydans mittels eines Kits zur Extrahierung des Genoms von Bakterien, Entnahme von 1 µl der Genomlösung, 4 µl 5 × FastPfu-Puffer, 2 µl 20 mM dNTP, 0,4 µl 20 nM-Primer 1, 0,4 µl 20 nM-Primer 2, 11,8 µl sterilisiertes Wasser, 0,4 µl FastPfu-Enzym, gründliches Mischen in einem PCR-Röhrchen; Platzierung des PCR-Röhrchens in einem PCR-Gerät zur Durchführung von Amplifikationszyklen, Programmierung der Amplifikation: 95°C 2 Min.; 95°C 20 Sek., 55°C 35 Sek., 72°C 2 Min., insgesamt 25 Zyklen; 72°C 5 Min.; 4°C 30 Min., Unterziehung des PCR-Produkts einer Agarose-Gel-Elektrophorese, Abschneiden des Streifens des PCR-Produkts und Reinigung des Produkts der PCR-Amplifikation mittels eines Agarose-Gel-Wiedergewinnungs-Kits;

Primer 1 hatte die Sequenz: 5'- CCCAAGCTTGACTGGCAGCAGCGCAAC-3'
Primer 2 hatte die Sequenz: 5'- CGCGGATCCCCGTGATAGCGGCACATGTC-3'

(2) Konstruktion des genetischen Vektors für die Codierung der Sorbosone-Dehydrogenase:
Entnahme von 8 µl der in Schritt (1) gewonnenen Lösung mit dem PCR-Amplifikationsprodukt, gründliches Mischen mit 1 µl 10 × Verdaupuffer, 0,5 µl von Enzym Hindlll, 0,5 µl von Enzym BamHI, Durchführen eines Enzymverdaus bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 2 h; Unterziehen des Reaktionsprodukts einer Agarose-Gel-Elektrophorese, Abschneiden des Streifens für das Enzymverdauprodukt, Reinigen des PCR-Produkts des Enzymverdaus mit einem Agarose-Gel-Wiedergewinnungs-Kits. Entnahme von 5,5 µl des PCR-Produkts des Enzymverdaus, 3 µl des Enzymverdau-Trägerprodukts, 1 µl 10 × Ligasepuffer, 0,5 µl DNA-Ligase, gründliches Mischen, Durchführen einer Ligationsreaktion bei einer Temperatur von 22°C über einen Zeitraum von 30 Minuten. Überführen des Ligationsprodukts in E. coli DH5a unter Anwendung einer chemischen Überführungsmethode, Beschichten eines festen, antibiotikahaltigen LB-Nährmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 12 h. Bebrüten der kultivierten Einzelkolonie in einem flüssigen LB-Nährmedium bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 12 h, Extrahierung der Plasmide mittels eines Plasmid-Mini-Kits zur Gewinnung des die Sorbosone-Dehydrogenase codierenden Vektors.
Überführen des Vektors in die Sorbosone-Dehydrogenase codierendes Gluconobacter oxydans
Beschichten des festen Kulturmediums mit Gluconobacter oxydans, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 48 h; Waschen des Stammes mit 2 ml sterilisiertem Wasser, Eintauchen in ein Eisbad mit einer Temperatur von 4°C über einen Zeitraum von 10 Minuten, Zentrifugieren bei 4000 U/min über einen Zeitraum von 5 Minuten, anschließend Waschen der Zellen, 1-faches Waschen mit vorgekühltem sterilisierten Wasser, 2-faches Waschen mit 10% Glycerin, Resuspendieren mit 100 µl 10% Glycerin; gründliches Mischen mit 10 µl der nach Schritt (2) gewonnenen Wasserlösung mit dem die Sorbosone-Dehydrogenase codierenden Vektor und Platzieren in einem Elektrotransformationsbehälter, Eintauchen in ein Eisbad über einen Zeitraum von 5 Minuten, Platzieren in einer Elektrotransformationsbehälter in einem Elektrotransformationsgerät und Aussetzen eines Elektroschocks von 1800 V; Mischen des Schockprodukts mit 900 µl des Anzuchtmediums, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C und bei 140 U/min über einen Zeitraum von 2 h, Beschichten eines festen Nährmediums mit der Kultur, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 4 Tagen, Überführen der gewonnenen Einzelkolonie in das Anzuchtmedium, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C und bei 250 U/min zur Gewinnung von das den Sorbosone-Dehydrogenase codierenden Vektor enthaltenden Gluconobacter oxydans.
Das feste Kulturmedium setzte sich zusammen aus: 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rinderextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 20 g Agar, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 6,8, Sterilisieren bei einer Temperatur von 121°C über einen Zeitraum von 20 Minuten.
Das Anzuchtnährmedium setzte sich zusammen aus: 20 g L-Sorbose, 3 g Maisquellwasser, 3 g Rinderextrakt, 3 g Hefeextraktpulver, 1 g Harnstoff, 10 g Pepton, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 6,8, Sterilisieren bei einer Temperatur von 121°C über einen Zeitraum von 20 Minuten.
(4) Fermentation mit Mischbakterien
Beimpfen eines Fermentationskulturmediums mit dem in Schritt (3) gewonnenen Gluconobacter oxydans, das den für die Sorbosone-Dehydrogenase codierenden Vektor enthält, und Bacillus megaterium, um eine Dichte von 4 × 10⁸ KBE/ml für Gluconobacter oxydans mit dem die Sorbosone-Dehydrogenase codierenden Vektor, und eine Dichte von 4 × 10⁸ KBE/ml für Bacillus megaterium zu erzielen, Bebrüten bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 120 h bei 250 U/min zur Gewinnung von 2-Keto-L-Gluonsäure.
Das Fermentationskulturmedium wurde folgendermaßen vorbereitet: Einwiegen von 80 g L-Sorbose, 20 g Maisquellwasser, 12 g Harnstoff, 10 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄, 1 g CaCO₃, Auffüllen auf 1 l mit Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 7,0, Sterilisieren bei einer Temperatur von 121°C über einen Zeitraum von 20 Minuten.
Messung des Gehalts von 2-Keto-L-Gluonsäure und L-Sorbose:
Es wurde die Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) verwendet.
Vorbereiten der Proben: Entnahme von je 1 ml der einzelnen Fermentationslösungen, die verschieden langen Fermentierungs- und Kultivierungsphasen unterzogen wurden, Gabe dieser Lösungen in je ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, Zentrifugieren bei 10000 U/min über einen Zeitraum von 3 Minuten, Entnahme von 100 µl des Überstands und Gabe desselben in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 900 µl der mobilen Phase (5 mM H₂SO₄), um 10-fach verdünnte Proben zu erhalten, gründliches Mischen, Filtern mittels eines 0,22 µm Cellulose-Millipore-Filter, um die zu testenden Proben zu erhalten.
Bedingungen für die Hochdruckflüssigchromatographie: Chromatographiesäule: Bio-Rad HPX-87H, mobile Phase: 5 mM H₂SO₄, Fließgeschwindigkeit: 0,6 ml/min, Säulentemperatur: 65°C, Differentialdetektor.
Die Testergebnisse aus Beispiel 7-1 sind in dargestellt.
Legenden: ◇: Fermentation mit Mischbakterien von Gluconobacter oxydans- und Bacillus megaterium-Ausgangsstämme; △: Fermentation mit Mischbakterien von die Sorbosone-Dehydrogenase codierenden Vektor enthaltenden Gluconobacter oxydans und Bacillus megaterium.
Die Fermentation der Mischbakterien der Gluconobacter oxydans- und Bacillus megaterium-Ausgangsstämme durch Anwendung der Fermentationsbedingungen nach Schritt (2) aus Beispiel 7-1 konnte für 2-Keto-L-Gluonsäure eine Produktionsrate von 87% erzielen; die Fermentation des Bakteriengemischs aus Gluconobacter oxydans mit dem für Sorbonose-Dehydrogenase codierenden Vektor, gewonnen nach dem Verfahren aus Beispiel 7-1, und aus Bacillus megaterium konnte eine Produktionsrate der 2-Keto-L-Gluonsäure von 98% erzielen; die Produktionsrate der 2-Keto-L-Gluonsäure erhöhte sich um 12,6%.
Beispiel 8-1 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zum Nachweis von Veränderungen der intrazellulären Proteine bei der Verwendung von auf Gluconobacter oxydans einwirkendem Glutathion, beschrieben durch die folgenden Schritte:
(1) Bestimmung der intrazellulärer Proteine:
Gewinnung und Durchtränken der Zellen:
Entnehmen von 3 Teilen Gluconobacter oxydans und separates Beimpfen eines Fermentationsnährmediums A bei einem Volumenverhältnis von 8%, Entnehmen weiterer 3 Teile von Gluconobacter oxydans und separates Beimpfen eines Fermentationsnährmediums B bei einem Volumenverhältnis von 8%, Kultivieren und Fermentieren zweier unterschiedlich beimpfter Nährmedien bei einer Temperatur 28°C bei 200 U/min, Entnahmen von Proben aus der fermentierten Flüssigkeit nach 1 h und nach 15 h als den Zeitpunkten der Probenentnahme, Zentrifugieren bei einer Temperatur von 4°C bei 4000 U/min, Auffangen der Zellen der unteren Schicht, Waschen mit einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2, sofortiges Eintauchen der Zellen in flüssigen Stickstoff zur Beendigung der Stoffwechselreaktion; Aufbrechen der Zellen mittels Zermahlen mit Flüssigstickstoff, um 3 Teile mit durchtränkten, aufgebrochenen Zellen aus Nährmedium A nach einer Fermentationsdauer von 1 h, 3 Teilen mit durchtränkten, aufgebrochen Zellen aus Nährmedium A nach einer Fermentationsdauer von 15 h, 3 Teile mit durchtränkten, aufgebrochenen Zellen aus Nährmedium B nach einer Fermentationsdauer von 1 h und 3 Teilen mit durchtränkten, aufgebrochenen Zellen aus Nährmedium B nach einer Fermentationsdauer von 15 h Stunden zu gewinnen;
das Fermentationsnährmedium A setzte sich zusammen aus:
80 g·L-1 Sorbose, 20 g·L-1 Maisquellwasser, 1 g·L-1 KH₂PO₄, 0,2 g·L-1 MgSO₄, und 12 g·L-1 Harnstoff, bei dem Rest handelt es sich um Wasser;
das Fermentationsnährmedium B setzte sich zusammen aus: 80 g·L-1 Sorbose, 20 g‧L-1 Maisquellwasser, 1 g·L-1 KH₂PO₄, 0,2 g·L-1 MgSO₄, und 12 g·L-1 Harnstoff, 0,8~1,5 mg·ml-1 Glutathion, bei dem Rest handelt es sich um Wasser;
(ii) Extrahierung der intrazellulären Proteine:
Entnehmen der in Schritt (i) aufgebrochenen Zellen, Gabe der einzelnen Teile in einer Menge von je 100 mg in ein Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 0,5 ml der Zelllyselösung in die einzelnen Zentrifugenröhrchen, gründliches Mischen, intermittierende Beschallung mit Ultraschall auf Eis über einen Zeitraum von 20 Sek.; Hinzufügen von 5 µl einer Lösung mit einer DNase I-/RNase A-Enzymmischung in einem Massenverhältnis von 2:1, gründliches Mischen, Stehenlassen bei einer Temperatur von 4°C über einen Zeitraum von 10 Minuten; Hinzufügen von 5 µl einer 80 mM Phenylmethylsulfonylfluorid-Isopropanol-Lösung, Stehenlassen bei einer Temperatur von 4°C über einen Zeitraum von 1 h; Zentrifugieren bei 15000 U/min über einen Zeitraum von 25 Minuten; Auffangen des Überstands zur Gewinnung einer Proteinlösung, in welcher die folgende Zelllyselösung enthalten ist: 8 mol.L-1 Harnstoff, 3-[(3-cholamidopropyl)-diethylamino]-Propansulfonsäure in einer Massenkonzentration von 4%, 40 mM Tris, aufgefüllt mit Wasser;
(iii) Messung der Proteinkonzentrationen
unter Verwendung eines Bradford-Kits, Hinzufügen von Rinderserumalbumin zu einer Coomassie Brilliant Blue G-250-Lösung, und zwar von einer niedrigen Konzentration zu einer hohen Konzentration, Messen der Absorptionswerte bei 595 nm der in Schritt (ii) gewonnen Proteinlösungen, Erstellen der Standardkurve; Messen der Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen;
(iv) Präzipitation der Proteine:
separate Entnahme der Proteinlösungen, die 50 µg des in Schritt (iii) gewonnenen Proteins enthalten, Hinzufügen von Aceton mit einer Temperatur von -20°C in einem 4-fachen Volumen zu jeder Lösung, Präzipitieren über einen Zeitraum von 12 h; Zentrifugieren, Abschütten des Überstands, Waschen des Präzipitats mit einer wässrigen Acetonlösung mit einer Temperatur von -20°C und einer Volumenkonzentration von 70%; Gefriertrocknen für die Ad-hoc-Verwendung; Lagerung bei -80°C;
Reduktion und Enzymolyse der Proteine
separates Hinzufügen zu jedem einzelnen der in Schritt (iv) gewonnenen Trockenproteinpulver von je 10 µl einer 40 mM wässrigen Triethylammoniumbicarbonatlösung zur Auflösung der Proteine;
Hinzufügen von 1 µl Tris-(2-carboxylethyl)-phosphin, Durchführen einer Reduktionsreaktion bei jedem Protein bei einer Temperatur von 50°C über einen Zeitraum von 1 h, im Anschluss daran die Hinzufügen von 1 µl Methylthiosulfonsäuremethylester, reagieren lassen über einen Zeitraum von 10 Minuten, um die Reduktionsreaktion zu beenden;
Hinzufügen von 30 µl wässriger Trypsinlösung in einer Konzentration von 0,2 µg/µl zu der oben beschriebenen Lösung, Durchführen einer Proteolyse bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 12 h;
(vi) Markieren der Proteine
separates Hinzufügen des Markierungsreagenz iTRAQ zu jeder einzelnen der in Schritt (v) gewonnen Proteolyselösungen, aufgelöst in 60 µ-80 µl Ethanol, reagieren lassen bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 1 h;
(vii) Mischen der Lösungen
Mischen der in Schritt (vi) gewonnenen Lösungen, um 3 Lösungsmischungen zu erhalten, so dass jede Lösungsmischung sich aus Folgendem zusammensetzt: die markierten Proteine, die durch Fermentation über einen Zeitraum von 1 h in Nährmedium A gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; die markierten Proteine, die durch Fermentation über einen Zeitraum von 15 h in Nährmedium A gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; die markierten Proteine, die durch Fermentation über einen Zeitraum von 1 h in Nährmedium B gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; und die markierten Proteine, die durch Fermentation über einen Zeitraum von 15 h in Nährmedium B gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; anschließende Lagerung bei -20°C;
(viii) Identifizierung der differentiell exprimierten Proteine
Unterziehung der in Schritt (vii) gewonnen Lösungsmischung einer Identifizierung mittels Q-Tof-Massenspektrometrie zur Erstellung des Proteomprofils, welches die differentiell exprimierten Proteine der Proben der gemischten Gruppen auf dem Wege der Quantifizierung ermittelt;
(2) Analyse der Hauptkomponenten;
Standardisierung der in Schritt (1)(viii) gewonnenen Daten unter Verwendung der Software Matlab, im Anschluss daran die Unterziehung der Hauptkomponenten einer Analyse mit dem Ziel, die Datenklassen mit variierenden Mustern zu erhalten und differentielle Proteinkandidaten zu ermitteln;
(3) Prozessanalyse
Erstellen eines Kurvendiagramms zum Gehalt der in Schritt 2 gewonnenen differentiellen Proteinkandidaten gegen die Zeit, das Beobachten und die Analyse der variierenden Muster dieser Proteine sowie anschließend die Identifizierung der Effekte von Glutathion bei der Steigerung der von Gluconobacter oxydans produzierten 2-Keto-L-Gluonsäure.

