CN1621518A - 一种l－山梨酮脱氢酶及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种L－山梨酮脱氢酶及其编码基因与应用。本发明所提供的L－山梨酮脱氢酶，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质或与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少80％同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。L－山梨酮脱氢酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。携有本发明的L－山梨酮脱氢酶的编码基因的E.coli工程菌与2－KGA转化菌共培养时，本发明的rSNDH显著提高2－KGA的转化率。

Description

一种L-山梨酮脱氢酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种L-山梨酮脱氢酶及其编码基因与表达方法、应用。
背景技术
2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)是合成抗坏血酸(维生素C)的重要中间体，已知有多种微生物能将L-山梨醇/山梨糖转化为2-KGA。如Stoddard等所用的NRRL B-21627(美国专利US 5834231)，T.Hoshino等所提到的DSM4025(欧洲专利EP9611500.8)，尹光琳等提到的SCB329等(中国专利96116464.6)。
有多篇文献报道用微生物能够将L-山梨糖转化为2-KGA，美国专利3907.639公开了属于醋菌属、假单孢菌、沙雷氏杆菌、葡萄状球菌、气杆菌、产碱杆菌、青霉菌、假丝酵母以及葡萄糖酸菌的微生物具有上述转化活性。Kitamura等(EuropeJ.Appl.Microbiol.2.1.1975)报道在氧化葡萄糖杆菌生黑亚种IF03293中发现的L-山梨酮氧化酶的酶活性既不需要辅酶也不需要电子受体，Makover等(Biotechnol.Bioeng，17.1485.1975)也报道L-山梨酮脱氢酶(SNDH)活性存在于假单孢菌putida ATCC21812及氧化葡萄糖杆菌生黑亚种IF03293并指出NAD或NADP不是其辅酶。Fujiwara等(美国专利4902617)所发现的SNDH分子量为190000±20000道尔顿，由4个亚基组成，来源为氧化葡萄糖酸菌，美国专利5085993发现的SNDH来源于假单孢菌putida，其分子量约为47000道尔顿，在基因水平仅有YashimasaSaito等(Biotechnology and Bioengineering，Vol，58，NOS APRIL 20/May 5 1998)在氧化葡萄糖酸菌T-100中克隆出SNDH基因，该SNDH由498个氨基酸组成。
对比化学合成法生产维生素C的七步化学反应，用微生物经2步发酵由山梨醇生成2-KGA，再经甲醇酯化生成维生素C是目前中国通用的方法。但在2步发酵中使用了3种微生物，即在由L-山梨糖到2-KGA的转化过程中有2种微生物参与，其中一个是转化L-山梨糖为2-KGA的产酸菌。有生产应用价值的氧化葡萄糖酸杆菌通常单独生长较慢，2-KGA的转化率较低，所以目前工业生产应用的均是采用两菌共生，如枯草杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等与产酸菌共同发酵。而在实际生产中仍存在相当多的问题，比如转化率低、工艺控制较为复杂等。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种L-山梨酮脱氢酶及其编码基因。
本发明所提供的L-山梨酮脱氢酶，名称为rSNDH，是具有序列表中SEQ ID No：2氨基酸残基序列的蛋白质或与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少80％同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。
所述SEQ ID №：2来源于酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCCNo.M203094)，由429个氨基酸残基组成。
酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104，已于2003年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC No.M203094。
所述与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少80％同源性且具有与SEQID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质优选为与SEQ ID №：2具有至少90％同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质，尤其优选为将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。
