CN1810968A - 一种调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法。本发明所提供的调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羟基脂肪酸酯；所述聚羟基脂肪酸酯的合成是通过在所述微生物中引入聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因而实现的。将本发明的方法应用到各种微生物生产菌中，可以有效的影响生产菌的代谢途径，增加菌的抗逆性，提高包括透明质酸、丙酮酸、麦角固醇、啤酒、肌苷、弹性蛋白酶、类胡萝卜素、谷氨酰胺、赖氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖酸、淀粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、苏云金杆菌粉剂、鸟苷、谷胱甘肽、赤藓糖醇、D－核糖，1，3－丙二醇等生物工程产品的生产效率。

Description

一种调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate或PHA)是许多种类的细菌都能合成的一种细胞内聚酯，在生物体内主要是作为细胞内碳源和能源的贮藏性物质而存在的(Lemoigne M.Products of dehydration and of polymerization of-hydroxybutyricacid.Bull.Soc.Chem.Biol.，1926，8：770-782)。PHA的结构通式如：

                                     (式I)

其中n可以为1、2、3或4，n＝1时表示3-羟基脂肪酸酯；m为聚合度；R为可变的侧链基团，如饱和或不饱和、直链或含侧链及取代基的不同链长的烷基。

根据PHA侧链的长短不同，可将PHA分为三种类型：

(1)短链PHA(short-chain-length PHA，scl PHA)，如聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)、羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)，PHBV]，单体含3-5个碳原子。

(2)中长链PHA(medium-chain-length PHA，mcl PHA)，如聚羟基己酸酯(PHHx)、聚羟基辛酸酯(PHO)，单体含6个以上碳原子。mcl PHA中可以含有多种功能基团，如双键(Huigberts GNM，Eggink G，Waard P，Huisman GW and Witholt B.Pseudomonas putitaKT2442 cultivated on glucose accumulates poly-β-hydroxyalkanoates consistingof saturated and unsaturated momnomers.Appl Envron.Microbiol.，1992，58：536-544)、叁键、卤素(Doi Y and Abe C.Biosynthesis and characterization ofa new bacterial copolyester of 3-hydroxyalkanoates and3-hydroxy-w-chloroalkanoates.Macromolecules，1990，23：2705-3707)、酚(FritzscheK.Lenz RW and Fuller RC.An unusual bacterial polyesters with a phenyl pendantgroup.Macromol Chem，1990，191：1957-1968)和氰(Schulz C，Wolk S，Lenz RW andFuller RC.Growth and polyester production by Pseudomonas oleovorans on branchedoctanoic acid substrates.Macromolecules.1995，27：6358-6362)等。mcl PHA大多是两种以上单体的随机共聚物。

(3)含短链与中长链单体的PHA，多是两种或两种以上单体的随机共聚物(LageveenRG，Huisman GW，Preusting H，Ketelaar H，Eggink G and Witholt B.Formation ofPolyesters by Pseudomonas oleovorans：Effect of Substrates on formation andcomposition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3-hydroxyalkenoates.Appl.Environ.Microbiol，1988，54：2924-2932)。

PHA对于细菌适应外界环境的变化及生存具有重要的意义。以PHB为例，有些细菌胞内的PHB可以减缓细胞内重要成分-RNA和蛋白质在饥饿条件下的降解，从而可以增加细菌对生存逆境的抵抗能力。另外在某些芽孢杆菌属中，尽管孢子的形成并不必需PHB，但PHB可以作为孢子形成时的能源和碳源从而增加这些菌的生存机会。此外，PHB还可以为某些固氮菌属的包囊形成提供必要的碳源和能源。对Rhizobium sp.ORS 571的固氮与PHB的形成及降解的研究表明，当节结中的氧浓度增加时，PHB可以通过自己的降解保护固氮酶不受损伤(Anderson AJ and Dawes EA.Occurense，Metabolism，Metabolic Role，and Industrial Use of Bacterial Polyhydroxyalkanoates.Microb.Rev.，1990，54：450-472)。

PHA还可以作为环境的标记。在对河湾沉积物中的微生物进行的研究表明，通过比较其中磷脂和PHA的合成比例，可以监测外界因素对沉积物的影响程度。而且许多可合成PHA的细菌都是在活性污泥、及富含碳源有机物的环境中被筛选出来的。在对一些被原油污染严重的地方分离的嗜冷海洋微生物进行的研究表明，其中的大多数微生物都可以在限氮的条件下在胞内积累PHA(Alvarez HM，Pucci OH and Steinbüchel A.Lipid storagecompounds in marine bacteria.Appl.Microbiol.Biotechnol.，1997，47：132-139)。这说明在这些碳源较丰富的环境中大多数细菌都具备将过量的碳源转化为PHA储存起来的能力。