In Tabelle 1 wurden die intrazellulären Proteine aufgeführt, die während der Fermentation von Gluconobacter oxydans nach Zugabe von Glutathion gebildet wurden. Tabelle 8-1: Intrazelluläre Proteine von Gluconobacter oxydans

Glutamatsynthase [NADPH], langkettig	Hydroxyacylglutathion-Hydrolase
Glutamyl-tRNA(Gln)- und/oder Aspartyl-tRNA(Asn)-Amidotransferase, Untereinheit A	ATP-Synthase F1, Untereinheit delta
Protein der D-Alanyl-D-Alanin-Carboxypeptidase-Familie	ATP-Synthase F1, Untereinheit alpha
bakterielles extrazelluläres Solut-bindendes Protein, Protein der Familie 5 der Middle-Familie	ATP-Synthase F1, Untereinheit beta
nicht charakterisierter ABC-Transporter des ATP-bindenden Proteins yejF	ATP-Synthase F1, Untereinheit epsilon
Sulfat-Adenylyltransferase, Untereinheit 2 (Sulfat-Adenylattransferase) (SAT) (ATP-Sulfurylase, kleine Untereinheit)	10 kDa Chaperonin 1 (Protein Cpn10 1) (groES Protein 1)
putative N-Acetylmannosamin-6-P-Epimerase	Chaperonin GroL
Coenzym PQQ, Biosyntheseprotein C	Thioredoxindisulfid-Reduktase
Glutamintransport-ATP-bindendes Protein glnQ	Bacterioferritin
Ribosomales Protein L17	Protein der ATP-Synthase B/B' CF(0)-Familie
DNA-abhängige RNA-Polymerase, Untereinheit alpha	Ketosäure-Reduktoisomerase
30 S Ribosomales Protein S11 (BS11)	Protein der Familie der yqey-ähnlichen Proteine
30 S Ribosomal Protein S13	O-Succinylhomoserin-Sulfhydrylase
Ribosomales Protein L15	bakterielles extrazelluläres Solut-bindendes Protein, Protein der Familie 5 der Middle-Familie
Ribosomales Protein L30	Grundlegendes Protein der Familie der Membranproteine
Ribosomales Protein S5	Delta-Am inolävolinsäure-Dehydratase (Porphobilinogensynthase) (ALAD) (ALADH)
Ribosomales Protein L18	Beta-Ketoacyl-Synthase, Protein der C-terminalen Domäne
50 S Ribosomales Protein L6 (BL10)	Protein der Familie der invasionsassoziierten Locus B (lalB)-Proteine
Ribosomales Protein, Protein der S8-Familie	Einsträngige DNA bindendes Protein (SSB) (helixdestabilisierendes Protein)
2-deoxy-D-gluconate 3-dehydrogenase	Protein der der His-Kinase A (Phosphoakzeptor)-Domäne
Ribosomales Protein, Protein der S14p/S29e-Familie	Enoyl-[Acyl-Trägerprotein]-Reduktase [NADH] 1 (NADH-abhängige Enoyl-ACP-Reduktase 1)
50 S Ribosomales Protein L5 (BL6)	Kälteschockprotein cspB (bedeutendes Kälteschockprotein)
Ribosomales Protein L24	Sorbose/Sorbosone-Dehydrogenase
Ribosomales Protein, Protein der S17-Familie	Trigger-Faktor
Ribosomales Protein L29	Ribosomales Protein L9
Ribosomales Protein S3	Ribosomales Protein S18
Ribosomales Protein L22	Ribosomales Protein S6
Ribosomales Protein S19	Acyl-Trägerprotein
Ribosomales Protein L2	Pyruvat-Dehydrogenase, Komponente E1, Untereinheit beta
Ribosomales Protein, Protein der L23-Familie	Protein der deoC/LacD-Familie der Aldolase-Familie
50 S Ribosomales Protein L4 (BL4)	Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Osomerase vom Cyclophilin-Typ/Protein der CLD-Familie
Ribosomales Protein, Protein der L3-Familie	Dihydrolipoyllysinrest-Succinyltransferase, Komponente E2 des Oxoglutarat-Dehydrogenase-(succinyltransferierenden)-Komplexes
Ribosomales Protein, S10	Oxoglutarat-Dehydrogenase (succinyltransferierend), Komponenten E1
Translationselongationsfaktor Tu	Glyoxalase/Bleomycinresistenzprotein/Protein der Dioxygenase-Superfamilie
Translationselongationsfaktor G	Protein der Familie der Peptidasen M20/M25/M40
Ribosomales Protein S7	Succinyl-CoA-Synthetase, beta-Kette (SCS-beta)
DNA-abhängige RNA-Polymerase, Untereinheit beta	Malat-Dehydrogenase, NAD-abhängig
DNA-abhängige RNA-Polymerase, Untereinheit beta	Succinat-Sem ialdehyd-Dehydrogenase \|NADP+] (SSDH)
Ribosomales Protein L7/L12	Succinat-Dehydrogenase, Eisen-Schwefel-Untereinheit
Ribosomales Protein L1	Protein der Familie der Nitroreduktasen
Ribosomales Protein L11	Superoxiddismutase [Fe]
Transkriptions-Terminations- /Antiterminationsfaktor NusG	Sorbose-/Sorbosone-Dehydrogenase
Protein der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase	Präprotein-Translokase, Untereinheit YajC
Ribonuclease R	Proteinexportierendes Membranprotein SecF
2,3,4,5-Tetrahydropyridin-2,6-Dicarboxylat-N-Succinyltransferase	Aconitat-Hydratase 1
Hypothetisches Protein	Integration Host Faktor, Untereinheit alpha
Protein der Cytochrom-c-Familie	Ribosomales Protein L32
Sorbose-/Sorbosone-Dehydrogenase	Orotatphosphoribosyltransferase (OPRT) (OPRTase)
ABC-Transporter, periplasmatisches Bindeprotein	ATP-abhängige Protease La
Aminopeptidase 2 (Aminopeptidase II) (AP-II)	Ribosomales Protein S2
Sorbose-/Sorbosone-Dehydrogenase	Translationselongationsfaktor Ts
Protein der YCII-bezogenen Proteindomäne	ABC-Transporter, periplasmatisches Bindeprotein
Schnittstellenprotein der ribosomalen Untereinheit	nicht charakterisiertes Protein der Familie der (UPF0051)-Proteinfamilie
Bifunktionalles Protein ArgJ der Arginin-Biosynthese	FeS assembly ATPase SufC
Protein der M3-Familie der PeptidaseFamilie	GTP-bindendes Protein TypA/BipA
Cobalaminunabhängige Synthase, katalytisches Proteindomänen-Protein	Alanyl-tRNA-Synthetase
Translationsinitiationsfaktor IF-2	Protein RecA
Protein der Familie der zinkbindenden Dehydrogenase	bakterielles extrazelluläres Solut-bindendes Protein, Protein der Familie 5 der Middle-Familie
Argininosuccinat-Synthas	Transkriptionsterminationsfaktor Rho
Transkriptionsterminationsfaktor Rho	bakterielles extrazelluläres Solut-bindendes Protein, Protein der Familie 5 der Middle-Familie
Protein exportierendes Chaperon SecB	nicht charakterisiertes Protein der Familie der mit Peroxidase verwandten Enzyme
Protein der Tim44-ähnlichen Proteindomäne	bakterielles extrazelluläres Solut-bindendes Protein, Protein der Familie 5 der Middle-Familie
Thioredoxin	Lipoprotein der NLPA-Familie
doppelstrangbruchreparierendes Protein AddB	bakterielles extrazelluläres Solut-bindendes Protein, Protein der Familie 5 der Middle-Familie
Adenosylhomocysteinase	Protein des glycinspaltenden Systems H
Kette D, Kristallstruktur eines nicht charakterisierten Proteins	6-Phosphogluconolactonase
verzweigtkettige Aminosäure-Am inotransferase	Protein der Familie der Nukleosiddiphosphatkinasen
Hypothetisches Protein	Protein der Familie der Cytosol-Aminopeptidasen, katalysierende Domäne
Response-Regulator	Ribosomales Protein der Familie der S9/S16-Familie
nicht charakterisiertes proteinähnliches Protein	Ribosomales Protein L13
Thiamin/Thiaminpyrophosphat-ABC-Transporter, Thiam in/Thiaminpyrophospatbindendes Protein	NAD
Chorismatsynthase	NAD(P)(+)-Transhydrogenase (AB-spezifisch), Untereinheit alpha
DNA-bindendes Protein HU 1 (DNA-bindendes Protein II) (HB)	Kobaltchelatase, Untereinheit COB S
Chaperon-Protein DnaJ	Protein der Familie der NADPH-abhängigen FMN-Reduktasen
Chaperon-Protein DnaK	Acetyl-CoA-Carboxylase, Biotin-Carboxyl-Trägerprotein
Ribosomales Protein S15	Acetyl-CoA-Carboxylase, Biotin-Carboxylase
Protein S1 der RNA-bindenden Domäne	ATP-abhängige Clp-Protease, ATP-bindende Untereinheit Clp X
Hypothetisches Protein	Protein der Familie der Clp-Proteasen
D-isomerspezifische 2-Hydroxysäure-Dehydrogenase, Protein der NAD-bindenden Domäne	konserviertes hypothetisches Protein
NAD(P)H:Chinon-Oxidoreduktase	Transaldolase, putativ
Phosphoserin-Aminotransferase	DNA-Topoisomerase l
Phosphoglycerat-Dehydrogenase	Protein der Familie der Histidinkinase, DNA-Gyrase B und HSP90-ähnlichen ATPase
ATP-abhängiges Chaperon-Protein ClpB	Peptidase T
Resolvase, Protein der N-terminalen Domäne	Protein der flavinreduktaseähnlichen Domäne
Antirestriktionsprotein	Glucan-Biosynthese-Protein G
nicht charakterisierter ABC-Transporter des ATP-bindenden Proteins yejF	Sorbose-/Sorbosone-Dehydrogenase
AGR_L_2804p, Nitrilotriacetatemonooxygenase-Komponente-A-Homolog ytnJ - Bacillus subtilis	konserviertes hypothetisches Protein
Protein der YKOF-verwandten Familie	oppF
Glutathion-S-Transferase, Protein der C-terminalen Domäne	bakterielles extrazelluläres Solut-bindendes Protein, Protein der Familie 5 der Middle-Familie
Protein der Familie der Komponente der inneren Membran des bindeproteinabhängigen Transportsystems	Protein der Familie der H-NS-Histone
Glutathion-Synthase	Ribosomales Protein S21
Acetyl-CoA-Carboxylase, Carboxyl-Transferase, Untereinheit beta	Protein der Familie der N6-DNA-Methylasen
Protein der Familie der ompA	Ribosomales Protein L27
Stickstoffregulierendes Protein P-II 1	Ribosomales Protein L21
Dihydrodipicolinat-Synthase	langes, leitendes mechanosensitives Kanalprotein
Protein der Familie der Aldo-Keto-Reduktasen	konserviertes hypothetisches Protein
DNA-abhängige RNA-Polymerase, Untereinheit omega	Phenylalanyl-tRNA-Synthetase, Untereinheit beta
Protein der Familie der Aldo-Keto-Reduktasen	Pyruvatcarboxylase
Protein RibD der Riboflavin-Biosynthese	Phenylalanyl-tRNA-Synthetase, Untereinheit alpha
6,7-Dimethyl-8-Ribityllumazinsynthase	konserviertes hypothetisches Protein
Protein der Familie der Aldo-Keto-Reduktasen	Ribosomales Protein L20
Protein der periplasmatischen Bindeproteine und der zuckerbindenden Domäne der Lacl-Familie	Protein der Hsp20/Alpha-Crystallin-Familie
putative Nicht-Häm-Chlorperoxidase (Chloridperoxidase)	Phosphat-ABC-Transporter, ATP-bindendes Protein
ATPase	Calciumbindende Region, Hämolysintyp
Carbamoylphosphat-Synthase, langkettig (Carbamoylphosphat-Synthetase, Ammoniakkette)	Protein der Familie der Aminotransferasen der Klasse IV
Ribosomales Protein S1	Translationsinitiationsfaktor IF-1
Integration Host Factor, Untereinheit beta	Carboxynorsperm idin-Decarboxylase
Ribosomales Protein L25, Ctc-förmig	Phosphopyruvathydratase
L-Lactat-Dehydrogenase [Cytochrom]	N-Acetyl-Gamma-Glutamyl-Phosphat-Reduktase
Membrangebundene Aldehyd-Dehydrogenase [Pyrrolochinolinchinon] (ALDH)	Phosphoribosylformylglycinamidin-Synthase II
Glutamin-Synthetase, Protein der katalysierenden Domäne	Transketolase
Isochinolin 1 -Oxidoreduktase, Untereinheit alpha	Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Typ I
Adenylosuccinat-Synthetase	Tellurit-Resistenz-Protein
Modulatorprotein der DNA-Gyrase-Familie	Protein ToIR
Cytochrom-c-Oxidase, Untereinheit II	Protein der Familie der calcineuriähnlichen Phosphoesterasen
Protein der Hydantoinase- /Oxoprolinase-Familie	Serin-Hydroxymethyltransferase (Serin-Methylase)(SHMT)
Threonyl-tRNA-Synthetase	Ribosomales Protein L28
mgpS	Protein der csbD-ähnlichen Familie
hflC-Protein	Glutathion-S-Transferase, Protein der C-terminalen Domäne
Glutathion-S-Transferase, Protein der C-terminalen Domäne	Protein der Familie der NADPH-abhängigen FMN-Reduktasen
28 kDa-Protein der immunreaktiven äußeren Membran	Stickstoffregulierendes Protein P-II (PII signaltransduzierendes Protein)
6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, decarboxylierend	Glutamin-Synthetase, Typ I
Ribosomales Protein L31	Asparatkinase, monofunkionelle Klasse
Prolyl-tRNA-Synthetase	Katalase-Peroxidase-Enzym HPI
Ribosomales Protein L19	metE
Hypothetisches Protein	bakterielles extrazelluläres Solut-bindendes Protein, Protein der Familie 5 der Middle-Familie
Glutamyl-tRNA-Synthetase	Im idazol-Glycerinphosphat-Dehydratase (IGPD)
Kälteschockprotein der DNA-bindenden Domäne	konserviertes hypothetisches Protein
Lysyl-tRNA-Synthetase	Protein der Familie der Insulinasen (Peptidasefamilie M16)
Urease, Untereinheit alpha	Protein der AhpC/TSA-Familie
Ribosomales Protein S16	Uroporphyrinogen-Decarboxylase
akzessorisches Protein der Urease UreG	Ribosomales Protein S4
Putatives Lipoprotein

