CN1800349A - 在酵母胞浆内合成聚羟基烷酸酯 - Google Patents

Abstract

用于生产聚羟基烷酸酯(PHA)的转基因酵母菌株和方法。在一些野生型酵母菌株、pex5突变体和fox3突变体的胞浆内表达经遗传学加工的食油假单胞菌聚羟基烷酸酯(PHA)聚合酶。PHA的组成受酵母宿主的遗传学背景、聚合酶的单体特异性、其中聚合酶为活化的细胞区域、以及培养基中所供应的底物的影响。提供了培养策略和进一步的代谢途径加工技术。这个平台提供了控制所合成的PHA的组成以及特性的基础。

Description

在酵母胞浆内合成聚羟基烷酸酯

技术领域

本发明涉及聚羟基烷酸酯的生物合成，并更具体地涉及用于生产聚羟基烷酸酯的改良微生物株。

背景技术

美国的塑料制品在1986年超过了220亿公斤，在1991年超过了270亿公斤，在1997年达到了350亿公斤。所生产的这些塑料的近1/3都被用于短期的一次性应用例如包装。因此，城市所产生的固体废物通常包含7％(重量)的塑料或18％(体积)的塑料。

绝大多数这些合成的聚合材料是不容易被生物降解的，因为微生物通常不含有消化非天然存在的结构所需的酶，这些结构包括塑料中的绝大多数单体和具有左手或“L”构型的手性单体。事实上，绝大多数聚合物都被设计为拥有最大的稳定性。

这么大规模的塑料废物的产生带来了巨大的环境和处理问题。在许多城市特别是在美国，垃圾掩埋空间正变得越来越少，并且其容量正在迅速地耗竭。预计每年可能有100万吨塑料残骸被废弃到全球海洋，它们每年杀死了成千上万的海洋动物。可再循环塑料只在有限的范围应用，而且对各种类型塑料的处理和分类上的困难都妨碍了这些塑料的再循环。

这些问题刺激了短周期塑料的发展。生物合成的聚合物-聚羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate，PHA)因其可降解性、生物相容性、良好的成塑料性和力学性能，引起了国际生物工程界的重视。已经有在酵母中合成PHA的途径的报道，其是在过氧化酶体内合成PHA，但是其产量受到了过氧化酶体的数量与体积的限制；同时过氧化酶体系统的诱导十分困难，而且其活性极低。

发明内容

本发明的目的是提供一种在酵母中合成PHA的新途径，即在胞浆中合成PHA，该途径可以完全消除上述的限制；并且充分利用酵母生长快，胞浆中炭通量高的优势。本发明提供了用于生产聚羟基烷酸酯的微生物以及用于生产PHA的改良方法。在一些实施方案中，微生物包括转基因酵母细胞。例如，利用异源PHA聚合酶催化，以聚合一种或多种羟基烷酸的方式在酵母中合成的PHA。酵母细胞的实例包括酵母菌属(Saccharomyces)(例如啤酒酵母(S.cerevisiae))、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或任何其他合适的属的细胞。生物合成的PHA通常积累在酵母内并易被分离。下面更详细地描述了这些实施方案和其他一些所预期的实施方案的一些其他细节。

上面对一些实施方案的概述并非意欲描述本发明的所有实施方案。下面的附图、具体实施方案和实施例更具体地举例说明了这些实施方案。

附图说明

结合以下本发明的各个实施方案的详细描述和附图可以更充分地理解本发明，其中：

图1显示了聚羟基烷酸酯(PHA)的常见结构；

图2是描述了用于PHA聚合酶(phaCl)基因表达的载体；

图3是一种用于大肠杆菌(Escherichia coli)酰基辅酶A脱氢酶(fadE)基因表达的载体；

图4显示了当十二烷酸(C12)被用作为碳源时，对啤酒酵母BY4743生成的PHA的GC-MS(气相色谱和质谱连用)分析；

图5表示在啤酒酵母pex5突变体胞浆内表达的PHA合成途径；

图6显示了当十二烷酸(C12)被用作为碳源时，对啤酒酵母BY4743-YDR244W所生成的PHA的GC-MS分析；

图7显示了当不同的脂肪酸被用作为碳源时，对啤酒酵母BY4743-YDR244W所生成的PHA的GC-MS分析；

图8显示了当十三烷酸和十一烷酸被用作为碳源时，对含有p2TG1T-700的啤酒酵母pex5-3c11所生成的PHA的GC-MS分析；

图9表示当十二烷酸被用作为碳源时，不同的pH值对含有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W所生成的PHA产量和细胞干重(CDW)的影响；

图10是当十二烷酸用作为碳源时对带有p2TG1T-700的啤酒酵母pex5-3c11所生成的PHA的GC-MS分析；

图11显示了质粒pDP-307和p2DP307T的构造；

图12描述了用于scl-PHA合酶(phbC)基因表达的载体。

具体实施方式

应当参照附图阅读下面的描述，其中同样的附图标号表示在一些视图中所出现的同样的构件。具体实施方案和附图都举例说明了所申请的发明的具体的实施例。

聚羟基烷酸酯(PHA)是一大类由微生物天然合成的聚合物，通常作为碳源、能量和还原等效物的储存物质。因为其具有广泛的潜在应用价值、而且可以由可再生的能源合成、同时作为生物可降解的和具有生物相容性的塑料，这类生物化合物已经受到了广泛的关注。PHA是一种有商业前途的聚合物，它能被完全生物降解为二氧化碳和水；它的性能与聚丙烯的性能相似，聚丙烯占美国1986年的聚合物产品的11％；另外，它与人体具有生物相容性，这使得它成为医学植入物的材料之一。目前，主要的研究方向已经集中于设计改良合成“更聪明的”PHA的途径，使其具有更为所需的和更有价值的物理性能。

聚羟基烷酸酯(PHA)是与图1中所示的常见结构相符合的羟基烷酸的聚酯。每个单体都含有碳和羟基官能团。除非R基是氢原子，邻近碳原子都是手性中心。在下面的表中列出了一些PHA的R基和P值。n值通常约为100到30,000。更复杂的PHA可以含有烯烃、分支的、卤化的、苯基、羟基、环己基、酯基或腈R基。在Steinbuchel，Biomaterials：NovelMaterials from Biological Sources，pp.123-213，p.128，Stockton Press：New York(1991)中可找到在微生物合成的PHA中所检测到的组分的列表，在此将其全部内容一同并入作为参考。

表1所选的细菌的聚羟基烷酸酯

聚羟基烷酸酯*聚-3-羟基丙酸酯*聚-3-羟基丁酸酯*聚-3-羟基戊酸酯*聚-3-羟基己酸酯*(或羟基己酸酯)聚-3-羟基庚酸酯聚-3-羟基辛酸酯聚-3-羟基壬酸酯聚-3-羟基癸酸酯聚-3-羟基十一烷酸酯聚-3-羟基十二烷酸酯聚-4-羟基丁酸酯*聚-4-羟基戊酸酯*聚-5-羟基丁酸酯*聚-3-羟基-4-戊烯醇酯*聚-3-羟基-2-丁烯酸酯(不饱和链)*

R--H--CH3--CH2CH3--CH2CH2CH3--CH2CH2CH2CH3--(CH2)4CH3--(CH2)5CH3--(CH2)6CH3--(CH2)7CH3--(CH2)8CH3--H--CH3--H--CH＝CH2--CH3

P111111111122311

^*这些聚合物是短链长度单体的聚羟基烷酸酯

生理学数据和酶研究已经显示有着两种不同类型的PHA：由短链长度碳单体(shortchain length carbon monomers)形成的聚合物(在此称为scl-PHA)和由中等链长度碳单体(medium chain length carbon monomers)生成的聚合物(在此称为mcl-PHA)。“短链长度碳单体”是具有3个碳原子(C3单体)到约5个碳原子(C5单体)的碳单体。短链长度碳单体的实例包括3-羟基丁酸和3-羟基戊酸，它们相应以葡萄糖和丙酸与葡萄糖的混合物作为聚合酶底物所生成。“中等链长度碳单体”是具有约6个碳原子(C6单体)到约14个碳原子(C14单体)的碳单体。中等链长度碳单体的实例包括具有约6个到约12个碳原子的直链3-羟基烷酸，它们是由相应的烷酸单体作为聚合酶底物所形成的。至今已经发现了总共有91种PHA单体。

PHA聚合酶是能催化各成分单体聚合以生成PHA的酶，它在科学文献中也被称为PHA合酶或PHA合成酶。术语“scl-PHA聚合酶”在此指的是能催化包括3到约5个碳原子的单体或前体聚合生成scl-PHA同聚物或共聚物的PHA聚合酶。PHB聚合酶是scl-PHA聚合酶的实例。能用scl-PHA聚合酶合成的生物聚合物包括例如聚(3-羟基丁酸酯)和聚(3-羟基丁酸-共-3-羟基戊酸酯)的PHA。

“mcl-PHA聚合酶”在此指的是能催化包括约6个到约14个碳原子的单体或前体聚合生成mcl-PHA同聚物或共聚物的PHA聚合酶。用mcl-PHA聚合酶所合成的生物聚合物包括聚(3-羟基辛酸酯)(PHO)、聚(3-羟基己酸酯)(PHH)和聚(3-羟基癸酸酯)。