所述L-山梨酮脱氢酶可为将与序列表中SEQ ID №：1具有至少80％同源性的序列在宿主菌大肠杆菌或毕赤酵母中表达得到的蛋白质。
一种L-山梨酮脱氢酶的编码基因，名称为rSNDH，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列，其中，优选为与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
所述SEQ ID №：1来源于酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCCNo.M203094，由1290个碱基组成，该基因的开放阅读框架(ORF)为自5’端第1到第1290位碱基。
含有本发明基因的表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和细胞系(工程菌)：如，含有本发明基因大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌TOP10或毕赤酵母X-33。也可用常规方法将含有本发明基因的上述工程菌固定于不同的载体中，制备固定化细胞。
可将本发明的L-山梨酮脱氢酶固定在琼脂糖、丙烯酰胺、藻酸钠等支持物上，制备固定化酶。
本发明的第二个目的是提供一种表达L-山梨酮脱氢酶的方法。
本发明所提供的表达L-山梨酮脱氢酶的方法，是将以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094基因组DNA为模板扩增得到的L-山梨酮脱氢酶的编码基因导入表达宿主菌，得到阳性克隆，培养阳性克隆，表达L-山梨酮脱氢酶。
其中，酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094基因组DNA可按常规方法提取。以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCCNo.M203094基因组DNA为模板扩增L-山梨酮脱氢酶基因的一对引物可为序列表中SEQID№：3和SEQ ID №：4、SEQ ID №：5和SEQ ID №：6或SEQ ID №：7和SEQ ID№：8。
其中，SEQ ID №：3由26个碱基组成，SEQ ID №：4由24个碱基组成，SEQ ID№：5由32个碱基组成，SEQ ID №：6由24个碱基组成，SEQ ID №：7由35个碱基组成，SEQ ID №：8由24个碱基组成。
所述阳性克隆可为含有L-山梨酮脱氢酶编码基因的大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌TOP10或毕赤酵母X-33。
本发明的L-山梨酮脱氢酶不依赖辅酶NAD，但辅酶NAD的存在能够提高该酶的转化效率，该酶将L-山梨酮转化为2-KGA的PH范围为5.0-9.0，最适为7.5。
本发明通过对酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094的全基因组序列测定，经基因注释，预测出与2-酮基-L-古龙酸合成有关的关键酶基因-L-山梨酮脱氢酶基因(rSNDH)。其DNA序列与所有已知的L-山梨酮脱氢酶基因序列相比同源性很低，翻译成蛋白后与紅色非硫黄細菌(Rhodobacter sphaeroides)有68％的同源性，与丁香假单胞菌SNDH有53％同源性，与苜蓿根瘤菌SNDH有50％同源性，而与另一种维生素C生产用菌氧化葡萄糖酸杆菌中的SNDH基本无同源性。用分子生物学手段将该基因表达于不同的载体及宿主中所产生的蛋白(酶)均能在体外有效地将L-山梨酮转化为2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)，不论任何形式表达的SNDH(包含体，分泌蛋白，融合蛋白)均在体外具有SNDH酶活性，同时，携有本发明的rSNDH编码基因的E.coli工程菌与2-KGA转化菌共培养时，本发明的rSNDH显著提高2-KGA的转化率，本发明的rSNDH编码基因为2-KGA合成中的关键酶基因。可利用本发明的L-山梨酮脱氢酶基因对现有的2-KGA产生菌进行改造、定向育种，提高2-KGA的产量，如将本发明的L-山梨酮脱氢酶基因或其突变体或片段插入现有的2-KGA产生菌基因组中，以增强L-山梨酮脱氢酶的活性，或用分子生物学手段表达本发明的L-山梨酮脱氢酶基因，利用固定化酶法或固定化细胞法在体外合成2-KGA，或合成本发明的L-山梨酮脱氢酶基因对应的蛋白质用于2-KGA的生产，降低2-KGA的生产成本、提高2-KGA的转化率、减少对环境的污染、减少生产过程对能源的需求、提高产品的质量。本发明具有重要的工业应用前景。
附图说明
图1为L-山梨酮脱氢酶基因的PCR扩增产物的电泳图谱
图2为L-山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达产物的SDS PAGE图谱
图3为L-山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌TOP10中表达产物的SDS-PAGE图谱
图4为L-山梨酮脱氢酶基因在毕赤酵母X-33中表达产物的SDS-PAGE图谱
图5为阳性克隆大肠杆菌TOP10融合表达的rSNDH的活性曲线
图6为阳性克隆大肠杆菌TOP10融合表达的rSNDH的Chelating-SFF层析纯化结果
图7为rSNDH的酶活性与pH的关系曲线