Wie in veranschaulicht, unterschied sich die Exprimierung von Proteinen nach Zugabe von Glutathion zu Gluconobacter oxydans über einen Zeitraum von 15 h in signifikanter Weise von der leeren Kontrolle. Durch die Analyse spezifischer Unterschiede konnte eine Reihe von Biomarkern identifiziert werden, wie beispielsweise Thiaminpyrophosphat/Thiamin-Transportprotein (thiB), Thiamin-Transportprotein (TkoF) oder Oligopeptid-Transportprotein (bakterielles extrazelluläres Bindeprotein, Familie 5). Bei Glutathion handelt es sich um ein Tripeptid und um einen Thioalkohol, der in höchsten Konzentrationen im Körper von Mikroorganismen vorlag und die Zellen über Oligopeptid-Transportwege eindringen konnte. Die Umwandlung der oxidierten bzw. reduzierten Formen des Glutathions spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Redoxstatus von Mikroorganismen. Diese Umwandlung erfordert die Beteiligung von NADPH. Die Steigerung des Pentose-Phosphat-Weges könnte die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts des Redoxstatus von Gluconobacter oxydans indirekt fördern und so ein besseres Milieu für das Wachstum und die Säureproduktion bieten. Thiaminpyrophosphat ist ein wichtiges Coenzym für die Pyruvat-Dehydrogenase, für die Ketoglutarat-Dehydrogenase sowie für den Pentose-Phosphat-Weg im Tricarbonsäurezyklus und spielt eine wichtige Rolle beim zentralen Kohlenstoffwechsel. Gemäß der Analyse der Hauptkomponenten kam es nach Zugabe von Glutathion bei den beiden Proteinen, die für den Transport von Thiamin verantwortlich sind, zu einer signifikante Aufregulierung; dies zeigte an, dass die Zugabe von Glutathion die Kapazität der Zellen für den Thiamintransport in signifikanter Weise verbessern kann. Wie in veranschaulicht, nahm die quantitative Exprimierung der beiden Thiamin-Transportproteine sowie die quantitative Exprimierung der Pyruvat-Dehydrogenase, der Ketoglutarat-Dehydrogenase und der Transketolase 15 h nach Zugabe von Glutathion signifikant zu. Die quantitative Analyse der nachgewiesenen Proteine ergab zudem, dass nach Zugabe von Glutathion über einen Zeitraum von 15 h die quantitative Exprimierung wichtiger Enzyme im Tricarbonsäurezyklus und im Pentose-Phosphat-Weg von Gluconobacter oxydans aufreguliert war (vgl. ), was mit einer Verbesserung des Thiaminpyrophosphat-Transports zusammenhängen könnte. Diese zeigten, dass Gluconobacter oxydans einen Defekt oder eine Defizienz im Hinblick auf die Synthese von Thiamin oder Thiaminpyrophosphat aufweisen könnte; von daher könnte diese Beobachtung den Ausgangspunkt für eine molekularbiologische Modifizierung darstellen, um diesen Defekt zu beheben.
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass Glutathion wichtige Effekte auf das Wachstum und die Produktion von 2-Keto-L-Gluonsäure bei Gluconobacter oxydans hat. Mit Blick auf die Veränderungen der Proteine, der Wachstumskurven und der Ergebnisse bei der Säureproduktion lässt sich erkennen, dass Glutathion sich vorteilhaft auf den Transport von Thiamin und Thiaminpyrophosphat auswirkt und so den Tricarbonsäurezyklus und den Pentose-Phosphat-Weg optimiert, um später mehr NADPH zu erhalten, was wiederum die Zellen mit mehr Energie versorgt, welche diese zur Regulierung des intrazellulären Redoxstatus benötigen. Diese Beobachtungen bilden die Grundlage für die folgende genetische Modifizierung von Gluconobacter oxydans sowie ein Fundament für weitere Untersuchungen der Prozesse und der Steuerung industriell hergestellter Bakterienmischungen.
Beispiel 8-2 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zum Nachweis der Veränderungen bei intrazellulären Proteinen bei Verwendung von Glutathion zur Beeinflussung von Gluconobacter oxydans, charakterisiert durch die im Folgenden beschriebenen Schritte:
(1) Bestimmung der intrazellulärer Proteine:
Gewinnung und Quenching der Zellen:
Entnahme von 4 Teilen Gluconobacter oxydans und separates Beimpfen eines Fermentationsnährmediums A bei einem Volumenverhältnis von 10%, Entnahme weiterer 4 Teile von Gluconobacter oxydans und separates Beimpfen eines Fermentationsnährmediums B bei einem Volumenverhältnis von 10%, Bebrüten und Fermentieren zweiter unterschiedlich beimpfter Nährmedien bei einer Temperatur von 30°C bei 220 U/min, Entnehmen von Proben aus der fermentierten Flüssigkeit nach 1 h und nach 15 h als Zeitpunkten der Probenentnahme, Zentrifugieren bei einer Temperatur von 4°C bei 5000 U/min, Auffangen der Zellen der unteren Schicht, Waschen mit einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,3, sofortiges Quenchen mit Flüssigstickstoff zur Beendigung der Stoffwechselreaktion; Aufbrechen der Zellen durch Zermahlen mit Flüssigstickstoff, um 4 Teile mit gequenchten, aufgebrochenen Zellen aus Nährmedium A nach einer Fermentationsdauer von 1 h, 4 Teilen mit gequenchten, aufgebrochen Zellen aus Nährmedium A nach einer Fermentationsdauer von 15 h, 4 Teilen mit gequenchten, aufgebrochenen Zellen aus Nährmedium B nach einer Fermentationsdauer von 1 h und 4 Teilen mit gequenchten, aufgebrochenen Zellen aus Nährmedium B nach einer Fermentationsdauer von 15 h Stunden zu gewinnen; die Fermentationsnährmedien A und B waren dabei identisch mit denen aus Beispiel 8-1;
(ii) Extrahierung der intrazellulären Proteine:
Entnahme der in Schritt (i) aufgebrochenen Zellen, Platzierung jedes Teils in einer Menge von 150 mg in das Zentrifugenröhrchens, Hinzufügen von 1 ml der Zelllyselösung in jedes einzelne Zentrifugenröhrchen, gründliches Mischen, Unterziehung einer intermittierenden Beschallung mit Ultraschall auf Eis über einen Zeitraum von 40 Sek.; Hinzufügen von 10 µl einer Lösung mit einer DNase I-/RNase A-Enzymmischung in einem Massenverhältnis von 3:1, gründliches Mischen, Stehenlassen bei einer Temperatur von 4°C über einen Zeitraum von 15 Minuten; Hinzufügen von 12 µl einer 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid- Isopropanol-Lösung, Stehenlassen bei einer Temperatur von 4°C über einen Zeitraum von 2 h; Zentrifugieren bei 15000 U/min über einen Zeitraum von 30 Minuten; Auffangen des Überstands zur Gewinnung einer Proteinlösung, in welcher diejenige Zelllyselösung enthalten ist, die mit derjenigen aus Beispiel 8-1 identisch ist;
(iii) Messung der Proteinkonzentrationen
unter Verwendung eines Bradford-Kits, Hinzufügen von Rinderserumalbumin zu einer Coomassie Brilliant Blue G-250-Lösung, und zwar von einer niedrigen Konzentration zu einer hohen Konzentration, Messen der Absorptionswerte bei 595 nm der in Schritt (ii) gewonnen Proteinlösungen, Erstellen der Standardkurve; Messen der Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen;
(iv) Präzipitation der Proteine:
separate Entnahme der Proteinlösungen, die 100 µg des in Schritt (iii) gewonnenen Proteins enthalten, Hinzufügen von Aceton mit einer Temperatur von -30°C in einem 5-fachen Volumen zu jeder Lösung, Präzipitieren über einen Zeitraum von 15 h; Zentrifugieren, Abschütten des Überstands, Waschen des Präzipitats mit einer wässrigen Acetonlösung mit einer Temperatur von -30°C und einer Volumenkonzentration von 80%; Gefriertrocknen für die Ad-hoc-Verwendung; Lagerung bei -80°C;
Reduktion und Enzymolyse der Proteine
Hinzufügen zu jedem einzelnen der in Schritt (iv) gewonnenen Teile Trockenproteinpulver von je 10 µl einer 50 mM wässrigen Triethylammoniumbicarbonat-Lösung zur Auflösung der Proteine;
Hinzufügen von 1 µl Tris-(2-carboxylethyl)-phosphin, Durchführen einer Reduktionsreaktion für jedes Protein bei einer Temperatur von 55°C über einen Zeitraum von 1 h, im Anschluss daran Hinzugeben von 1 µl Methylthiosulfonisäuremethylester, über einen Zeitraum von 10 Minuten reagieren lassen, um die Reduktionsreaktion zu beenden;
Hinzufügen von 25 µl wässriger Trypsinlösung in einer Konzentration von 0,2 µg/µl zu der oben beschriebenen Lösung, Durchführen einer Proteolyse bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 15 h;
(vi) Markieren der Proteine
Separates Hinzufügen des Markierungsreagenz iTRAQ, aufgelöst in 70 Ethanol, zu jeder einzelnen der in Schritt (v) gewonnen Proteolyselösungen, reagieren lassen bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 1 h;
(vii) Mischen der Lösungen
Mischen der in Schritt (vi) gewonnenen Lösungen, um 4 Lösungsmischungen zu erhalten, so dass jede Lösungsmischung sich aus Folgendem zusammensetzt: die markierten Proteine, die auf dem Wege einer Fermentation über einen Zeitraum von 1 h in Kulturmedium A gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; die markierten Proteine, die über Fermentation über einen Zeitraum von 15 h in Kulturmedium A gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; die markierten Proteine, die über Fermentation über einen Zeitraum von 1 h in Kulturmedium B gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; und die markierten Proteine, die über Fermentation über einen Zeitraum von 15 h in Kulturmedium B gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; anschließend Lagerung bei -20°C;
(viii) Identifizierung der differentiell exprimierten Proteine
Unterziehung der in Schritt (vii) gewonnen Lösungsmischung einer Identifizierung mittels Q-Tof-Massenspektrometrie zur Gewinnung des Proteomprofils, Gewinnung der differentiell exprimierten Proteine der Proben der gemischten Gruppen durch Quantifizierung;
(2) Analyse der Hauptkomponenten:
Standardisierung der in Schritt (1)(viii) gewonnenen Daten unter Verwendung der Software Matlab, im Anschluss daran die Unterziehung der Hauptkomponenten einer Analyse mit dem Ziel, die Datenklassen mit unterschiedlichen variierenden Mustern zu erhalten und differentielle Proteinkandidaten zu ermitteln;
(3) Prozessanalyse