PHA聚合酶可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的PHA聚合酶包括对天然存在的聚合酶进行添加、删除、修饰或突变，这些可能会造成酶多肽序列中的一个或多个氨基酸的变化，但酶的催化活性依然存在，例如通过遗传学加工方法修饰天然存在的聚合酶。例如，本发明的聚合酶可以包括具有信号肽(导向序列)功能的N末端或C末端氨基酸序列，信号肽可以把酶导向细胞的不同部位。PHA聚合酶活性可以是双功能或多功能酶或酶复合物的一部分，因此名词PHA聚合酶包括这些具有PHA聚合酶活性的双功能或多功能的酶。

本发明涉及参与聚羟基烷酸酯生物聚合物的合成途径的异源基因在转基因酵母细胞内的表达。“异源”核酸片段或基因是含有非正常地存在于细胞内的核苷酸序列的核酸片段或基因，例如存在于真核细胞内的原核核苷酸序列。异源基因在此也指的是转基因。“转基因的”在此指的是其中已经被引入含有异源核苷酸序列的核酸片段的生物体。转基因生物体中的转基因是非常稳定的和可遗传的。异源核酸片段可以被或可以不被整合到宿主基因组中。

术语“酵母”在此指的是任何能被遗传学转化的酵母，包括但不限于酵母属(例如啤酒酵母)、毕赤酵母属和克鲁维酵母属等等。

可以以任何常用的方式例如在悬浮液或在固体基质中培养转基因酵母。微生物培养物通常生长在富含营养物的培养基中。本发明的转基因细胞生长在有氧条件下。

本发明的酵母被核酸片段转化，核酸片段可以只包括异源核苷酸序列，或者包括异源核苷酸序列以及与其连接的调节序列。核酸片段可以是环状的或线状的、单链或双链的、也可以是DNA、RNA或它们的任何修饰物或组合物。包括异源核苷酸序列的载体常被用于转化生物体。载体可以是质粒(整合型或自主型)、病毒载体或粘端质粒。对质粒骨架的选择依赖于所形成的构建体的所需的各种特性，例如选择标记物、质粒复制速度等等。

在发明的一些实施方案中，被编码PHA聚合酶的异源核苷酸序列转化的酵母，可以任选地被用另一种或多种异源核苷酸序列转化，其中至少一种异源核苷酸序列编码PHA生物合成中所用的其他的功能性酶，例如酰基辅酶A氧化酶和/或反-2-烯酰基辅酶A水合酶II。被转化的用于生产PHA的酵母还可以被转化来表达或过度表达酰基辅酶A合成酶。不同基因组合都可以表达在酵母中。

发明中的酵母可以是野生型酵母和包括pex5、pex7、pex8、pex13、pex14、pex18、pex21和/或fox3突变体的酵母菌株。酵母还可被进一步地修饰，例如基因敲除其他pex、fox和/或脂肪酸合成途径的基因。

啤酒酵母pex5突变体是可存活的，但蓄积有过氧化物酶体状、小叶样膜结构并且不能输入具有SKL信号肽序列的蛋白，例如过氧化物酶体基质酶Fox2p。酰基辅酶A氧化酶-Fox1p进入过氧化物酶体的途径也是依赖于受体蛋白Pex5p。在pex5突变体中，可在胞浆内发现Fox2p和Fox1p，但是Fox3p位于过氧化物酶体内。进入啤酒酵母内的脂肪酸的活化受到至少四种不同的酰基辅酶A合成酶的催化调控。这些酶中的其中一种酶Faa2p是一种带有类似SKL信号肽序列的过氧化物酶体蛋白，而其他的三种酶没有过氧化物酶体导向信号肽。Faa2p可以在pex5突变体的胞浆内保持活性。转基因的pex5突变体能在胞浆内合成PHA。

可以用一种或多种核酸片段转化宿主细胞，例如可用一个包括编码PHA聚合酶的异源核酸的载体以及包括编码酰基辅酶A氧化酶的异源核酸的第二个载体转化酵母。同样地，在用于转化宿主细胞的同一核酸片段中可存在两种或多种异源核酸，例如当使用双向启动子(divergent promoter)时。PHA聚合酶可以是scl-PHA聚合酶或mcl-PHA聚合酶。编码mcl-PHA聚合酶的核酸序列可来源于食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)。编码scl-PHA聚合酶的核酸序列可来源于罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)。本领域人员很容易地能从蛋白和核酸的数据库例如GENEBANK中得到这些和其他合适基因的核苷酸序列。

用于转化本发明的酵母的核酸片段可包括连接于编码酶的核苷酸序列的启动子序列。启动子是能造成遗传物质转录的DNA片段。转录是根据DNA所含的遗传信息生成RNA链。发明不受使用任何特殊的启动子的限制。启动子的调节信号作用是与细胞内的RNA聚合酶结合启动下游(3’方向)编码序列的转录。如果启动子的确能或可被用于控制或调节核苷酸序列的转录，它通常会被连接于核苷酸序列。在本发明中所用的启动子可以是组成型或诱导型启动子。它可以是但不必须是异源于宿主的。

双向启动子也可被用于引入和调节多个基因。这些启动子容许利用单一的、中心定位的启动子序列来同时调节两个分离的基因。双向启动子的实例包括GAL1-10启动子。半乳糖诱导型启动子GAL1、GAL7和GAL10可用于高水平地表达同源和异源基因。用调节蛋白GAL4和GAL80可在基因表达水平调节GAL1、GAL7和GAL10启动子所启动的半乳糖代谢途径。

异源核苷酸序列可任选地包括启动核酸转译生成酶的起始位点(例如ATG密码子)。它也可任选地包括终止转译的终止序列。终止序列通常是不存在对应的氨基乙酰tRNA并据此终止多肽合成的密码子。异源核苷酸序列还可任选地包括转录终止序列。

用于转化本发明的酵母细胞的核酸片段可任选地包括一种或多种标记物序列，它通常编码基因产物，通常是酶，它可被生长培养基中的化合物所检测或抑制。例如，标记物序列的导入可使得转基因细胞对抗生素产生耐药性，或它能赋予转基因细胞特异代谢某种化合物的能力。例如，可产生卡那霉素、氨苄西林或硫酸巴龙霉素耐药性的标记物序列、在下面的实施例中所描述的URA3选择标记物和HIS3选择标记物、或酵母的补充营养缺陷性突变的各种其他的基因例如G418。

本发明的转基因酵母可包括编码PHA聚合酶的第一异源核苷酸序列以及任选地编码酰基辅酶A氧化酶的第二异源核苷酸序列和编码反-2-烯酰基辅酶A水合酶II还原酶的第三异源核苷酸序列的一种或两种。引入多个基因的一个策略是将多个启动子和基因克隆到单个质粒中。用多个不同的质粒也可引入多个基因。为了维护重组DNA，每个质粒都需要不同的选择标记物。可用整合型或自主型载体将多个基因引入到宿主中。

在酵母中，可将异源核苷酸序列导向于过氧化物酶体中，过氧化物酶体是合成PHA前体的位点的之一。在一些过氧化物酶体蛋白的C末端已经找到了过氧化物酶体导向序列(信号肽)。已经发现具有“SKL基序”的过氧化物酶体信号肽是一种普遍存在于哺乳动物、昆虫、植物和酵母中的过氧化物酶体导向序列(信号肽)。SKL基序包括第一位点上的丝氨酸、丙氨酸或半胱氨酸；第二位点上的组氨酸或精氨酸；以及第三位点上的亮氨酸。已经发现这个序列甚至对于折叠或多单位蛋白都是有效的。在美国专利No.6,103,956(Sriene等)中可发现对过氧化物酶体导向序列的详细综述，在此将其全部内容一同并入作为参考。

在一些实施方案中，在编码酶的异源核苷酸序列中包括将酶导向到酵母过氧化物酶体中的氨基酸序列或信号肽。

用各种技术可将上述的异源核苷酸序列引入到酵母中。可以用电穿孔，或利用表面活性剂和/或二价阳离子盐例如CaCl₂或LiCl₂的化学方法完成转化。

本发明提供了用于控制所合成的PHA的组成以及性能的方法。例如，通过添加适当的底物(例如脂肪酸和甘油)可以控制聚合物中偶数、奇数或偶数和奇数数目的单体的组合。另外，通过与脂肪酸一起添加例如丙酮酸和乙酸的底物也可以影响单体的分布。所提出的策略具有合成新的聚合物的能力，并且使所合成的聚合物具有所需的物理性能。

本发明在胞浆或在过氧化物酶体中由脂肪酸代谢的中间产物合成PHA。酵母宿主、聚合酶的单体特异性、其中聚合酶为活化的细胞区域、培养基中所供应的底物都影响着PHA的组成。发明提供了控制所合成的PHA的组成以及其的性能的方法。

应当明白本发明的公开内容在很多方面都只是举例说明的。只要不超过本发明的范围，就可进行细节上的变化，特别是在形状、大小和步骤排列上的变化。本发明的范围当然是由后附的权利要求书所表达的语言所定义的。