图8为rSNDH酶在辅酶存在条件下反应0时间的HPLC图谱
图9为rSNDH酶在辅酶存在条件下反应5小时的HPLC图谱
图10为L-山梨酮和2-酮基-L-古龙酸标准品的HPLC图谱
图11为rSNDH酶在没有辅酶存在条件下反应5小时的HPLC图谱
图12为rSNDH酶在没有辅酶存在条件下将L-山梨酮转化为2-KGA的质谱图
图13为2-KGA标准品的质谱图
具体实施方式
实施例1、L-山梨酮脱氢酶基因rSNDH的获得
华北制药集团有限责任公司维生素C生产用菌株酮古龙酸菌(Ketogulonigeniumsp.)WB0104 CCTCC No.M203094，用于发酵法将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，后者是维生素C的重要前体。收集对数生长期的酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0 104(CCTCC No.M203094)，用HPLC方法检测其培养上清中含有2-酮基-L-古龙酸，该HPLC方法中所用的仪器及试剂有：Waters 515高效液相泵两台，Alltech 2000型ELSD；乙腈(HPLC级)；三氟乙酸(分析纯)；Milli Q plus纯水。ELSD雾化气为N2，流速2.51/min，漂移管温度100℃；色谱柱为Thermo Quest APS2 4.6mmi.d.×25cm 5μm；流动相：乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液(梯度)，流速1.3ml/min。进样量20ul。对照品：L-山梨糖，2-酮基-L古龙酸。以细菌基因组DNA提取方法(《精编分子生物学实验指南》科学出版社.39页)提取基因组DNA，按全基因组鸟枪法进行基因组序列测定(Fleischmann RD，Adams MD，et al.Science.1995.269(5223)：496-512)，共进行35000个反应；测序总长度达18M，为其染色体DNA近6倍的覆盖率。然后用PHRED-PHRAP，GLIMMER软件包拼接注释和进行ORF预测根据基因注释结果，预测L-山梨酮脱氢酶基因rSNDH序列为SEQ ID №：1，编码一个由429个氨基与紅色非硫黄細菌(Rhodobacter sphaeroides)SNDH有68％的同源性，与丁香假单胞菌SNDH有53％同源性，与苜蓿根瘤菌SNDH有50％同源性，而与另一种维生素C生产用菌氧化葡萄糖酸杆菌中的SNDH基本无同源性。
实施例2、L-山梨酮脱氢酶基因rSNDH的表达
1、PET-11B(Strategene)表达rSNDHPET11B表达引物：
5’引物：GACATATGAGCGTTCTGGCCAAATTC(SEQ ID №：3)
3’引物：CAGGATCCTTACGCAGCGGAAATC(SEQ ID №：4)
以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)基因组DNA为模板进行PCR反应，50μl体系中含有终浓度为1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，各0.2μmol/L的5’引物和3’引物，10mmol/L Tris-HCl，2u TaqDNA聚合酶；PCR反应条件为：94℃ 5分钟；然后在如下条件下进行30个循环：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟；72℃10分钟。PCR产物电泳结果如图1所示，表明PCR产物大小为1.3Kb。图中，分子量标准(marker)从小到大依次为250，500，750，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，5000，6000，8000，10000，a为PET11B表达引物的PCR产物电泳结果。
PCR产物经电泳回收纯化与pGEM-T-VECTOR用T4DNA连接酶连接，然后转化DH5α，挑取白斑，用QIAGEN的MINI质粒提取柱提取质粒并用酶切验证，找出正确插入的pGEM-T-VECTOR-rSNDH质粒后，经NDEI/BAMHI，酶切并琼脂糖电泳回收1.3kb后，与表达载体PET11B连接，转化DH5α，铺平板(含AMP100μg/ml)，挑取克隆并用酶切鉴定，得阳性克隆质粒PET11B-rSNDH。
提取阳性克隆(含质粒PET11B-rSNDH)中的质粒，转化表达用宿主大肠杆菌BL21(DE3)。挑单菌落接种到5mlLB培养基中(含AMP100μg/ml)37℃培养过夜，按1％接种量接种到50mlLB培养基中(含AMP100μg/ml)培养至OD＝0.6-1，加IPTG诱导(终浓度1.0mmol/L)，继续培养4个小时，离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测，结果如图2所示，表明在45000道尔顿处检测到特异条带，说明检测到L-山梨酮脱氢酶基因的表达产物。图中，分子量标准(marker)两条带大小分别为60000，45000；a为诱导前对照，b为诱导后PET11B表达的rSNDH，箭头所指为目的条带。
2、PBAD/THIO-TOPO表达SNDH