Erstellen eines Kurvendiagramms zum Gehalt der in Schritt (2) gewonnen differentiellen Proteinkandidaten gegen die Zeit, das Beobachten und die Analyse der variierenden Muster dieser Proteine sowie anschließend die Entdeckung der Effekte von Glutathion bei dem Prozess des Anstiegs der von Gluconobacter oxydans produzierten 2-Keto-L-Gluonsäure.
Der Test bestätigte, dass die Ergebnisse mit denen aus Beispiel 8-1 vergleichbar waren.
Beispiel 8-3 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zum Nachweis von Veränderungen bei den intrazellulären Proteinen nach der Verwendung von auf Gluconobacter oxydans wirkendem Glutathion, das durch die folgenden Schritte beschrieben wird:
(1) Bestimmung der intrazellulärer Proteine:
Gewinnung und Quenching der Zellen:
Entnehmen von 5 Teilen Gluconobacter oxydans und separates Beimpfen eines Fermentationsnährmediums A in einem Volumenverhältnis von 16%, Entnehmen weiterer 5 Teile von Gluconobacter oxydans und separates Beimpfen eines Fermentationsnährmediums B in einem Volumenverhältnis von 16%, Bebrüten und Fermentieren zweier unterschiedlich beimpfter Nährmedien bei einer Temperatur von 28°C bei 250 U/min, Entnehmen von Proben der fermentierten Flüssigkeit nach 1 h und nach 15 h als Zeitpunkten der Probenentnahme, Zentrifugieren bei einer Temperatur von 4°C bei 6000 U/min, Auffangen der Zellen der unteren Schicht, Waschen mit einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4, sofortiges Quenchen mit Flüssigstickstoff zur Beendigung der Stoffwechselreaktion; Aufbrechen der Zellen durch Zermahlen mit Flüssigstickstoff, um 5 Teile mit gequenchten, aufgebrochenen Zellen aus Kulturmedium A nach einer Fermentationsdauer von 1 h, 5 Teile mit gequenchten, aufgebrochen Zellen aus Kulturmedium A nach einer Fermentationsdauer von 15 h, 5 Teile mit gequenchten, aufgebrochenen Zellen aus Kulturmedium B nach einer Fermentationsdauer von 1 h und 5 Teile mit gequenchten, aufgebrochenen Zellen aus Kulturmedium B nach einer Fermentationsdauer von 15 h Stunden zu gewinnen; dabei waren die Fermentationsnährmedien A und B mit denen Aus Beispiel 8-1 identisch.
(ii) Extrahierung der intrazellulären Proteine:
Entnahme der in Schritt (i) aufgebrochenen Zellen, Gabe jedes Teils in einer Menge von 200 mg in das Zentrifugenröhrchens, Hinzufügen von 2 ml der Zelllyselösung in jedes einzelne Zentrifugenröhrchen, gründliches Mischen, Unterziehen einer intermittierenden Beschallung mit Ultraschall auf Eis über einen Zeitraum von 50 Sek.; Hinzufügen von 15 µl einer Lösung mit einer DNase I-/RNase A-Enzymmischung in einem Massenverhältnis von 4:1, gründliches Mischen, Stehenlassen bei einer Temperatur von 4°C über einen Zeitraum von 30 Minuten; Hinzufügen von 15 µl einer 120 mM Phenylmethylsulfonylfluorid-Isopropanol-Lösung, Stehenlassen bei einer Temperatur von 4°C über einen Zeitraum von 3 h; Zentrifugieren bei 15000 U/min über einen Zeitraum von 40 Minuten; Auffangen des Überstands zur Gewinnung einer Proteinlösung, in welcher die Zelllyselösung enthalten ist, die mit derjenigen aus Beispiel 8-1 identisch ist
(iii) Messung der Proteinkonzentrationen
unter Verwendung eines Bradford-Kits, Hinzufügen von Rinderserumalbumin zu einer Coomassie Brilliant Blue G-250-Lösung, und zwar von einer niedrigen Konzentration zu einer hohen Konzentration, Messen der Absorptionswerte bei 595 nm der in Schritt (ii) gewonnen Proteinlösungen, Erstellen der Standardkurve; Messen der Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen;
(iv) Präzipitation der Proteine:
separates Entnehmen der Proteinlösungen, die 150 µg des in Schritt (ii) gewonnenen Proteins enthalten, Hinzufügen von Aceton mit einer Temperatur von -40°C in einem 6-fachen Volumen zu jeder Lösung, Präzipitieren über einen Zeitraum von 20 h; Zentrifugieren, Abschütten des Überstands, Waschen des Präzipitats mit einer wässrigen Acetonlösung mit einer Temperatur von -40°C und einer Volumenkonzentration von 85%; Gefriertrocknen für die Ad-hoc-Verwendung; Lagerung bei -80°C;
Reduktion und Enzymolyse der Proteine
Hinzufügen zu jedem einzelnen der in Schritt (iv) gewonnenen Teile Trockenproteinpulver von je 40 µl einer 60 mM wässrigen Triethylammoniumbicarbonat-Lösung zur Auflösung der Protein;
Hinzufügen von 4 µl Tris-(2-carboxylethyl)-phosphin, Durchführen einer Reduktionsreaktion bei jedem Protein bei einer Temperatur von 60°C über einen Zeitraum von 1 h, im Anschluss daran die Hinzugabe von 2 µl Methylthiosulfonsäuremethylester, reagieren lassen über einen Zeitraum von 10 Minuten, um die Reduktionsreaktion zu beenden;
Hinzufügen von 30 µl wässriger Trypsinlösung in einer Konzentration von 0,3 µg/µl zu der oben beschriebenen Lösung, Durchführen einer Proteolyse bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 18 h;
(vi) Markieren der Proteine
Separates Hinzufügen des Markierungsreagenz iTRAQ zu jeder einzelnen der in Schritt (v) gewonnen Proteolyselösungen, aufgelöst in 80 µl Ethanol, reagieren lassen bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 1 h;
(vii) Mischen der Lösungen
Mischen der in Schritt (vi) gewonnenen Lösungen, um 5 Lösungsmischungen zu erhalten, so dass jede Lösungsmischung sich aus Folgendem zusammensetzt: die markierten Proteine, die durch Fermentation über einen Zeitraum von 1 h in Kulturmedium A gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; die markierten Proteine, die durch Fermentation über einen Zeitraum von 15 h in Kulturmedium A gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; die markierten Proteine, die durch Fermentation über einen Zeitraum von 1 h in Kulturmedium B gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; und die markierten Proteine, die durch Fermentation über einen Zeitraum von 15 h in Kulturmedium B gewonnen wurden, welches den Schritten (ii) bis (vi) unterzogen wurde; anschließend Lagerung bei -20°C;
(viii) Identifizierung der differentiell exprimierten Proteine
Unterziehung der in Schritt (vii) gewonnen Lösungsmischung einer Identifizierung mittels Q-Tof-Massenspektrometrie zur Gewinnung des Proteomprofils, Gewinnung der differentiell exprimierten Proteine der Proben der gemischten Gruppen durch Quantifizierung;
(2) Analyse der Hauptkomponenten:
Standardisierung der in Schritt (1)(viii) gewonnenen Daten unter Verwendung der Software Matlab, im Anschluss daran die Unterziehung der Hauptkomponenten einer Analyse mit dem Ziel, die Datenklassen mit unterschiedlichen variierenden Mustern zu erhalten und differentielle Proteinkandidaten zu ermitteln;
(3) Prozessanalyse
Erstellen eines Kurvendiagramms zum Gehalt der in Schritt (2) gewonnen differentiellen Proteinkandidaten gegen die Zeit, das Beobachten und die Analyse der variierenden Muster dieser Proteine sowie anschließend die Entdeckung der Effekte von Glutathion bei dem Prozess des Anstiegs der von Gluconobacter oxydans produzierten 2-Keto-L-Gluonsäure.
Der Test bestätigte, dass die Ergebnisse mit denen aus Beispiel 8-1 vergleichbar waren.
Beispiel 9-1 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Identifizierung von Indikatoren für eine Qualitätskontrolle von Maisquellwasser als Fermentationsrohstoff, das die folgenden Schritte umfasst:
(1) Bestimmung der chemischen Komponenten von Maisquellwasser aus 11 Chargen:
Vorbereiten der Proben:
Hineingeben von 1 g homogenem Maisquellwasser in ein Zentrifugenröhrchen, Zentrifugieren und Auffangen des Überstands; 20-faches Verdünnen des aufgefangenen Überstands mit ultrareinem Wasser, Entnahme von 20 µl des verdünnten Überstands und Hineingeben desselben in ein weiteres Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 30 µl einer 0,040 mg/ml mit Deuterium markierter Bernsteinsäure-Methanol-Lösung als interner Standardsubstanz; Gefriertrocknen, im Anschluss daran Hinzufügen von 50 µl einer 20 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid-Pyridin-Lösung und Durchführen einer Oximierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 90 Minuten; im Anschluss daran Hinzufügen von 80 µl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid und Durchführen einer Silanisierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 30 Minuten;
(ii) Gaschromatographie/Time-of-Flight-Massenspektrometrie:
Laden von 1 µl der in Schritt (i) gewonnenen Probe in einen Gaschromatograph mit einer DB-5MS Chromatographiesäule, die eine Spezifikation von 30 m × 0,25 mm i.d. aufweist, einer Temperatur am Injektionsport von 250°C, hochreinem Helium als Trägergas, einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/min, einem Teilungsverhältnis von 20:1, Temperaturprogrammierung für den Säulenofen: Initialtemperatur 70°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 2 Minuten, stufenweise Erhöhung auf eine endgültige Temperatur von 290°C in Schritten von 5°C/min, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 10 Minuten, Verwendung einer Elektronen-Ionisierungsquelle, einer Temperatur der Quelle von 280°C, einer Detektorspannung von 2500 V, einer Ionisierungsspannung von 80 eV, einem Strom von 50 µA; einem massenspektrometrischen Nachweisbereich von 50-800 m/z; Heranziehen der NIST-Datenbank für den Nachweis der Komponenten unter Verwendung der Software Masslynx 4.1 für die Bearbeitung der massenspektrometrisch erhobenen Daten zum relativen Gehalt der Komponenten; Integration der chromatographischen Peak-Bereiche und Vergleich der Peak-Bereiche mit dem internen Standard, um den relativen Gehalt der chemischen Komponenten von Maisquellwasser als Rohstoff der Fermentation zu ermitteln; hierbei wurden mehr als 80 Verbindungen nachgewiesen, von denen 58 identifiziert wurden, wie in Tabelle 1 gezeigt.
(2) Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate

(i) Durchführung einer Standardisierung der in Schritt (1) gewonnen Daten und Skalierung derselben nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto, um die Effekte der größten Unterschiede bezüglich des Gehalts der unterschiedlichen Komponenten der gleichen Probe auf die Ergebnisse der Methode der kleinsten Quadrate zu bereinigen;
(ii) unter Verwendung der Software SIMCA-P 11.5 zur Durchführung einer Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate auf die vorbehandelten Daten, um Punktdiagramme, Belastungsdiagramme und VIP-Diagramme zur Darstellung der Ähnlichkeiten und Unterschiede zu erstellen; in den Punktdiagrammen ist die Ähnlichkeit der Proben umso größer, desto geringer der Abstand zwischen den beiden Proben und der Unterschied zwischen den Proben umso größer, je größer dieser Abstand, sodass diese Werte zur Identifizierung der Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Substanzen der gleichen Charge Maisquellwasser herangezogen werden können; im Belastungsdiagramm steht jeder Punkt für eine Substanz, und je größer der Abstand dieser Punkte vom zentralen Punkt, desto größer die Differenz im Gehalt zwischen verschiedenen Chargen, sodass diese Werte als Indikatoren für eine Qualitätskontrolle von Maisquellwasser herangezogen werden können; die VIP-Diagramme hingegen repräsentieren den Beitrag einer jeden Substanz zur Unterscheidung der Proben, wobei ein VIP>1 als der wichtigste Indikator für die Qualität von Maisquellwasser angesehen werden darf.