实施例

参照以下的实施例可以进一步地阐述本发明，实施例被用于举例说明部分优选的实施方案，但不以任何的方式限制本发明。

实施例1用于将PHA基因引入到酵母内的载体构建

啤酒酵母表达体系

通常利用整合型或自主型质粒将重组DNA引入到宿主内。整合型质粒通常是通过同源重组事件整合到宿主染色体中的DNA序列。这个事件发生在质粒的导向序列和同源的宿主染色体序列之间。用于靶向整合的同源序列可以是独特的或非独特的序列。独特的导向序列容许整合单一拷贝的转化DNA。已经用这个方法引入重组DNA和通过中断特定基因生成突变体。整合型质粒也可以被靶向于非独特的序列。这些质粒具有多个潜在的整合位点以及单次转化可造成多个拷贝被整合到染色体中。

除了整合型质粒外，通常用自主复制的质粒转运重组DNA。这些能独立于染色体复制的序列正常地是相当小的、环型DNA，但是也已经发展出线性质粒。与整合型质粒不同，自主型质粒必须指导它们自身的复制以及它们自身的分离。这些功能对于保证亲代和子代细胞在细胞分裂后都保留有质粒是必需的。除了分开使用自主型质粒和整合基因外，还可以组合两种体系。

在酵母的质粒表达体系中所用的DNA复制序列可被分为两类：那些依据酵母染色体DNA序列的复制序列和那些依据内源性2-微米环圈的复制序列。

自主复制序列(ARS)是依据染色体的DNA片段。通过复杂的过程，这些序列启动了DNA复制，并且这些序列已经被用于在酵母中获得高频率的转化。已经构建了组合有ARS序列和着丝粒DNA序列(CEN)的质粒。相信CEN序列作用为细胞分裂期间纺锤丝的附着点。

2μm复制起点是保存相当稳定的、高拷贝数目的质粒的最常用的方式。该复制起点来源于内源性啤酒酵母2μm环圈。在多种酵母株中都能找到这个天然的酵母质粒。2μm环圈的不同部分已经用于调节表达载体的复制和分离。常用的部分是2.2kb EcorI片段，它在啤酒酵母的[cir+]株中保持有每个细胞10到40个之间的质粒拷贝。尽管基于2μm的质粒没有基于CEN的质粒那么稳定，但是高拷贝数使得这些质粒在需要高表达水平时是有用的。

因为两个目的，DNA转化体系常采用选择标记物。首先，选择标记物容许在转化后分离重组生物体，其次，选择标记物帮助保证重组种群在培养期间保留有转化DNA。常用的酵母选择标记物被设计为补偿营养缺陷的宿主突变。常见的选择标记物包括补偿在代谢物例如腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或尿嘧啶的合成中所涉及到的突变基因。尽管不很常见，一些酵母选择标记物传递了对广谱抗生素例如G418的耐药性。

啤酒酵母启动子可以被归类于两种大分类之中的一种：组成型或诱导型。组成型启动子连续地指导基因表达，以及发现它通常被用于调节广泛使用的基因例如那些来自糖酵解的基因。对于只在某些环境条件下需要的基因，它的表达通常受诱导型启动子的调节。例如，参与半乳糖代谢的啤酒酵母基因受已被很好研究的诱导型启动子体系的调节。

对于在啤酒酵母中的有效的高水平表达，常需要mRNA终止序列。mRNA稳定性被认为是它的核苷酸序列的一个参数，所以保持mRNA分子尽可能的小以避免任何非必需的失稳定的序列是有用的。

大肠杆菌质粒构建

如在Jackson，Recombinant Modulation of the phbCAB Operon Copy Numberin Ralstoniaeutropha and Modification of the Precursor Selectivity of the Pseudomonas oleovorans PolymeraseI.Masters Dissertation.University of Minnesota.St.Paul，Minn.，(1998)中所描述的那样，构建含有来自食油假单胞菌的phaCl基因和来自罗氏真养菌的phaB、phaA基因的载体质粒pPT700(图2)。

将过氧化物酶体导向序列(PTS)加入到pPT700中以形成另一个质粒pPT755。质粒pPT755的构建如下：通过PCR克隆pPT700得到phaCl基因。所用的引物是：

5’-ATTATCGATGAGTAACAAGAACAACGATGAG-3’

和

5’-GGAATTCATAGCTTGGAACGCTCGTGAACGTAGG-3’

它们给基因增加了上游ClaI和下游EcoRI限制性酶切位点。3’引物将三个氨基酸肽(SKL)添加到phaCl基因的3’末端。这个I型过氧化物酶体导向序列(-SKL-COOH，PTS1)被用于苹果酸脱氢酶(MDH3)在啤酒酵母的过氧化物酶体内的靶向表达。用ClaI和EcoRI限制性内切酶消化PCR产物，并将其与经同样酶切的pPT700连接以生成pPT755。

啤酒酵母质粒构建体

由含有2μm复制起点、HIS3标记物、TEF1启动子和URA3终止序列的质粒p2TG1T(H)构建出质粒p2TG1T-700(H)(图2)。利用ClaI和EcoRI限制性内切酶消化质粒pPT700(图2)，从中分离得到食油假单胞菌的mcl-PHA聚合酶基因(phaCl)，并将其连接到经相似消化的p2TG1T(H)中。利用ClaI和EcoRI酶切质粒pPT755，从而得到含有PTS1过氧化物酶体导向序列的食油假单胞菌的mcl-PHA聚合酶基因(phaCl)，并将其连接到经相似消化的p2TG1T(H)中以生成p2TG1T-755(H)。

实施例2在啤酒酵母中生产PHA的常用材料和方法

除非有其他的说明，所有的化合物都购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)或FisherScientific(Fair Lawn，NJ)。

菌株

质粒被常规地生长于大肠杆菌菌株DH5α中(Life TechnologiesTM，Gaithersburg，MD)。大肠杆菌品种中心(Yale University，NewHaven，CT)提供了大肠杆菌β-氧化缺陷型菌株。

在下面的表2中列出了所用的啤酒酵母菌株。从Invitrogen(Carlsbad，CA)得到啤酒酵母BY4743、BY4741-YIL160C和BY4743-YDR244W(其为pex5杂合子菌株)。从BY4743-YDR244W孢子生成菌株wt-16-4和pex5-16-2，并根据标准方法(F.Sherman，MethodsEnzymol，350，3-41(2002))杂交两种pex5单倍体菌株制成pex5-3c11。将带有PHA聚合酶基因的啤酒酵母菌株保存于SD培养基(0.67％无氨基酸的酵母氮基、2％葡萄糖和氨基酸)中。

表2.啤酒酵母菌株的列表

名称	基因型	菌株来源
			D603YPH499YPH500BY4743BY4743-YDR244WBY4741-YIL 160Cpex5-3c11pex5-16-2wt-16-4	Mata/αura3-52 lys2-801 met his 3 ade2-101 reg1-501Mata，ura3-52，lys 2-80，ade2-101，trp1-Δ63，his3-Δ200，leu2-Δ1Matα，ura3-52，lys 2-80，ade2-101，trp1-Δ63，his3-Δ200，leu2-Δ1Mata/αhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0Mata/αhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0pex5::kanMX4Matahis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0fox3::kanMX4Mata/αhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0pex5::kanMX4Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0met15Δ0pex5::kanMX4Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0	Carlson et al.(2002)a and Leafetal.(1996)b本发明本发明Cat.#95400-BY4743；InvitrogenCat.#95400-23603；InvitrogenCat.#95400-2319；Invitrogen本发明本发明本发明

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细菌生长培养基

大肠杆菌常规地生长于LB培养基(10g/L Bacto胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)、5g/LBacto酵母浸液(Difco)、10g/L NaCl)或2xYT培养基(16g/L Bacto胰蛋白胨、10g/L Bacto酵母浸液、5g/L NaCl)中。当用Zeo基因作为筛选标记物时，将转化大肠杆菌生长于加有Zeocin(25μg/ml)的低盐LB培养基中。每升低盐LB培养基含有10g胰蛋白胨、5g酵母浸液和5g NaCl，pH为7.5。加入脂肪酸有助于生成PHA。在恰当时，加入氨苄西林或卡那霉素。正常地在30℃或37℃下孵育大肠杆菌培养物。

将野生型啤酒酵母培养物生长于YPAD培养基(10g/L Bactro酵母浸液、20g/L Bactro胰蛋白胨、20g/L葡萄糖、40mg/L硫酸腺嘌呤)中。加入腺嘌呤以抑制ade1和ade2突变体的回复。将转基因酵母菌株生长于SD基本培养基(有或无氨基酸的6.7g/L Bactro酵母氮基、10-20g/L D-葡萄糖)中。进行以下的添加以补偿啤酒酵母BY4743的营养缺陷型突变：20mg/L蛋氨酸、20mg/L亮氨酸和20mg/L组氨酸。为了避免因一些组分的热稳定性不好所产生的问题，过滤消毒(Supor-200滤盘、孔径0.2μm，Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)所有的培养基组分。对于摇瓶和生物反应器试验，使用加浓的SD基本培养基。该培养基可比标准的SD培养基形成更高的生物量。对先前描述的培养基的修改包括：100mg/L腺嘌呤、100mg/L蛋氨酸、150mg/L赖氨酸和80mg/L组氨酸。

PHA生产时，离心收集生长于葡萄糖培养基中的处于生长停滞期的菌体，在水中洗涤细胞一次并将细胞按1∶10稀释重悬于含有0.67％无氨基酸酵母氮基、1％甘油、0.4％Tween80和适宜的脂肪酸的新鲜SOG1培养基中。当培养pex5突变体时，在培养基中加入遗传霉素(G418)。将酵母在SOG1培养基中再培养5-6天，然后收集分析PHA。或用5mM磷酸或5mM柠檬酸缓冲液将培养基的pH值控制在4.5到7.0。