PBAD/TOPO THIOFUSION表达系统(Invitrogen)是一种快速高效的克隆表达系统，可以将PCR产物直接用于克隆，不用连接酶处理，5分钟就可完成连接到载体用于表达，而且采用了THIOREDOXIN TRX硫氧还蛋白作为融合肽来表达外源蛋白，使外源蛋白以可溶的活性形式表达。采用PBAD的启动子，用阿拉伯糖作为诱导物。
PBAD/THIO-TOPO表达引物：
5’引物：GAGAATTCGATGAGCGTTCTGGCCAAATTCAC(SEQ ID №：5)
3’引物：GATTACGCAGCGGAAATCCGCCAG(SEQ ID №：6)
PCR反应条件：
94℃5分钟，(94℃1分钟，59℃1分钟，72℃2分钟)30个循环，72℃10分钟。
PCR反应体系：
以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)基因组DNA为模板进行PCR反应，50μl体系中含有终浓度为1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，各0.2μmol/L的5’引物和3’引物，10mmol/LTris-HCl，2uTaqDNA聚合酶。PCR产物电泳结果如图1所示，表明PCR产物大小为1.3Kb。图中，b为PBAD/THIO-TOPO表达引物PCR产物的电泳结果。PCR产物与PBAD/THIO-TOPO直接连接(克隆过程参照INVITORGEN PBAD/TOPO-THIOFUSION表达试剂盒)，然后转化TOP10，挑单菌落接种到5mlLB培养基中(含AMP100μg/ml)37℃培养过夜，用QIAGEN的MINI质粒提取柱提取质粒并用酶切验证，找出正确插入PBAD-rSNDH的质粒后，确定为阳性克隆。
挑阳性克隆单菌落接种到5mlLB培养基中(含AMP100μg/ml)37℃培养过夜，按1％接种量接种到50mlLB培养基中(含AMP100μg/ml)培养至OD＝0.6-1，加阿拉伯糖诱导(终浓度0.02％)，继续培养4个小时，离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示，表明在57000道尔顿处检测到特异条带，说明检测到L-山梨酮脱氢酶基因的表达产物。图中，a为PBAD-rSNDH，分子量标准(marker)从大到小分别为94000，67000，43000，30000；箭头所指为目的条带。
3.毕赤酵母酵母中表达SNDH
(1)L-山梨酮脱氢酶基因导入酵母表达载体
采用INVITROGEN毕赤酵母piczα表达系统，构建在毕赤酵母中表达rSNDH的表达载体piczαA/SND。
设计引物如下：
5’引物：CACTCGAGAAAAGA ATGAGCGTTCTGGCCAAATTC(SEQ ID №：7)
3’引物：CACTCGAGTTACGCAGCGGAAATC(SEQ ID №：8)。
PCR反应条件如下：
94℃3分钟然后30个循环(94℃1分钟，62℃1分钟，72℃2分钟)，72℃10分钟。
以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)基因组DNA为模板进行PCR反应，然后按常规方法将PCR产物连接pGEM-T-VECTOR，转化后挑选白斑菌落，提质粒，测序鉴定。将测序鉴定正确的pGEM-T-rSNDH和piczαA质粒DNA分别用XHOI处理后，试剂盒回收约1200bp和3.3kb的片段，用T4DNA连接酶连接，连接产物转化转化DH5α感受态菌，涂在LB平板(含ZEOCIN 25μg/ml)。提取质粒，酶切鉴定。挑选连接方向与插入大小都正确的重组质粒piczαA-rSNDH，用QIAGENMIDI质粒提取试剂盒提取质粒，用于转化毕赤酵母。
(2)重组质粒的线性化
将重组质粒20μg piczαA-rSNDH用Sac I单酶切后，用水扩大至300μl体系，等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提1次，上清加1/10体积3M NaAc和2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤后，真空抽干，溶于20μl TE。
(3)感受态酵母宿主细胞的制备
接种毕赤酵母表达宿主菌X-33于5ml YPD培养基中，30℃振摇过夜，次日转到500ml新鲜YPD培养基中，30℃振摇培养至A600nm≈1.3-1.5，4℃ 5000rpm离心5min，弃上清，分别以500ml、250ml冰冷灭菌水及20ml冰冷1M山梨醇重悬洗涤菌体，将细胞重悬于1ml冰冷1M山梨醇中，制备成感受态。
(4)电转化
将100μl感受态细胞与5-10μg线性化的重组质粒混合，转入0.2cm电转杯，冰浴5min，于Bio-Rad Gene Pulser电转仪1500V，25μF，200Ω条件下电转化，立即加入1ml冰浴1M山梨醇，取100μl涂布于YPDS含ZEOCIN(Invitrogen)100μg/ml选择平板上，30℃孵育2-3d，出现转化子。
(5)阳性克隆的直接PCR检测
接种转化子单菌落于10μl无菌水中，加入5μl溶细胞酶(5U/μl)，30℃振摇10min，置于液氮气相1min，室温下解冻后直接用作模板，用一对检测引物α-Factor和3’AOX1(Invitrigen easy select Pichia Expression Kit Manual)进行PCR检测，结果检测到L-山梨酮脱氢酶基因。
(6)表达实验