Aus - (t[1]-t[2]-Diagramme der Analyse der Hauptkomponenten von Maisquellwasser der unterschiedlichen Chargen) geht hervor, dass 11 Chargen Maisquellwasser offensichtlich in 3 Klassen unterteilt werden konnten; dabei wurden die Chargen 1 und 2 zu einem Cluster zusammengefasst, die Chargen 3, 4 und 11 zu einem zweiten Cluster und die restlichen Chargen zu einem dritten Cluster. Aus - (t[1]-u[1]-Diagramme der Analyse der Hauptkomponenten der unterschiedlichen Chargen Maisquellwasser) geht hervor, dass die Chargen 1 und 2 die höchsten u[1]-Werte zeigten, die Chargen 3, 4 und 11 die niedrigsten u[1]-Werte; bei den restlichen Chargen bewegte sich der u[1]-Wert um den Ausgangspunkt herum, sodass die Unterteilung in 3 Klassen auf dem Wege der Division vorgenommen wurde. Dies zeigt an dass Maisquellwasser zwar den aktuellen Qualitätsstandards genügt, unterschiedliche Chargen Maisquellwasser jedoch signifikante Unterschiede aufweisen können, was signifikante Auswirkungen auf die Fermentation haben könnte.

zeigt diejenigen Substanzen, die bei der Beurteilung der Qualität der unterschiedlichen Chargen Maisquellwasser nützlich sein könnten. Aus - (w*c[1]-w*c[2]-Streudiagramme der unterschiedlichen Chargen Maisquellwasser) geht hervor, dass die Substanzen, deren Gehalt sich in den unterschiedlichen Chargen Maisquellwasser in signifikanter Weise voneinander unterschied, vorläufig ausgesondert werden konnten nach dem Prinzip, der Unterschied im Gehalt einer Substanz umso größer ist, desto weiter der entsprechende Punkt vom Mittelpunkt entfernt liegt. - (p-p(corr) S-Diagramme der ersten Hauptkomponente der unterschiedlichen Chargen Maisquellwasser) zeigt, dass diejenigen Substanzen, anhand derer es möglich war, die verschiedenen Chargen Maisquellwasser zu unterscheiden, noch weiter ausgesondert werden konnten gemäß dem Prinzip, dass | corr|.>0,5, wobei p(corr)>0,5, angab, dass die Substanz einen signifikanten Einfluss auf die positive Achse des Clusters aus hatte, während p(corr)< -0,5 anzeigte, dass die Substanz einen signifikanten Einfluss auf die negative Achse des Clusters aus hatte; veranschaulicht, dass der Beitrag einer jeden einzelnen Substanz bestimmt werden konnte, wobei galt, dass je größer der VIP-Wert, desto größer der Beitrag der Substanz zur Clusteranalyse, und allgemein ein VIP>1 als Standard bei der Sondierung der Marker herangezogen wurde. Vor dem Hintergrund der Analyse der 3 Abbildungen konnten schließlich 16 Hauptsubstanzen bestimmt werden, die sich zur Unterscheidung der Qualität unterschiedlicher Chargen Maisquellwasser eignen; diese waren in der Reihenfolge ihrer Wichtigkeit: Glucose, Milchsäure, Prolin, Phosphorsäure, Galactose, Alanin, Fructose, 5-Ketoprolin, Glycin, Asparaginsäure, Valin, Phenylalanin, Serin, Citronensäure, Glutaminsäure und Lysin. Eine weitere Analyse ergab, dass die Unterschiede im Gehalt von Milchsäure und Phosphorsäure in erster Linie auf die Fermentation von Mikroorganismen während des Quellvorgangs des Mais zurückgeführt werden konnten, was sich aus der unterschiedlichen Verarbeitung von Maisquellwasser der unterschiedlichen Hersteller ergab; Prolin ist die wichtigste in Mais enthaltende Aminosäure, und Unterschiede im Prolingehalt könnten auf den Produktionsstandort oder auf den Zeitpunkt der Ernte der unterschiedlichen Hersteller zurückzuführen sein; auch sind derartige Marker für Qualitätsunterschiede prinzipiell als Nährstofflieferanten für Mikroorganismen zu betrachten; darüber hinaus könnten sich Prolin und Glycin auch in bedeutender Weise auf den osmotischen Druck von Mikroorganismen während des Fermentationsprozesses auswirken. Da die ersten 9 Substanzen mehr signifikante Effekte aufwiesen, könnten diese als Indikatoren für eine Qualitätskontrolle von Maisquellwasser herangezogen werden. Tabelle 9-1: Klassen von chemischen Verbindungen von Maisquellwasser, wie in Beispiel 9-1 bestimmt