摇瓶培养

在摇瓶研究中，所有的试验条件都被重复三次。将培养物生长于含有50ml培养基的250ml锥形瓶中。以200rpm和30℃下操纵摇床。所有报告的数据都是至少三次摇瓶培养结果的平均值。

PHA检测方法

用多种方法分析大肠杆菌和酵母细胞样本中的PHA的存在和浓度。尼罗红染色颗粒是检测PHA的标准方法。气相色谱法和气象色谱-质谱法提供了存在羟基烷酸衍生物的证据并将其定量化，但是它不能确定出该衍生物是否是聚合的。

尼罗红染色

尼罗红是常被用于检测细菌的PHA颗粒的染料。它染色脂类包括PHA，同时它也是膜可溶性的。离心细菌细胞样本，抛弃上清液。将细胞稀释于150μl ddH₂O中，并加入7μl尼罗红储备液(50mg/ml丙酮溶液)。在混和后，将样本在室温下孵育5分钟。在配有用于检测488nm尼罗红荧光的紫外灯的显微镜下观察染色细胞。

气相色谱法

用丙醇裂解法制备用于气相色谱(GC)分析的样本。将来一定容积的湿细胞沉淀到螺旋口的玻璃试管中。用3到5ml丙酮洗涤，并干燥过夜。然后加入0.5mL 1，2-二氯乙烷(Fisher)、0.5mL含有20％HCl(Fisher)和80％1-丙醇(Fiesher)的酸化丙醇溶液、以及50μL 2mg/mL苯甲酸(Sigma)作内标准物。将试管封口并在沸水池中加热2到3小时。在试管已经被冷却到室温后，往每个试管中加入1mL无离子水以萃取PHA。将试管充分地混和，将所形成的有机相转移到用于GC分析的注射瓶中。

将样本注射到配有Hewlett Packard 7673A自动注射器的Hewlett Packard 5890A气相色谱仪中。采用了具有30m长和0.05μm薄膜厚度的融化二氧化硅毛细血管柱DB-WAX30W(J&W Scientific)，用火焰电离检测器检测所分离到的组分。所用的温度值为60℃0.5分钟，以每分钟增加10℃的速度增加15分钟并在210℃保持15分钟。

通过计算被苯甲酸峰的区域所除的PHA峰的区域的商(Q)以及将Q值结果与一系列PHA标准溶液进行比较，确定出样本瓶内的PHA含量。

气相色谱-质谱法

如在前述的小节中所描述的那样，制备用于气相色谱-质谱法(GC-MS)的样本。将样本注射到配有DB-WAX柱的气相色谱-质谱仪中。GC-MS提供了类似于GC单独所生成的气相色谱频谱。在上述的酸化丙醇裂解制品期间，PHA被分解为它的组成单体，它们每个都与丙醇形成酯。在质谱测定法中，气化并片段化所形成的分子，所造成的离子片段的模式形成了指纹，通过该指纹可以鉴定出分子。代表甲基缺失的质谱131和代表丙基缺失的质谱81被用作诊断峰(表3)。

表3.PHA片段质谱

片段结构	质谱
		-CH(OH)CH2C(O)OCH2CH2CH2-C(O)CH2CH(OH)CH3	13187

核磁共振波谱法

质子核磁共振波谱法(¹H-NMR)被用于验证存在聚合物而不是只存在它的组成单体或另一种羟基烷酸衍生物。称量并低压冻干生长于摇瓶培养基中的细胞样本。通过用氯仿在Soxhlet萃取器(Kimex)中回流2天从细胞中提取出PHA。蒸发所形成的氯仿溶液并将残留物重悬于2.5ml氯仿中并用甲醇稀释到12.5ml以生成1∶5氯仿∶甲醇溶液。在形成沉淀24小时后，将溶液在4,000x g下离心15分钟。在甲醇中轻轻洗涤所倒出的沉淀物，并将其重悬于0.75ml氘化氯仿(Sigma)中。然后将样本转移到氘化氯仿冲洗的NMR试管中，并用300MHzNicolet NT-300WB Ff-NMR分析样本。

实施例3新的具有独特性能的聚羟基烷酸的合成途径

我们通过在酵母中表达能聚合中等链长度(R)-3-羟基前体分子(mcl-PHA)的聚合酶导致了中等链长度mcl-PHA的形成。这些被加工的酵母被证实能在胞浆内合成由6-13个碳原子的单体(C6-C13)所组成的PHA。通常mcl-PHA单体来自于过氧化物酶体中的β-氧化途径生成的代谢物。因此，这个结果说明β-氧化途径并不只是被限定于过氧化物酶体内，它在酵母的胞浆内也可表现出功能性。在过氧化酶体内合成PHA的产量受到了过氧化酶体的数量与体积的限制；同时过氧化酶体系统的诱导十分困难，而且其活性极低。如果能在胞浆中合成PHA，则可以完全消除上述的限制。我们的这个发现可使PHA合成过程更为经济，并为合成具有独特材料性能的聚合物提供了代谢加工策略。

材料和方法

菌株和培养基

在大肠杆菌DH5α中保存并繁殖所有的质粒。从Invitrogen得到啤酒酵母株BY4743(Mata/αhis3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0)。在SD培养基(0.67％无氨基酸的酵母氮基、2％葡萄糖和氨基酸)中保存带有PHA聚合酶质粒的啤酒酵母。生产PHA时，离心收集生长于葡萄糖培养基中的处于生长停滞期的菌体，在水中洗涤细胞一次并将细胞按1∶10稀释重悬于含有0.67％无氨基酸的酵母氮基、1％甘油、0.4％Tween 80和脂肪酸的新鲜SOG1培养基中。将培养物在SOG1培养基中再生长5-6天，然后在收集分析PHA。用5mM柠檬酸缓冲液将培养基的pH值维持在5。

克隆过程

在实施例1中描述了以及在图2中描绘了质粒p2TG1T-700(H)和p2TG1T-755(H)。

对PHA的分析

用在实施例2中所描述的气相色谱-质谱法分析研究胞浆PHA。

结果

食油假单胞菌PHA聚合酶在酵母胞浆内的表达

在这个实施例中，在啤酒酵母BY4743的胞浆内表达食油假单胞菌PHA聚合酶。质粒p2TG1T-700含有高拷贝数的酵母2μm复制起点和HIS3选择标记物。PHA聚合酶是处于组成型TEF1启动子和URA3转录终止序列的控制下。p2TG1T-755(H)与p2TG1T-700(H)结构基本一样，除了其带有的食油假单胞菌聚合酶被修饰成含有先前描述的I型过氧化物酶导向序列。

中等链长度(MCL)-PHA的生成

按照在材料和方法中所描述方法的培养重组酵母，并将十二烷酸(C12)用作为碳源。Mcl-PHA聚合酶的胞浆表达造成了PHA的生成，PHA蓄积到总的细胞干重(CDW)的近0.014％。图4显示当十二烷酸(C12)被用作为碳源时，对啤酒酵母BY4743所生成的PHA的分析。只显示了具有质荷比值为131的峰。图4A显示了对野生型啤酒酵母BY4743的GC-MS分析。图4B显示了对具有质粒p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743的GC-MS分析。C12PHA(聚3-羟基十二烷酸)峰、C10(聚3-羟基癸酸)峰、C8(聚3-羟基辛酸)和C6(聚3-羟基己酸)峰都清晰可见。所有峰的质荷比都与具有食油假单胞菌PHA聚合酶的大肠杆菌所生成的PHA进行比较。导向过氧化物酶体的PHA聚合酶菌株(BY4743/p2TG1T-755(H))被用作为阳性对照。在相同的条件下，该菌株在过氧化物酶体中所蓄积的MCL-PHA最多到CDW的0.054％(图4C和表4)。

表4当偶数脂肪酸被用作为碳源时，啤酒酵母BY4743所生成的PHA含量和单体组成。

碳源	质粒	PHA含量(占CDW的％)	PHA组成％，w/w
							C12	C10	C8	C6
			十二烷酸(C12)十二烷酸(C12)油酸(C18)油酸(C18)	p2TG1T-700p2TG1T-755p2TG1T-700p2TG1T-755	0.0147±0.00110.0539±0.0041nd0.0385±0.0076	58.638.7nd47.1					16.623.8nd23.2	22.929.9nd23.9	1.97.6nd6.7

nd：未检测到

酵母胞浆生成的MCL-PHA的组成

为了确定碳源对PHA单体组成的影响，将重组酵母培养在含有以下一种脂肪酸的SOG1培养基中：油酸、十三烷酸(C13)、十二烷酸(C12)和十一烷酸(C11)。表4和5显示所蓄积的PHA的组成是依赖于外来添加的脂肪酸的性质。当十二烷酸(C12)被用作为碳源时，C12PHA是PHA的主要成分。总PHA的约58％是由C12单体所组成的，但没有检测到C14PHA(表4)。在具有质粒p2TG1T-755(H)的酵母BY4743中，由于油酸在过氧化物酶体内被降解，因此导向过氧化物酶体的PHA聚合酶将显著量的C10-C6单体整合到PHA内。