接种转化子单菌落于50mlBMGY培养基于30℃培养至A600nm≈4.0时，每日补甲醇，氨水，诱导表达6d，样品离心收集上清，SDS-PAGE分析，结果如图4所示，表明在45000道尔顿处检测到特异条带，说明检测到L-山梨酮脱氢酶基因的表达产物。图中，箭头所指为rSNDH，分子量标准依次为94000，67000，43000，30000，20100。
实施例3、L-山梨酮脱氢酶基因功能验证
1、以NAD为辅酶，酶活性测定
实施例3、L-山梨酮脱氢酶基因功能验证
1、以NAD为辅酶，酶活性测定
参照文献(Agri.Biol.Chem.54(5)1211-1218，1990)和SugiSANA等(Agric，Biol，Chem，55，363-370，1991)，以L-山梨酮为底物、NAD为电子受体，测定波长340nm处的光吸收值。所建立的以L-山梨酮为底物，以NAD为辅酶的酶活活性测定方法：基本反应液由L-山梨酮2.0mg，NAD 0.4mg，PB 50mM，pH7.0组成，在25℃水浴条件下，分别加入实施例2中三种表达系统所表达的L-山梨酮脱氢酶(rSNDH)粗酶0.1mg/ml各10ul，总体积820ul，阳性克隆酵母X-33选上清液，阳性克隆大肠杆菌BL21(DE3)和TOP10菌体破壁去上清，测定340nm处光吸收的变化率，测定结果显示各种形式表达的rSNDH均有活性，其中在阳性克隆大肠杆菌TOP10融合表达的rSNDH的活性如图5所示，表明融合rSNDH有酶活活性，酶活力为0.1217u/mg。远高于文献报导的粗酶活性(48.5mu/mg)。(酶活力单位定义为每分钟催化还原1uMol NAD所需的酶量。经测定表明该酶将L-山梨酮转化为2-KGA的PH范围为5.0-9.0，其中最适作用PH为7.5，如图7所示。
2.rSNDH对L-山梨酮的体外转化
通过Chelating-SFF层析对阳性克隆大肠杆菌TOP10融合表达的rSNDH进行纯化，其中层析柱：1.6×10cm，亲和离子：Ni2+，层析条件：50mM PB缓冲液，pH7.0，咪唑(Imidazole)梯度。纯化结果如图6所示，箭头所指为纯化的rSNDH，分子量约为57000，分子量标准依次为94000，67000，43000，30000，20100。
按常规方法进行了rSNDH对L-山梨酮的体外转化试验，反应体系：缓冲液：50mMPB，pH8.0，L-山梨酮：5mg/ml，rSNDH酶：0.08mg/ml，NAD：0.5mg/ml。37℃反应5小时，产物2-KGA以HPLC方法定量测定，结果如图8、9、10和11所示，表明rSNDH在体外将L-山梨酮转化为2-KGA，辅酶NAD的存在有效地提高2-KGA的转化率。图中2-KGA的标准品浓度为：2mg/ml；L-山梨酮的标准品浓度为：2mg/ml；在无辅酶存在的条件下，2-KGA的生成浓度为0.86mg/ml；在有辅酶存在的条件下，2-KGA的生成浓度为：1.42mg/ml。其中对无NAD参与反应的转化试验用LS-MS验证2-KGA的产生(电喷雾电离源：ESI，电喷雾电压：3.0KV，电喷雾接口干燥气：N2，流速：250L/hr，脱溶剂温度：190℃，碰撞诱导解离电压：30V，离子源温度：120℃)，结果如图12和13所示，证明有2-KGA的特征吸收。
实施例4、表达rSNDH的宿主与酮古龙酸菌WB0104共培养
将培养好的酮古龙酸菌WB0104种液及含有或无PBAD-rSNDH质粒的E.coli TOP10混合(10∶1)共3ml(含L-山梨糖2.0％)接种到20ml发酵培养基中，发酵瓶培养基：L-山梨糖8.0％，酵母膏0.2％，玉米浆2.0％，尿素1.2％，KH2PO40.1％，MgSO4.7H2O0.01％，轻质碳酸钙0.5％。在29℃，200rpm条件下培养，在24h测定古龙酸含量、40h左右取样测发酵液体积、测定L-山梨糖(蒽酮法)和2-酮基-L-古龙酸含量(HPLC法)，根据L-山梨糖含量确定发酵终点取样时间，并计算最终转化率。结果如表1所示，表明rSNDH的表达显著提高2-KGA的转化率。
Figure A20031011683100121
表1酮古龙酸菌WB0104和PBAD-rSNDH对L-山梨糖的转化
   24h产酸(mg/ml)    40h产酸(mg/ml)    终点酸(mg/ml)     残糖(mg/ml)     体积(ml)    转化率(％)    周期(h)
酮古龙酸菌WB0104和PBAD-rSNDH top10     34.95     61.65     64.32     0.83     23.3   83.78     44
酮古龙酸菌WB0104和PBAD-rSNDH top10(在5h加入阿拉伯糖)     36.77     63.39     67.25     0.51     23.6   88.72     43
酮古龙酸菌WB0104和top10(在5h加入阿拉伯糖)     33.82     60.73     63.94     0.65     23.4   83.64     44
注：阿拉伯糖的终浓度为0.02％
                                序列表
<160>8
<210>1
<211>1290
<212>DNA
<213>酮古龙酸菌WB0104(Ketogulonigenium sp.)
<400>1
atgagcgttc tggccaaatt cacttccatc gtcggcggcg tcatggtgct gctgcgtcgc    60