Nr.	Metabolite	Retentionszeit/min	Nr.	Metabolite	Retentionszeit/min
1	Milchsäure	7.20	30	Ribose	23.31
2	2-Hydroxyessigsäure	7.62	31	Asparagin	23.45
3	Alanin	8.34	32	Ribitol	24.29
4	Oxalsäure	9.38	33	Xylitol	24.62
5	Valin	11.50	34	1,4-Butanediamin	24.95
6	Harnstoff	12.38	35	2-Ketogluconsäure	25.60
7	Phosphorsäure	13.09	36	Hypoxanthin	26.50
8	Glycerin	13.21	37	Ornithin	26.78
9	Isoleucin	13.70	38	Citronensäure	26.85
10	Prolin	13.77	39	1,5-Pentanediamin	27.17
11	Glycin	14.02	40	Adenin	27.80
12	Glycerinsäure	14.76	41	Fructose	27.97
13	Uracil	14.91	42	Glucose	28.35
14	Butendisäure	15.37	43	Galactose	28.26
15	Serin	15.59	44	Lysin	29.05
16	Threonin	16.27	45	Mannitol	29.29
17	Thymin	16.62	46	Tyrosin	29.37
18	β-Alanin	17.37	47	Altrose	30.24
19	Apfelsäure	19.03	48	Gluconsäure	30.77
20	4-hydroxy-proline	19.28	49	Xanthin	30.96
21	Erythritol	19.52	50	Talose	31.22
22	Methionin	19.69	51	Hexadecansäure	31.63
23	5-Ketoprolin	19.72	52	Inositol	32.36
24	Asparaginsäure	19.83	53	Guanin	33.08
25	4-Am inobuttersäure	20.02	54	Sedoheptose	33.17
26	Cystein	17.37	55	Glucitol	34.63
27	2-Aminocaprylsäure	21.31	56	Stearinsäure	35.37
28	Glutaminsäure	22.32	57	Uridin	38.81
29	Phenylalanin	22.36	58	Vernin	43.95

Beispiel 9-2 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Identifizierung von Indikatoren für eine Qualitätskontrolle von Maisquellwasser als Fermentationsrohstoff, das die folgenden Schritte umfasst:
(1) Bestimmung der chemischen Komponenten von Maisquellwasser aus 11 Chargen:
Vorbereitung der Proben:
Hineingeben von 2 g homogenem Maisquellwasser in ein Zentrifugenröhrchen, Zentrifugieren und Auffangen des Überstands; 40-faches Verdünnen des aufgefangenen Überstands mit ultrareinem Wasser, Entnahme von 20 µl des verdünnten Überstands und Hineingeben desselben in ein weiteres Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 40 µl einer mit Deuterium markierten 0,040 mg/ml Bernsteinsäure-Methanol-Lösung als interner Standardsubstanz; Gefriertrocknen, im Anschluss daran Hinzufügen von 50 µl einer 20 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid-Pyridin-Lösung und Durchführen einer Oximierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 120 Minuten; im Anschluss daran Hinzufügen von 70 µl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid und Durchführen einer Silanisierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 35°C über einen Zeitraum von 50 Minuten;
(ii) Gaschromatographie/Time-of-Flight-Massenspektrometrie:
Laden von 1 µl der in Schritt (i) gewonnenen Probe in einen Gaschromatograph mit einer DB-5MS Chromatographiesäule, die eine Spezifikation von 30 m × 0,25 mm i.d. aufweist, einer Temperatur am Injektionsport von 280°C, hochreinem Helium als Trägergas, einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/min, einem Teilungsverhältnis von 30:1, Temperaturprogrammierung für den Säulenofen: Initialtemperatur 80°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 5 min, schrittweise Erhöhung auf eine endgültige Temperatur von 300°C in Schritten von 8°C/min, Beibehalten der Temperatur für einen Zeitraum von 8 Minuten, Verwenden einer Elektronen-Ionisierungsquelle, einer Temperatur der Quelle von 260°C, einer Detektorspannung von 2700 V, einer Ionisierungsspannung von 80 eV, einem Strom von 50 µA; einem massenspektrometrischen Nachweisbereich von 50-800 m/z; Heranziehen der NIST-Datenbank für den Nachweis der Komponenten unter Verwendung der Software Masslynx 4.1 für die Bearbeitung der massenspektrometrisch erhobenen Daten zum relativen Gehalt der Komponenten; Integration der chromatographischen Peak-Bereiche und Vergleich der Peak-Bereiche mit dem internen Standard zur Ermittlung des relativen Gehalts der chemischen Komponenten von Maisquellwasser als Fermentationsrohstoff;
(2) Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate

(i) Durchführung einer Standardisierung der in Schritt (1) gewonnen Daten und Skalierung derselben nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto, um die Effekte der größten Unterschiede bezüglich des Gehalts der unterschiedlichen Komponenten der gleichen Probe auf die Ergebnisse der Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate zu bereinigen;
(ii) Durchführung einer Standardisierung der in Schritt (1) gewonnen Daten und Skalierung derselben nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto, um die Effekte der größten Unterschiede bezüglich des Gehalts der unterschiedlichen Komponenten der gleichen Probe auf die Ergebnisse der Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate zu bereinigen.

Der Test bestätigte, dass die in diesem Beispiel verwendete Methode auch Ergebnisse erbringen kann, die denen aus Beispiel 9-1 entsprechen.
Beispiel 9-3 (nicht erfindungsgemäß)
Ein Verfahren zur Identifizierung von Indikatoren für eine Qualitätskontrolle von Maisquellwasser als Fermentationsrohstoff, das die folgenden Schritte umfasst:
(1) Bestimmung der chemischen Komponenten von Maisquellwasser aus 11 Chargen:
Vorbereiten der Proben:
Hineingeben von 0,5 g homogenem Maisquellwasser in ein Zentrifugenröhrchen, Zentrifugieren und Auffangen des Überstands; 20-faches Verdünnen des aufgefangenen Überstands mit ultrareinem Wasser, Entnahme von 40 µl des verdünnten Überstands und Hineingeben desselben in ein weiteres Zentrifugenröhrchen, Hinzufügen von 30 µl einer mit Deuterium markierten 0,040 mg/ml Bernsteinsäure-Methanol-Lösung als interner Standardsubstanz; Gefriertrocknen, im Anschluss daran Hinzufügen von 70 µl einer 20 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid-Pyridin-Lösung und Durchführen einer Oximierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C über einen Zeitraum von 60 Minuten; im Anschluss daran Hinzufügen von 100 µl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid und Durchführen einer Silanisierungsreaktion im Wasserbad bei einer Temperatur von 40°C über einen Zeitraum von 20 Minuten;
(ii) Gaschromatographie/Time-of-Flight-Massenspektrometrie:
Laden von 1 µl der in Schritt (i) gewonnenen Probe in einen Gaschromatograph mit einer DB-5MS Chromatographiesäule, die eine Spezifikation von 30 m × 0,25 mm i.d. aufweist, einer Temperatur am Injektionsport von 270°C, hochreinem Helium als Trägergas, einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 ml/min, einem Teilungsverhältnis von 20:1, Temperaturprogrammierung für den Säulenofen: Initialtemperatur 70°C, Beibehalten der Temperatur über einen Zeitraum von 3 Minuten, schrittweise Erhöhung auf eine endgültige Temperatur von 290°C in Schritten von 4°C/min, Beibehalten der Temperatur für einen Zeitraum von 10 Minuten, Verwendung einer Elektronen-Ionisierungsquelle, einer Temperatur der Quelle von 280°C, einer Detektorspannung von 2500 V, einer Ionisierungsspannung von 70 eV, einem Strom von 40 µA; einem massenspektrometrischen Nachweisbereich von 50-800 m/z; Heranziehen der NIST-Datenbank für den Nachweis der Komponenten unter Verwendung der Software Masslynx 4.1 für die Bearbeitung der massenspektrometrisch erhobenen Daten zum relativen Gehalt der Komponenten; Integration der chromatograpischen Peak-Bereiche und Vergleich der Peak-Bereiche mit dem internen Standard zur Ermittlung des relativen Gehalts der chemischen Komponenten von Maisquellwasser als Fermentationsrohstoff;
(2) Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate

(i) Durchführung einer Standardisierung der in Schritt (1) gewonnen Daten und Skalierung derselben nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung nach Pareto, um die Effekte der größten Unterschiede bezüglich des Gehalts der unterschiedlichen Komponenten der gleichen Probe auf die Ergebnisse der Methode der kleinsten Quadrate zu bereinigen;
(ii) unter Verwendung der Software SIMCA-P 11.5 zur Durchführung einer Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate auf die vorbehandelten Daten, um Punktdiagramme, Belastungsdiagramme und VIP-Diagramme zur Darstellung der Ähnlichkeiten und Unterschiede zu erstellen; in den Punktdiagrammen ist die Ähnlichkeit der Proben umso größer, desto geringer der Abstand zwischen den beiden Proben und der Unterschied zwischen den Proben umso größer, je größer dieser Abstand, sodass diese Werte zur Identifizierung der Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Substanzen der gleichen Charge Maisquellwasser herangezogen werden können; im Belastungsdiagramm steht jeder Punkt für eine Substanz, und je größer der Abstand dieser Punkte vom zentralen Punkt, desto größer die Differenz im Gehalt zwischen verschiedenen Chargen, sodass diese Werte als Indikatoren für ein Qualitätskontrolle von Maisquellwasser herangezogen werden können; die VIP-Diagramme hingegen repräsentieren den Beitrag einer jeden Substanz zur Unterscheidung der Proben, wobei ein VIP>1 als der wichtigste Indikator für die Qualität von Maisquellwasser angesehen werden darf.

Der Test bestätigte, dass das in diesem Beispiel herangezogene Verfahren ebenfalls zu Ergebnissen führen kann, die denen aus Beispiel 9-1 entsprechen.
Bacillus megaterium CGMCC Nr. 1.459 und Gluconobacter oxydans CGMCC Nr. 1.110 werden in der vorliegenden Offenbarung lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung herangezogen, nicht, um den Anwendungsbereich vorliegende Offenbarung einzuschränken. Experimente haben bestätigt, dass auch andere Stämme von Bacillus megaterium oder Gluconobacter oxydans im Sinne dieser Offenbarung verwendet werden können.
Auch wenn einige spezifische Verkörperungen der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben sind, ist dem versierten Fachmann ersichtlich, dass die hier offengelegten Inhalte in ihren Einzelheiten modifiziert und verändert werden können; alle derartigen Veränderungen sind durch die vorliegende Erfindung geschützt. Der Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung wird durch die im Anhang aufgeführten angemeldeten Ansprüche und deren Entsprechungen abgedeckt.

Claims

Eine Methode zur Erhöhung der Produktion von 2-Keto-L-gulonsäure durch verbesserte Wechselwirkung zweier Bakterien, wobei diese durch folgende Schritte charakterisiert ist: (1) feste Kultur: Man stellt 10-500µL Gluconobacter oxydans, aufbewahrt in einer 15-30%igen Glycerin-Wasser-Lösung (Volumen %), sowie 10-500µL Bacillus megatherium, aufbewahrt in einer 15-30%igen Glycerin-Wasser-Lösung (Volumen %), bereit, die in flüssigem Stickstoff gelagert sind, impft diese separat auf feste Nährmedien und kultiviert bei 28-35°C für 24-48 h; (2) Anzuchtkultur: man überträgt die in Schritt (1) kultivierten Bacillus megatherium sowie Gluconobacter oxydans separat in Anzuchtnährmedien und kultiviert bei 28-35°C für 24-48 h unter Schütteln mit 200-280 U/min, um eine Kulturflüssigkeit mit Bacillus megatherium sowie eine Kulturflüssigkeit mit Gluconobacter oxydans zu erhalten; man impft die Bacillus megatherium und Gluconobacter oxydans in neue Anzuchtnährmedien ein, um eine Konzentration von 2×10⁷- 2×10¹⁰ KbE/ml für Bacillus megatherium sowie eine Konzentration von 2×10⁸- 2×10¹¹ KbE/ml für Gluconobacter oxydans zu erreichen, kultiviert unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C und impft mit einem Subkultivierungs-Zyklus von 24 bis 48 h und einem Volumenverhältnis von 1% bis 10% in neue Anzuchtnährmedien ein, um eine Subkultivierung über 100-200 Tage durchzuführen; (3) Abtrennung und Reinigung: man streicht die durch die Subkultivierung in Schritt (2) erhaltenen Mischbakterien zwecks Abtrennung und Reinigung aus, impft dann separat auf feste Nährmedien, kultiviert bei 28-35°C für 24-48 h, überträgt dann separat in Anzuchtnährmedien und kultiviert unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C für 24-48 h, um eine entwickelte Kulturflüssigkeit mit Bacillus megatherium sowie eine entwickelte Kulturflüssigkeit mit Gluconobacter oxydans zu erhalten; (4) Fermentierung man impft die entwickelten Bacillus megatherium und die entwickelten Gluconobacter oxydans in Fermentierungs-Nährmedien ein, um eine Konzentration von 2×10⁷ - 2×10¹⁰ KbE/ml für die entwickelten Bacillus megaterium sowie eine Konzentration von 2×10⁸ - 2×10¹¹ KbE/ml für die entwickelten Gluconobacter oxydans zu erreichen und kultiviert unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C für 72-96 h, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten oder man impft den originalen Bacillus megatherium sowie den entwickelten Gluconobacter oxydans in Fermentierungs-Nährmedien ein, um eine Konzentration von 2×10⁷ - 2×10¹⁰ KbE/ml für den entwickelten Bacillus megatherium und eine Konzentration von 2×10⁷ - 2×10⁹ KbE/ml für den entwickelten Gluconobacter oxydans zu erhalten und kultiviert unter Schütteln mit 200-280 U/min bei 28-35°C für 72-96 h, um 2-Keto-L-gulonsäure zu erhalten.
Die Methode von Anspruch 1, wobei diese die Vorbereitung von festen Nährmedien charakterisiert: man wiegt 10-50g L-Sorbose, 2-10g Maisquellwasser, 2-10g Rinderextrakt, 2-10g Hefeextraktpulver, 0,5-5g Harnstoff, 2-12g Pepton, 10-50g Agar, 0,5-5g KH₂PO₄, 0,1-0,7g MgSO₄ und 0,5-5g CaCO₃ ab, füllt mit Wasser bis zu 1l auf, stellt den pH-Wert auf 6,5-7,0 ein und sterilisiert für 20 Minuten bei 121°C, um die festen Nährmedien zu erhalten; noch besser ist die Vorbereitung von festen Nährmedien wie folgt charakterisiert: man wiegt 20g L-Sorbose, 3g Maisquellwasser, 3g Rinderextrakt, 3g Hefeextraktpulver, 1g Harnstoff, 10g Pepton, 20g Agar, 1g KH₂PO₄, 0,2g MgSO₄ und 1g CaCO₃ ab, füllt mit Wasser bis zu 1l auf, stellt den pH-Wert auf 6,8 ein und sterilisiert für 20 Minuten bei 121°C, um die festen Nährmedien zu erhalten; die Vorbereitung der Anzuchtnährmedien ist vorzugsweise wie folgt charakterisiert: man wiegt 10-50g L-Sorbose, 2-10g Maisquellwasser, 2-10g Rinderextrakt, 2-10g Hefeextraktpulver, 0,5-5g Harnstoff, 2-12g Pepton, 0,5-5g KH₂PO₄, 0,1-0,7g MgSO₄ und 0,5-5g CaCO₃ ab, füllt mit Wasser bis zu 1l auf, stellt den pH-Wert auf 6,5-7,0 ein und sterilisiert für 20 Minuten bei 121°C, um die Anzuchtnährmedien zu erhalten; noch besser ist die Vorbereitung der Anzuchtnährmedien wie folgt charakterisiert: man wiegt 20g L-Sorbose, 3g Maisquellwasser, 3g Rinderextrakt, 3g Hefeextraktpulver, 1g Harnstoff, 10g Pepton, 1g KH₂PO₄, 0,2g MgSO₄ und 1g CaCO₃ ab, füllt mit Wasser bis zu 1l auf, stellt den pH-Wert auf 6,8 ein und sterilisiert für 20 Minuten bei 121°C, um die Anzuchtnährmedien zu erhalten; vorzugsweise ist die Vorbereitung der Fermentierungs-Nährmedien wie folgt charakterisiert: man wiegt 40-120g L-Sorbose, 10-50g Maisquellwasser, 10-25g Harnstoff, 0,5-3g KH₂PO₄, 0,2-1,2g MgSO₄ und 0,5-5g CaCO₃ ab, füllt mit Wasser bis zu 1l auf, stellt den pH-Wert auf 6,5-7,5 ein und sterilisiert für 20 Minuten bei 121°C, um die Fermentierungs-Nährmedien zu erhalten; noch besser ist die Vorbereitung der Fermentierungs-Nährmedien wie folgt charakterisiert: man wiegt 80g L-Sorbose, 20g Maisquellwasser, 12g Harnstoff, 1g KH₂PO₄, 0,5g MgSO₄ und 1g CaCO₃ ab, füllt mit Wasser bis zu 1l auf, stellt den pH-Wert auf 7,0 ein und sterilisiert für 20 Minuten bei 121 °C, um die Fermentierungs-Nährmedien zu erhalten.