同样地，生长在十三烷酸(C13)和十一烷酸(C11)中的重组酵母含有范围从C13到C7的奇数链单体，并且主要成分是C13和C11单体(表5)。当酵母生长在油酸中时，在表达胞浆聚合酶的菌株中没有检测到PHA，但是具有靶向于过氧化物酶体的PHA聚合酶的菌株蓄积了近0.0385％细胞干重的PHA(表4)。

表5.当不同的奇数链长的脂肪酸被用作为碳源时，带有质粒p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743所生产的PHA含量和聚酯的PHA单体组成。

碳源	PHA含量(占CDW的％)	PHA组成(％，w/w)
						C13	C11	C9	C7
		十一烷酸(C13)十一烷酸(C11)	0.0498±0.01170.0255±0.0048	24.2nd	16.150.9					37.646.5	21.92.6

nd：未检测到

讨论

胞浆表达PHA聚合酶的酵母菌株不能由油酸(C18)生成PHA。但是在表达导向过氧化物酶体的PHA聚合酶的菌株中可由油酸生成PHA。这些结果说明β氧化中间物不能横穿过氧化物酶体膜以及非靶向的mcl-PHA聚合酶不能被转运到过氧化物酶体内。

表达胞浆聚合酶的重组酵母积累的PHA单体具有不同于所添加的脂肪酸长度的碳骨架，根据这一观察，我们提出β-氧化至少可以部分发生在啤酒酵母的胞浆中(图5)。对这种现象的一个可能的解释是β-氧化酶首先在胞浆内合成，然后这些酶再转译修饰后被转移到过氧化物酶体中。这就导致了这些β-氧化酶会在胞浆内临时保持活性，从而在胞浆完成脂肪酸的β-氧化。事实上，一些研究已经显示在酵母胞浆内可发现15-25％的β-氧化酶活性。PHA前体的另一个可能的来源是来自脂肪酸生物合成。外来添加的脂肪酸和脂肪酸生物合成途径都为胞浆中合成的mcl-PHA提供了炭源。

实施例4酵母pex5突变体内的PHA的生产

我们已经显示如果在啤酒酵母内表达来自食油假单胞菌的mcl-PHA聚合酶就可在胞浆内合成mel-PHA(实施例3)，并推论可以利用细胞浆内存留的β-氧化酶合成mcl-PHA前体。

为了在啤酒酵母的胞浆内利用β-氧化中间物合成mcl-PHA，关键的过氧化物酶体的蛋白包括Faa2p、Fox1p和Fox2p与PHA聚合酶在胞浆内同时都必须是活化的(图5)。过氧化物酶体基质的酶是通过利用一种信号肽(导向序列)的方法从胞浆内输入到指定的细胞器内。已经鉴定出两种不同的信号，相信它们足以将蛋白转运到过氧化物酶体中。一种是存在于大多数过氧化物酶体基质蛋白的C末端过氧化物酶体信号肽(PTS1)，另一种是定位于一些过氧化物酶体蛋白(例如Fox3p)的N末端30个氨基酸内的过氧化物酶体信号肽(PTS2)。PTS1包括C末端三肽SKL或它的保守变异体(S/A/C)(K/R/H)(L/M)。Pex5p是PTS1的受体，而携带PTS2的蛋白的传输是依赖于受体Pex7p。

啤酒酵母pex5突变体是可存活的，但蓄积了过氧化物酶体状、小叶样膜结构并且不能输入具有SKL信号肽的过氧化物酶体基质酶，例如Fox2p。酰基辅酶A氧化酶、Fox1p遵循着一条新的、非PTS1的输入途径，但也是依赖于受体Pex5p。在pex5突变体中，可在胞浆内发现Fox2p和Fox1p，但是Fox3p位于过氧化物酶体内。

进入啤酒酵母内的脂肪酸的活化受到至少四种不同的酰基辅酶A合成酶催化调控。这些酶中的其中一种酶Faa2p是一种带有PTS1导向序列的过氧化物酶体蛋白，而其他的三种酶没有过氧化物酶体导向序列。Faa2p可以在pex5突变体的胞浆内保持活性。

我们在pex5受体突变体的胞浆内表达了食油假单胞菌mcl-PHA聚合酶，以测定啤酒酵母是否能在胞浆内合成更高水平的mcl-PHA，。

菌株和培养基

在大肠杆菌DH5α中保存并繁殖质粒。在实施例2中描述了所用的所有的啤酒酵母和培养基。用磷酸(5mM)或柠檬酸(5mM)缓冲液将培养基的pH值控制在4.5到7.0。

克隆过程

在实施例1(图2)中描述了质粒p2TG1T-700(H)和p2TG1T-755(H)。

对PHA的分析

用在实施例2中所描述的气相色谱-质谱法分析研究胞浆PHA。

结果

mcl-PHA聚合酶在野生型和pex5杂合子酵母菌株中的胞浆表达

用PHA聚合酶质粒p2TG1T-700(H)转化啤酒酵母菌株BY4743、wt-16-4、BY4743-YDR244W、D603、YPH499和YPH500，将重组酵母培养在含有0.5g/L十二烷酸的培养基中。Mcl-PHA聚合酶的胞浆表达造成了PHA的合成。在啤酒酵母BY4743中，胞浆聚合物水平达到了总细胞干重(CDW)的近0.015％，而在BY4743-YDR244W中，聚合物水平达到了细胞干重的约0.026％，这比BY4743PHA菌株高出1.7倍。图6显示了当十二烷酸(C12)被用作为碳源时，对啤酒酵母BY4743-YDR244W所生成的PHA的GC-MS分析。图6A显示从啤酒酵母BY4743-YDR244W的样本中所得到的GC-MS谱图。图6B显示了从带有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W的样本中所得到的GC-MS谱图。C12(聚3-羟基十二烷酸)峰、C10(聚3-羟基癸酸)峰、C8(聚3-羟基辛酸)和C6(聚3-羟基己酸)峰都清晰可见，说明这些单体都存在于PHA聚合物内。所有峰的质荷比都与具有食油假单胞菌PHA聚合酶的大肠杆菌所生成的PHA进行了比较。在单倍体的野生型菌株wt-16-4中，所积累的PHA达到了细胞干重的约0.025％。

质粒p2TG1T-755(H)表达了导向过氧化物酶体的mci-PHA聚合酶，带有质粒p2TG1T-755(H)的酵母菌株被用作阳性对照。用同样的培养方法，PHA在BY4743-YDR244W、BY4743和wt-16-4的过氧化物酶体中相应地积累PHA到细胞干重的0.042％、0.053％和0.054％(表6和图6C。在野生型酵母菌株D603、YPH499和YPH500中都没有检测到胞浆mcl-PHA。

杂合pex5突变体所生成的胞浆mcl-PHA的组成

为了确定碳源对PHA单体组成的影响，将重组酵母培养在含有以下一种脂肪酸的SOG1培养基中：油酸(C18，1g/L)、十四烷酸(C14，0.5g/L)/十三烷酸(C13，0.5g/L)、十二烷酸(C12，0.5g/L)、十一烷酸(C11，0.3g/L)或癸酸(C10，0.3g/L)。在表7和8中总结了分析的结果。数据证实PHA单体组成是强烈地依赖于外来添加的脂肪酸(图7)。当C10脂肪酸被用作为碳源时，C10PHA占了总生物聚合物的约72％，而没有检测到C12PHA(表7)。

同样地，生长在十三烷酸(C13)和十一烷酸(C11)中的重组酵母生成了含有范围从C13到C7的奇数链单体的PHA，并且主要成分是C13和C11单体(表8)。

当重组酵母细胞生长在含有十四烷酸(C14)的培养基中时，只检测到微量的C10、C8和C6PHA。在生长在油酸的培养物中没有检测到PHA。

Pex5突变体菌株内的胞浆mcl-PHA的合成

用表达PTS1标记的或非标记的mcl-PHA聚合酶的质粒(相应地为p2TG1T-755(H)、p2TG1T-700(H))转化啤酒酵母pex5-3c11(纯合二倍体pex5突变体菌株)和pex5-16-2(单倍体pex5突变体菌株)。这些突变体菌株不能生长在外来脂肪酸作为唯一碳源的培养基中，因此培养基要添加甘油(1-3％，v/w)作为生长碳源。十二烷酸(0.4g/L)被用作PHA合成的碳源。培养基没有使用缓冲液控制pH值。在培养5-6天后，收集细胞并分析PHA。

表达来自质粒p2TG1T-700(H)的PHA聚合酶的啤酒酵母菌株pex5-3c11和pex5-16-2相应地蓄积PHA达到它们的细胞干重的近0.053％和0.031％。与野生型酵母菌相似，pex5突变体中的PHA包括C12、C10、C8和C6单体，以及C12单体占有总生物聚合物的70-85％(表6)。具有p2TG1T-755(H)的pex5突变体显示出相似的结果(表6)。

纯合pex5突变体中所合成的胞浆mcl-PHA的组成

为了研究碳源对pex5突变体的PHA单体组成的影响，将啤酒酵母株pex5-3c11培养在含有以下一种脂肪酸的SOG1培养基中：油酸(C18，0.5g/L)、十三烷酸(C13，0.4g/L)、十二烷酸(C12，0.4g/L)、十一烷酸(C11，0.2g/L)或癸酸(C10，0.2g/L)。表5显示PHA单体的组成是依赖于外来脂肪酸的性质。当重组酵母生长在C13、C12、C11和C10脂肪酸中时，所生成的PHA相应地主要包括C13、C12、C11和C10单体(图8)。这些单体占有总蓄积的PHA的约45-77％(表9)。有趣的是，当十一烷酸被用作为碳源时，除了奇数链PHA外，还检测到偶数链PHA单体包括C12、C10、C8和C6(图8和表9)。这些偶数链前体起源于脂肪酸生物合成。当pex5突变体生长在含有甘油和油酸或仅有甘油的培养基中时，培养物所蓄积的PHA由C8和C6单体组成。这也支持脂肪酸生物合成给酵母的PHA合成提供了前体的结论。