ggtcagacgc ctgcgcaaca ggcctttggc gcaacgccca gcatcccgcc tgcgcgcgaa   120
cagggcatta tgaccctgaa aatgcccagc gccaaaggct gggagccggg gcacaagccc   180
gtcgccgcac cgggtttgca ggtgaatgcc tatgccatgg gccttgacca tccgcgctgg   240
ctgcatgtgc tggacaatgg cgatgtactg gtggccgaaa gctcgaacaa ggcgcgcaag   300
ccgcgtagtt tcatggatca cgcacaggtc gcgacgatgc gccgtgccgg cgcgctgggc   360
gaaagcgcga accggattac ccgcctgagc gatccggcgg gcacgggcac ggcgagtgat   420
agccgcgtgt tcttgcagga tctgaaccaa cccttcggca tggccgtggt gggggatcgt   480
ttctttgtcg gcaataccga tggtgtggtc gcctttgctt tcgatacggc cacgcagcag   540
gctgttggcg ctggcgccaa actggtggat ttcaaacctg gtggccactg gacacgcagc   600
ctgctggcct cgcaggatgg gcgcaagctc tatgcgggcg tcggttcgct gtcgaatatc   660
ggtgatcaag gtatggaggc cgaagaaggc cgcgccgccg tttgggagct ggatctggac   720
accggcgccg cgcgcatctt tgcgggcggt ctgcgcaatg ccgtcggcct tgcatgggag   780
ccgacgaccg gcgccctctg gaccgtggtg aacgagcgcg acgggctggg cgacgagacc   840
ccgcccgact acctgacatc ggtgcaggac ggcggctttt atggctggcc ctatagctat   900
tgggacaaga tcgtcgatga tcgcgtgccg caagacgcag gcctggtcgc ccgttcgatc   960
acgcccgatt acgcgctggg cgggcatacc gcgtcgctgg gcctgtgctg gatgccagcg  1020
ggcacactgc cggggctgcc ggacgggatg gtgatcggtc agcacggctc atggaaccgc  1080
gcgaaactca gcggctataa ggtggtcttt gtgccgtttg aaaatggccg cccctcgggc  1140
cccagcgtcg atctgctgtc gggctttttg tcggatgatg aaaagcaatc ctatggccgc  1200
ccggtggggg ttgtcgtcgg gccggatcag cgatccattc tggtcgccga tgatgtcggc  1260
aatgcgatct ggcggatttc cgctgcgtaa                                   1290
<210>2
<211>429
<212>PRT
<213>酮古龙酸菌WB0104(Ketogulonigenium sp.)
<400>2
Met Ser Val Leu Ala Lys Phe Thr Ser Ile Val Gly Gly Val Met Val
1               5                   10                  15
Leu Leu Arg Arg Gly Gln Thr Pro Ala Gln Gln Ala Phe Gly Ala Thr
            20                  25                  30
Pro Ser Ile Pro Pro Ala Arg Glu Gln Gly Ile Met Thr Leu Lys Met
        35                  40                  45
Pro Ser Ala Lys Gly Trp Glu Pro Gly His Lys Pro Val Ala Ala Pro
    50                  55                  60
Gly Leu Gln Val Asn Ala Tyr Ala Met Gly Leu Asp His Pro Arg Trp
65                  70                  75                  80
Leu His Val Leu Asp Asn Gly Asp Val Leu Val Ala Glu Ser Ser Asn
                85                  90                  95
Lys Ala Arg Lys Pro Arg Ser Phe Met Asp His Ala Gln Val Ala Thr
            100                 105                 110
Met Arg Arg Ala Gly Ala Leu Gly Glu Ser Ala Asn Arg Ile Thr Arg
        115                 120                 125
Leu Ser Asp Pro Ala Gly Thr Gly Thr Ala Ser Asp Ser Arg Val Phe
    130                 135                 140
Leu Gln Asp Leu Asn Gln Pro Phe Gly Met Ala Val Val Gly Asp Arg
145                 150                 155                 160
Phe Phe Val Gly Asn Thr Asp Gly Val Val Ala Phe Ala Phe Asp Thr
                165                 170                 175
Ala Thr Gln Gln Ala Val Gly Ala Gly Ala Lys Leu Val Asp Phe Lys
            180                 185                 190
Pro Gly Gly His Trp Thr Arg Ser Leu Leu Ala Ser Gln Asp Gly Arg
        195                 200                 205
Lys Leu Tyr Ala Gly Val Gly Ser Leu Ser Asn Ile Gly Asp Gln Gly
    210                 215                 220
Met Glu Ala Glu Glu Gly Arg Ala Ala Val Trp Glu Leu Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Thr Gly Ala Ala Arg Ile Phe Ala Gly Gly Leu Arg Asn Ala Val Gly
                245                 250                 255
Leu Ala Trp Glu Pro Thr Thr Gly Ala Leu Trp Thr Val Val Asn Glu
            260                 265                 270
Arg Asp Gly Leu Gly Asp Glu Thr Pro Pro Asp Tyr Leu Thr Ser Val
        275                 280                 285
Gln Asp Gly Gly Phe Tyr Gly Trp Pro Tyr Ser Tyr Trp Asp Lys Ile
    290                 295                 300
Val Asp Asp Arg Val Pro Gln Asp Ala Gly Leu Val Ala Arg Ser Ile
305                 310                 315                 320
Thr Pro Asp Tyr Ala Leu Gly Gly His Thr Ala Ser Leu Gly Leu Cys
                325                 330                 335
Trp Met Pro Ala Gly Thr Leu Pro Gly Leu Pro Asp Gly Met Val Ile
            340                 345                 350
Gly Gln His Gly Ser Trp Asn Arg Ala Lys Leu Ser Gly Tyr Lys Val
        355                 360                 365
Val Phe Val Pro Phe Glu Asn Gly Arg Pro Ser Gly Pro Ser Val Asp
    370                 375                 380
Leu Leu Ser Gly Phe Leu Ser Asp Asp Glu Lys Gln Ser Tyr Gly Arg
385                 390                 395                 400
Pro Val Gly Val Val Val Gly Pro Asp Gln Arg Ser Ile Leu Val Ala
                405                 410                 415