表6.当十二烷酸(C12)被用作为碳源时不同酵母菌株所合成的mcl-PHA含量和单体组成。

宿主	质粒	PHA含量	PHA的组成％，w/w
							(占CDW的％)	C12	C10	C8	C6
		BY4743	p2TG1T-700	0.015±0.001	58.6	16.6						22.9	1.9
BY4743	p2TG1T-755						0.054±0.004	38.7	23.8	29.9	7.6
		BY4743-YDR244W	p2TG1T-700	0.026±0.003	55.1	24.9						16.2	3.8
BY4743-YDR244W	p2TG1T-755						0.042±0.006	45.4	23.3	25.4	5.9
		pex5-3c11	p2TG1T-700	0.053±0.004	70.8	15.0						12.1	2.0
pex5-3c11	p2TG1T-755						0.046±0.001	81.9	5.5	10.5	2.1
		pex5-16-2	p2TG1T-700	0.031±0.009	84.8	12.3						2.0	1.0
pex5-16-2	p2TG1T-755						0.028±0.007	83.1	8.5	8.4	1.4
		wt-16-4	p2TG1T-700	0.025±0.013	66.9	17.7						6.7	8.7
wt-16-4	p2TG1T-755						0.054±0.016	36.1	27.6	24.6	11.7

nd：未被检测到

表7.当不同的偶数数目的脂肪酸被添加作为碳源时带有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W所生产的胞浆PHA含量和单体组成。

碳源		PHA含量	PHA的组成％，w/w
							(占CDW的％)	C12	C10	C8	C6
		C14C12C10	十四烷酸十二烷酸癸酸	0.0022±0.00090.026±0.0030.015±0.006	nd55.1nd	12.424.972.5						61.616.223.2	26.13.84.3

nd：未被检测到

表8.当不同的奇数数目的脂肪酸被添加作为碳源时带有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W所生产的胞浆PHA含量和单体组成。

碳源		PHA含量	PHA的组成％，w/w
							(占CDW的％)	C13	C11	C9	C7
		C13C11	十三烷酸十一烷酸	0.017±0.0050.009±0.002	37.2nd	26.438.9						28.230	8.231.1

nd：未被检测到

表9.当不同的脂肪酸被添加作为碳源时带有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母pex5-3c11所合成的胞浆PHA含量和单体组成。

碳源	PHA含量	PHA的组成％，w/w
											(占CDW的％)	C14	C13	C12	C11	C10	C9	C8	C7	C6
	油酸(C18)十三烷酸(C13)十二烷酸(C12)十一烷酸(C11)癸酸(C10)仅有甘油	0.0095±0.00390.051±0.0100.053±0.0040.040±0.0050.052±0.0190.0013±0.0006		77.4	70.80.2	16.746.5	9.015.00.544.6	3.824.7	57.212.113.640.182.8	2.17.1											33.82.07.415.317.2

空白：未被检测到；所有的培养基都含有1-3％甘油

讨论

在这个实施例中，我们在野生型酵母和pex5突变体的胞浆内表达了食油假单胞菌mcl-PHA聚合酶。Pex5突变体阻断了具有PTS1的过氧化物酶体蛋白转运到细胞器内，因此形成了功能性的胞浆PHA途径。通过Pex7p转运子，具有PTS2的Fox3p酶可被转运到过氧化物酶体内(图5)。在pex5突变体中表达非靶向的食油假单胞菌mcl-PHA聚合酶，这容许在胞浆内合成mcl-PHA。如在表6中所示，pex5杂合子酵母菌株所生产的PHA是带有p2TG1T-700(H)的野生型酵母BY4743所生产的1.7倍。这可能是因为pex5杂合子酵母菌株胞浆内积累更高浓度的β-氧化酶。Pex5突变体所合成的胞浆PHA的水平与表达导向过氧化物酶体的聚合酶的野生型酵母所合成的水平相似。因为在野生型酵母菌株D603、YPH499和YPH500中没有检测到PHA，相信这些菌株在它们的脂肪酸代谢上有突变。

表达胞浆PHA聚合酶的野生型和杂合的pex5酵母都没有从油酸(C18)生成PHA。但是，在表达导向过氧化物酶体的聚合酶的菌株中观察到从油酸合成PHA(实施例3)。这些结果说明β-氧化中间物不能横穿过氧化物酶体膜以及非靶向的mcl-PHA聚合酶不能被转运到过氧化物酶体内。Pex5突变体从油酸所合成的PHA只含有C10、C8和C6单体。对于胞浆表达的聚合酶不能从油酸生成PHA的可能解释是油酸是一种含有双键的不饱和脂肪酸，它的降解通过不同于饱和脂肪酸的途径。

实施例5pH对杂合pex5突变体生成mcl-PHA的作用

为了最优化带有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母BY4743-YDR244W的培养条件，磷酸(5mM)和柠檬酸(5mM)缓冲液被用于控制培养基的pH值。培养基pH值从4.5到7.0不等(图9)。不同pH值下，PHA含量均达到细胞干重的约0.025％，但是pH值高于6.0时的细胞干重显著降低。当考虑到细胞活性和PHA合成，最优的pH值范围是4.8到5.5。

实施例6fox3突变体菌株内的胞浆mcl-PHA同聚物的合成

用表达PTS1标记的或非标记的mcl-PHA聚合酶的质粒(相应地为p2TG1T-755(H)、p2TG1T-700(H))转化啤酒酵母BY4741-YIL160C(单倍体fox3突变体菌株)。这个突变体菌株不能生长在外来脂肪酸作为唯一碳源的培养基中，因此培养基要添加甘油(1-3％，v/w)作为生长碳源。十二烷酸(0.4g/L)被用作为PHA合成的碳源。在培养5-6天后，收集细胞并分析PHA。

带有p2TG1T-700(H)的单倍体fox3突变体酵母积累PHA到它细胞干重的约0.047％，同时聚合物只含有C12单体(同聚物)。当mcl-PHA聚合酶被靶向于过氧化物酶体时，酵母蓄积PHA到细胞干重的近0.13％。PHA包括C12、C10和C8单体，C12占了最大部分(表10)。C10和C8单体是由脂肪酸生物合成途径所合成提供的。

表10.当十二烷酸(C12)被用作为碳源时，酵母fox3突变体菌株所合成的mcl-PHA含量和单体的组成。

宿主	质粒	PHA含量	PHA的组成％，w/w
							(占CDW的％)	C12	C10	C8	C6
		BY4741-YIL160C(fox3)	p2TG1T-700	0.047±0.013	100.0	nd						nd	nd
BY4741-YIL160C(fox3)	p2TG1T-755						0.13±0.05	90.1	5.9	4.0	nd

nd：未被检测到

实施例7控制酵母中所合成的PHA的单体组成

此实例提供了能控制合成的PHA的单体组成的一些策略。当将酵母pex5突变体菌株培养在含有C12脂肪酸的SOG1培养基中，外来添加的琥珀酸(5g/L)、苹果酸(1g/L)、草酰乙酸(1g/L)、磷酸(0.5g/L)、丝氨酸(1g/L)、甘氨酸(1g/L)、牛血清白蛋白(BSA)(0.5g/L)和NaCl(5g/L)对PHA合成无明显影响。丙酮酸(1g/L)、乙酸(0.5g/L)和甲酸(0.5g/L)被测试作为碳源，并尝试用其减少细胞内辅酶A的浓度，辅酶A是mcl-PHA聚合酶的强抑制物。丙酮酸(图10A)、乙酸或甲酸(图10B)作为碳源生成了更高的终生物量浓度。另外，在这些底物中生长的pex5突变体蓄积了具有C14单体的PHA(表11)。这些C14PHA前体是通过脂肪酸生物合成途径所合成的并被胞浆内的没有被转运到过氧化物酶体内的β-氧化酶所降解。同型丝氨酸代谢也涉及辅酶A。将同型丝氨酸加入到培养基中可减少游离辅酶A水平，使得终生物量浓度提高，但是它对PHA合成没有显著作用。

当将pex5突变体生长在只含有甘油的培养基中时，在所合成的PHA中检测到了C8和C6单体(表11)。另外，如果将十一烷酸(C11)用作为碳源，pex5突变体生成了含有一些偶数链PHA单体的PHA(实施例4)。这些偶数链长的单体也是经由脂肪酸生物合成途径所合成，然后被胞浆内的β-氧化酶所降解。所以外来脂肪酸和天然脂肪酸生物合成途径都为所合成的PHA提供了炭源。

表11.当不同的脂肪酸被添加作为碳源时带有p2TG1T-700(H)的啤酒酵母所合成的胞浆PHA产量和单体组成。

碳源	PHA含量	PHA的组成％，w/w
											(占CDW的％)	C14	C13	C12	C11	C10	C9	C8	C7	C6
	仅有甘油同型丝氨酸+C12丙酮酸+C12乙酸+C12甲酸+C12	0.0013±0.00060.050±0.0200.063±0.0130.045±0.0070.069±0.002	1.129.131.9		58.472.770.968.1		18.811.2		82.818.811.2												17.24.53.8