Asp Asp Val Gly Asn AlaIle Trp Arg Ile Ser Ala Ala
            420                425
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
gacatatgag cgttctggcc aaattc                                  26
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
caggatcctt acgcagcgga aatc                                   24
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gagaattcga tgagcgttct ggccaaattc ac                          32
<210>6
  <211>24
  <212>DNA
  <213>人工序列
  <220>
  <223>
  <400>6
  gattacgcag cggaaatccg ccag                                     24
  <210>7
  <211>35
  <212>DNA
  <213>人工序列
  <220>
  <223>
  <400>7
  cactcgagaa aagaatgagc gtt ctggcca aattc                        35
  <210>8
  <211>24
  <212>DNA
  <213>人工序列
  <220>
  <223>
  <400>8
  cactcgagtt acgcagcgga aatc                                     24

Claims (15)

1、一种L-山梨酮脱氢酶，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质或与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少80％同源性且具有与SEQ ID№：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。
2、根据权利要求1所述的L-山梨酮脱氢酶，其特征在于：所述L-山梨酮脱氢酶是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸序列的蛋白质。
3、根据权利要求1所述的L-山梨酮脱氢酶，其特征在于：所述与序列表中SEQ ID№：2的氨基酸残基序列具有至少80％同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQID №：2衍生的蛋白质为与SEQ ID №：2具有至少90％同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。
4、根据权利要求1所述的L-山梨酮脱氢酶，其特征在于：所述L-山梨酮脱氢酶是将与序列表中SEQ ID №：1具有至少80％同源性的序列在宿主菌大肠杆菌或毕赤酵母中表达得到的蛋白质。
5、一种L-山梨酮脱氢酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
6、含有权利要求5所述基因的表达载体和细胞系。
7、根据权利要求6所述的表达载体和细胞系，其特征在于：所述细胞系为含有L-山梨酮脱氢酶编码基因的大肠杆菌或毕赤酵母。
8、根据权利要求7所述的表达载体和细胞系，其特征在于：所述细胞系为固定化细胞。
9、一种表达L-山梨酮脱氢酶的方法，是将以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094基因组DNA为模板扩增得到的L-山梨酮脱氢酶的编码基因导入表达宿主菌，得到阳性克隆，培养阳性克隆，表达L-山梨酮脱氢酶。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094基因组DNA为模板扩增L-山梨酮脱氢酶基因的一对引物为序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：4、SEQ ID №：5和SEQ ID №：6或SEQ ID №：7和SEQ ID №：8。
11、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述阳性克隆为含有L-山梨酮脱氢酶基因的大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌TOP10或毕赤酵母X-33。
12、权利要求1至4任一所述的L-山梨酮脱氢酶在将L-山梨酮转化为2-KGA过程中的应用。
13、权利要求5所述的L-山梨酮脱氢酶的编码基因在将L-山梨酮转化为2-KGA过程中的应用。
14、权利要求6至8任一所述的含有L-山梨酮脱氢酶的编码基因的表达载体和细胞系在将L-山梨酮转化为2-KGA过程中的应用。
15、权利要求5所述的基因在增强L-山梨酮脱氢酶活性中的应用。
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