空白：未被检测到；所有培养基都含有1-3％甘油

实例中在胞浆内或在过氧化物酶体中从脂肪酸代谢的中间物合成mcl-PHA。PHA的组成受酵母宿主的遗传背景、聚合酶的单体特异性、其中聚合酶为活化的细胞区域和培养基中所提供的底物的强烈影响。本发明提供了控制所合成的PHA的组成以及其性能的基础。例如，用表达胞浆mcl-PHA聚合酶的fox3突变体(BY4741-YIL160C)可合成同聚物。通过添加例如脂肪酸和甘油的适宜底物可控制聚合物中偶数、奇数或偶数和奇数数目单体的组合。另外，通过和脂肪酸一起添加例如丙酮酸和乙酸的底物也可影响单体的分布。所提出的策略具有合成新的聚合物的能力，并且使所合成的聚合物具有所需的物理性能。

实施例8用于将多个mcl-PHA基因引入到酵母内的策略

代谢途径加工常需要引入多个重组基因。和原核细胞不一样，绝大多数真核细胞常不表达多顺反子信息。每个基因需要它自己的启动子和它自己的终止序列。这使得引入多个基因更为困难。

有两类可以用于引入并调节啤酒酵母中重组的、多基因PHA途径的表达体系。一个选择是GAL1-10双向启动子，它容许从单个中心定位的序列调节两个的分离基因。单个序列有助于减少质粒大小以及不引入同一启动子之间的重组的可能性。第二个选择是含有多个启动子和多个基因的质粒。

载体构建

用PCR克隆从大肠杆菌K12MG1655的基因组中扩增得到来自大肠杆菌的编码酰基辅酶A脱氢酶的fadE基因。所用的引物是：

5’-GGAATTCATGATGATTTTGAGTATTCTCGCTACGGT-3’

和

5’-GGAATTCACGCGGCTTCAACTTTCCGCACTTTCTCCGGC-3’

它们形成一个上游EcoRI和一个下游EcoRI的限制性位点。将PCR产物连接到pCR-Blunt载体(Invitrogen)并形成了质粒pBZ101和pBZ102。

通过PCR克隆修饰fox2基因去除过氧化物酶体导向序列。所用的引物是：

5’-AACTCGAGATGCCTGGAAATTTA TCCTTCAAAG-3’

和

5’-ATCCCGGGTTATTTTGCCTGCGATAGTTTTAC-3’

它们形成了上游XhoI和下游SmaI限制性位点。将PCR产物连接到pCR-Blunt载体(Invitrogen)上，形成质粒pBZ106。

质粒pDP306和p2DP306T在ClaI位点存在Dam甲基化问题。首先，设计了新的序列以消除与ClaI位点相关的Dam甲基化问题。质粒pDP306被用作为构建具有新的ClaI位点的GAL1-10双向启动子的模板。PCR上游引物：

5’-TTTGAATTCGGTATCGATTTTTTATTGAATT-3’

含有ClaI位点和EcoRI位点。下游引物：

5’-CCGGTACAATTCGGGTCGACGTTAACTCTCCTT-3’

含有SalI位点和HpaI位点。用SalI和EcoRI消化PCR产物并将其连接到经相似消化的质粒pDP306和p2RS306T上。所形成的质粒被相应地称为pDP307和p2DP307T(图11)。

通过用EcoRI消化将fadE基因亚克隆到质粒p2DP307T中生成质粒p2DP-fadE(U)。用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)去除经消化的p2DP307T的5’磷酸以阻止克隆期间的自我连接。图3显示了质粒p2DP-fadE(U)，它携带有2μm复制起点、新的GAL1-10双向启动子、URA3终止序列和大肠杆菌酰基辅酶A脱氢酶基因。

转化和摇瓶培养

用醋酸锂方法(R.Soni et al.，Curr Genet1.24，455-459(1993))将质粒p2DP-fadE(U)和p2TEF1-700(H)共引入到啤酒酵母pex5-3c11的胞浆内。在含有无尿嘧啶和组氨酸的SD培养基中筛选转化株。在摇瓶试验，使用了SOG1培养基。该培养基含有100μg/ml遗传霉素、100mg/L亮氨酸、0.67％无氨基酸的酵母氮基、1％甘油、0.1％酵母浸液、0.4％Tween 80和0.24g/L适宜的脂肪酸。生产PHA时，离心收集生长于葡萄糖培养基中处于生长停滞期的菌体，在水中洗涤细胞一次并将细胞按1∶10稀释重悬于新鲜SOG1培养基中。为了诱导GAL1-10启动子，在培养物中加入半乳糖使得其终浓度为0.4％。将培养物在SOG1培养基中再生长5-6天，然后在收集分析PHA。

将带有p2DP-fadE(U)和p2TEF1-700(H)的啤酒酵母菌株pex5-3c11生长于含有0.24g/L十二烷酸作为碳源的培养基中。Mcl-PHA聚合酶和酰基辅酶A脱氢酶的胞浆表达造成PHA的生成达到细胞干重的0.1％-0.3％。

组成型表达体系

组成型表达体系是含有多个组成型启动子和多个基因的质粒。所构建的质粒含有表达所有PHA合成基因的组成型GAP启动子。从Invitrogen得到毕赤酵母载体pGAPZ B。载体pGAPZ B含有以下构件：GAP启动子、具有单一限制性位点的多克隆位点、C末端myc抗原决定簇、C末端多组氨酸标记、AOX1转录终止(TT)区、TEF1启动子、EM7(合成的原核启动子)、Sh ble基因(Streptoalloteichus hindustanus ble基因)、CYC1转录终止区和pUC起点。GAP启动子允许在酵母和毕赤酵母中的高水平的表达。具有单一限制性位点的多克隆位点允许所需的基因插入到表达载体中。

为了构建多基因表达载体，必须使用载体pGAPZ B的BamHI和BglII表达框。BamHI和BglII是两种不同的限制性内切酶，两者都识别中间四个碱基对应为5′-GATC-3′的6个碱基对的DNA靶点。如果将BamHI和BglII所切得的末端连接在一起，那么BamHI和BglII位点都变为失活。为了构建含有多基因表达框的载体，每个基因都必须被插入到pGAPZ-B的多克隆位点中。它遵循着我们能利用BamHI和BglII表达框的性能将整个表达框依次地插入到单个质粒中。

与mcl-PHA生物合成相关的头三种脂肪酸β-氧化酶在其基因中部都具有BamHI限制性位点。Faa2基因有两个BamHI位点；fadE基因有一个BamHI位点；fox2基因有一个BamHI位点。因此，在将基因克隆进pGAPZ-B之前，必须去除所有的BamHI位点。本实施例使用了定位诱变技术。

在本实施例中所用的定向诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)容许在任何的双链质粒上进行位点特异性突变，因此消除了亚克隆和ssDNA解救的需要。另外，定向诱变不要求特异的载体、独特的限制性位点、多转化或体外甲基化处理的步骤。

用于突变fadE基因的引物是：

5’-CCGGCGTGAGCGGAATCCTGGCGATTA-3’

和

5’-TAATCGCCAGGATTCCGCTCACGCCGG-3’

它用GGA取代了原始密码子GGG以去除BamHI位点。用于突变fox2基因的引物为：

5’-AAGGTAGTTGTAAATGACATCAAGGACCCTTTTTCAGTTGTTGAAG AAATA-3’

和

5’-TATTTCTTCAACAACTGAAAAAGGGTCCTTGATGTCATTTACAACT ACCTT-3’

它用GGA取代了原始密码子GAT以去除BamHI位点。所有的引物都是5’磷酸化的，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。

为了构建含有多个PHA基因表达框的载体，必须将faaa2、fadE和fox2基因插入到pGAPZ-B的多克隆位点中。利用BamHI和BglII表达框的特性将整个表达框依次插入到单个质粒中。将酵母的2μm复制起点插入到该质粒中，以形成单个的含有多个PHA合成基因的酵母质粒。使用组成型表达体系表达全部PHA合成酶，可以进一步提高mcl-PHA在酵母胞浆中的产量。

实施例9重组酵母中的scl-PHA的生产

克隆过程

用ClaI和EcoRI从质粒pPT 500(Jackson，Recombinant Modulation of the phbCAB OperonCopy Number in Ralstonia eutropha and Modification of the Precursor Selectivity of thePseudomonas oleovorans Polymerase I.Masters Dissertation.University of Minnesota.St.Paul，Minn.，(1998))分离得到罗氏真养菌scl-PHA合酶基因，并将其连接到经相似消化的p2TG1T(H)中。所生成的质粒被命名为p2TG1T-500(H)并被描述于图12中。质粒p2TG1T-500(H)含有TEF1启动子、2μm起点、HIS3标记物和URA3终止序列并表达罗氏真养菌scl-PHA合酶。含有过氧化物酶体导向序列的罗氏真养菌scl-PHA合酶可使用PCR克隆从p2TG1T-500(H)得到。所用的引物为：

5’-ATTATCGATGGCGACCGGCAAAGGCGCGGC-3’

和

5’-GGAATTCACAATCTAGCCACAGCTCTTGCCTTGGCTTTGACGTAT-3’

在J.J.Hahn et al.，Biotechnol Prog，15，1053-1057(1999)中显示，将6个氨基酸的肽(ARVARL)添加到phbC基因的3’末端修饰，将scl-PHA合酶靶向到玉米的过氧化物酶体中。这里使用了同样的信号肽序列。用ClaI和EcoRI消化PCR产物，并将其连接到经相似消化的p2TG1T(H)中以生成如图12所描述的p2TG1T-566(H)。质粒p2TG1T-566(H)含有具有过氧化物酶体导向序列(PTS)的罗氏真养菌scl-PHA合酶。用醋酸锂方法将该质粒转移到啤酒酵母菌株中。

罗氏真养菌scl-PHA合酶在胞浆和过氧化物酶体内的表达

用非靶向的或靶向的PHA合酶质粒(相应地为p2TG1T-500(H)或p2TG1T-566(H))转化啤酒酵母菌株BY4743。将重组酵母培养在含有油酸(1g/L)作为碳源的培养基中。Scl-PHA合酶的胞浆表达造成了PHA的合成，PHA蓄积到细胞干重的0.02％。在表达导向过氧化物酶体酶的菌株中，PHA含量为细胞干重的近0.8％。

为测试不同的碳源对过氧化物酶体产生的scl-PHA的单体组成的影响。将重组酵母生长在含有以下一种脂肪酸的SOG1培养基中：十二烷酸(C12，0.5g/L)、十三烷酸(C13，0.5g/L)、0.25g/L十二烷酸和0.25g/L十三烷酸的混和物。在表12中总结了结果。当用偶数链脂肪酸喂养表达导向过氧化物酶体酶的菌株时，所蓄积的PHA是由近97-99％C4单体组成的，剩余的是C8、C6和C5单体。相似地，添加奇数数目的C13脂肪酸生成由近6％C4和94％C5单体组成的PHA聚合物。当用C12和C13脂肪酸的混和物喂养酵母时，聚合物水平达到了细胞干重的近7％。在过氧化物酶体所合成的PHA是由84％C4和16％C5单体组成，剩余的是C6和C8单体。

表12.当不同的脂肪酸被添加作为碳源时，带有p2TG1T-566(H)的啤酒酵母BY4743所合成的过氧化物酶体PHA含量和单体组成。

	碳源	PHA含量(占CDW的％)	PHA的组成％，w/w
							C4	C5	C6	C8
			C18	油酸	0.8±0.04	97.2±0.5					1.4±0.4	1.2±0.2	0.2±0.1
C12	十二烷酸	3.8±0.1					98.9±0.3	0.18±0.03	0.6±0.2	0.3±0.1
			C13	十三烷酸	1.6±0.1	6±1					94±1	nd	nd
C12和C13	十二烷酸&十三烷酸	6.9±0.2					84±2	16±1	0.3±0.1	0.2±0.1

nd：未被检测到

本实例的产率大约是现有报道的100倍(V.C.De Oliveira et al.，Appl Environ Microbiol70：5685-5687，(2004))。我们的实施方案在宿主菌株、表达体系以及培养方法上都有很大的提高。

实施例10制备用于生产PHA的酵母宿主

酵母菌株

用杂合pex5二倍体酵母菌株的啤酒酵母菌株BY4743-YDR244W(Mata/αhis3Δ1 leu2Δ0ura3Δ0pex5::kanMX4)制备用于生产PHA的合适的宿主。

培养基

使用KAC培养基(乙酸钾1％，酵母浸液0.1％)、KAC 100K培养基(蛋白胨2％、酵母浸液1％、KCl 0.75％)和YPD 100K培养基(葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母浸液1％、KCl0.75％)。

孢子形成

在适宜的环境条件下，二倍体酵母细胞将进行减数分裂，再一次将它们的染色体分裂为单倍体组，并将其包装成四个、更小的、分离的单倍体细胞，可在显微镜下清楚地看到这些细胞并进行微处理。单轮减数分裂所形成的四个单倍体细胞的微小集落(称为“孢子”)都一起存在一个称为子囊的结构中。这使得操作者能将它们识别为同胞孢子的四分体。在用合适的酶将子囊壁消化后，用非常细的玻璃针可以将每个孢子挑离分开。然后每四个单倍体细胞可生长为同一细胞的独立克隆，它可被用于研究它们所携带的基因。

将啤酒酵母二倍体菌株BY4743-YDR244W放置于KAC培养盘中，它有着低浓度的氮。这引起二倍体孢子化，或通过减数分裂形成单倍体孢子的四分体。当尝试将酵母菌株孢子化时，将二倍体从YPD 100K转移到KAC。为了最好的结果，要非常细地划抹酵母。将培养盘在台面上放置3天，然后将它转移到培养箱中24个小时。24个小时后，将其放回到台面上，并将其用于分割。

消化和分割

需要分割和分析所形成的单倍体孢子的四分体。分割过程的第一步时消化围绕于四分体的子囊。将50μl按1∶10稀释的储备裂解酶放置于微试管中。第二步，用无菌牙签从KAC培养盘中得到孢子化的酵母。第三步，将牙签放置于试管中的50μl裂解酶中，并涡旋牙签约30秒。最后，容许酶再消化30秒，然后加入1ml无菌水灭活酶。得到一个YPD 100K分割盘，用黑色标记笔和尺子画好线，通过将接种环穿过本生灯的火焰来消毒接种环。将接种环浸泡于经消化酵母的溶液中并将其沿黑线划抹在分割盘上。重复这个步骤四次。翻转盘并将其放置在右边所示的微操作器的平台的环中。调整这个平台的位置使得针头位于盘的远离任何细胞的大片开阔区域。用最低倍镜找到针头。其次，在显微镜下寻找并四周移动操纵杆，直到看到针头。琼脂被一层非常薄的水膜所覆盖，当针头触及该膜时，在针头周围可看到暗色的环。一旦找到针头，用操纵杆抬高针头，重新定位平台并开始寻找四分体。寻找四个孢子的组并用微操作器针头将其拾起。移动平台使得孢子被放置于盘的大片的空白部分。一个盘上可放十二个四分体。

进行杂交

为了进行杂交，将少量的两种你欲杂交的相反杂交型的单倍体菌株放置在YPD盘中，相隔近1cm。下一步，在它们之间放置约20μl水。下一步，取无菌牙签并混和两个单倍体菌株，然后在水中将它们旋涡搅拌。将盘放置在塑料袋中，将其放在30℃的培养箱中，在4小时后收集所形成的二倍体。

在表13中列出了可用于PHA合成途径表达的酵母宿主。例如，在实施例4中采用了酵母pex5-3c11。

                         表13.来自孢子形成的酵母菌株的列表。

名称	基因型
		wt-3-1wt-3-2wt-8-3wt-8-4wt-10-1wt-10-2wt-11-3wt-11-4wt-12-2wt-12-4wt-16-3wt-16-4pex5-3-3pex5-3-4pex5-8-1pex5-8-2pex5-10-3pex5-10-4pex5-11-1pex5-11-2pex5-12-3pex5-3c111pex5-10c112pex5-16-1pex5-16-2	Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met 15Δ0Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0met15Δ0Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0met15Δ0Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0lys2Δ0pex5::kanMX4Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0pex5::kanMX4Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0pex5::kanMX4Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0pex5::kanMX4Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0pex5::kanMX4Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0pex5::kanMX4Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0lys2Δ0pex5::kanMX4Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0pex5::kanMX4Matαhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0pex5::kanMX4Mata/αhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0pex5::kanMX4Mata/αhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0pex5::kanMX4Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0pex5::kanMX4Mata his3Δ1leu2Δ0ura3Δ0lys2Δ0met 15Δ0pex5::kanMX4

¹pex5-3c11：通过杂交pex5-3-4和pex5-11-2得到。

²pex5-10c11：通过杂交pex5-10-3和pex5-11-2得到。

Claims (10)

1.一种导入了聚羟基烷酸酯聚合酶的酵母菌株。

2.根据权利要求1的酵母菌株，其为野生型。

3.权利要求1的酵母菌株，其包括pex5、pex7、pex8、pex13、pex14、pex18、pex21和/或fox3突变体。

4.根据权利要求1的酵母菌株，其中聚羟基烷酸酯聚合酶存在于胞浆中。

5.根据权利要求1的酵母菌株，其中聚羟基烷酸酯聚合酶被表达在过氧化物酶体内。

6.根据权利要求1-4任一项的酵母菌株，其中聚羟基烷酸酯聚合酶是中等链长度聚羟基烷酸酯聚合。

7.根据权利要求1-4任一项的酵母菌株，其中聚羟基烷酸酯聚合酶是短链长度聚羟基烷酸酯聚合。

8.根据权利要求1-4任一项的酵母菌株，其进一步导入了异源酰基辅酶A氧化酶和/或异源反-2-烯酰基辅酶A水合酶II。

9.根据权利要求1-4任一项的酵母菌株，其还包括聚羟基烷酸酯。

10.一种用于在酵母菌株中生产聚羟基烷酸酯的方法，包括：

给酵母菌株供应碳源，其中酵母菌株包括可操纵地编码聚羟基烷酸酯聚合酶的异源核酸；

在不同的培养策略下培养该转基因酵母细胞以引起聚羟基烷酸酯的生成；以及

从酵母细胞中分离出聚羟基烷酸酯。

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