PHB是细菌胞内的碳源和能源的储备物。但近来发现它也存在于原核生物和真核生物的膜中。在原核生物中，它存在于其原生质膜中；而在真核生物中，则以在线粒体和微体膜中的比例为最多。相比于胞内的高分子量的聚合物，存在于膜上的PHB分子较小，只有100-200个单体。对这种小分子量PHB的研究表明，它可能起着膜上的离子通道的作用。最近，在人的血细胞中也发现较多量的这种小分子PHB。这对于利用PHB来包裹药物进行定向定量释放以及PHA在医疗方面的应用提供了理论上的依据。

PHA作为一种生态型的生物高分子材料，不仅可以在塑料工业中得以推广和应用，成为新型的生物可降解塑料，而且由于它的一些特殊性质，如生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等和其它许多尚未发现的性质，从而有可能在某些高附加值领域得以应用。对PHA的研究已经成为一个基础理论与实践应用结合得非常紧密的应用领域。

不同类型PHA在细菌内的合成途迳是不同的，目前已知的合成途径主要有三条(Anderson AJ and Dawes EA.Occurense，Metabolism，Metabolic Role，and IndustrialUse of Bacterial Polyhydroxyalkanoates.Microb.Rev.，1990，54：450-472；Lee SY.Bacterial Polyhydroxyalkanoates.Biotech.Bioeng.1996，49：1-14)：

1.以Wautersia eutropha(以前叫Ralstonia eutropha，也叫Alcaligeneseutrophus)为代表的由乙酰辅酶A直接合成PHB途径：它的PHB合成酶系统由pha合成操纵子phbCAB(SEQ ID NO：1)基因编码，包含三种酶：β-酮基硫解酶(β-ketothiolase)、NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶(acetoacyl-CoA reductase)和PHB合成酶(PHBsynthase)；上述三种酶分别由phbA、phbB和phbC基因编码，且位于同一个操纵子上。细胞内的代谢中产物乙酰辅酶A在β-酮基硫解酶(β-ketothiolase，PhaA)的催化作用下形成乙酰乙酰辅酶A，然后在NADPH依赖的还原酶(PhaB)的作用下还原为(R)-羟基丁酰辅酶A，(R)-羟基丁酰辅酶A在PHB合成酶的作用下聚合成PHB。这个过程需要消耗NADPH，产生NADP。

2.以Pseudomonas aeruginosa为代表的脂肪酸从头合成途径：从这条途径合成PHA需要两个酶的催化：phaG编码的3-羟酰基-酰基转移蛋白辅酶A转运酶(3-Hydroxyacyl-ACP-CoA transferase)和phaC编码的PHA合酶。脂肪酸从头合成途径的中间产物3-羟酰基-酰基转移蛋白由3-羟酰基-酰基转移蛋白辅酶A转运酶(PhaG)催化形成PHA的前体3-羟基酯酰辅酶A，再由PHA合酶聚合成PHA。同样的途径有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putita)的合成途径，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putita)的PhaG的编码基因的Genbank检索号是AF052507。

3.以Pseudomonas oleovorans为代表的β-氧化途径：从这条途径合成PHA需要两个酶的作用：phaJ编码的(R)-烯酰基-水合酶((R)-enoyl-CoA hydratase)和phaC编码的PHA合酶。脂肪酸β-氧化的中间产物烯酰基-酰基转移蛋白由(R)-烯酰基-水合酶(PhaJ)催化形成PHA的前体3-羟基酯酰辅酶A，再由PHA聚合酶聚合成PHA。同样的途径有嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的合成途径，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的PHA合成酶操纵子(PHA synthase operon)编码基因的Genbank检索号是AY093685，包括PhaJ和PhaC的编码基因。

用¹³C-NMR对Pseudomonas putida的脂肪酸合成的研究表明脂肪酸的从头合成和β-氧化与PHA合成是独立进行的(Hui jberts GN，De Ri jk TC，De Waard P and Eggink G..13C nuclear magnetic resonance studies of Pseudomonas putidas fatty acidsmetabolic routes involved in PHA syntheses.J.Bacteriol.1994，176：1661-1666)，在一种细菌中可能会同时以二种途径来合成中长链PHA，虽然这二种途径并不是均等地起作用。最近的研究发现这两条途径之间也有联系，可以将脂肪酸从头合成途径的中间产物acyl-ACP在一个硫酯酶的作用下转变为降解途径的中间产物acyl-CoA(Rehm BHA andSteinbüchel A.Heterologous expression of the acyl-acyl carrier proteinthioesterase gene from the plant UmbelluLaria californica mediatespolyhydroxyalkanoates biosynthesis in recombinant Escherichia coli.Appl.Microbiol.Biotechnol.2001，55：205-209)。这个新发现表明PHA合成的单体提供途径是很多样化的，而对PHA合成进行代谢工程的研究也有更多的选择。

在PHA的代谢途径中，既有能量的代谢(NAD/NADH，NADP/NADPH等)，也有物质的代谢(乙酰辅酶A，脂肪酸等)，因此PHA的代谢过程，实际上也是一个细胞内能量和物质的改变过程。由于PHA可以广泛的存在于各种细胞中，这也为将PHA合成机制作为调节手段在各种不同的微生物中调节其能量和物质水平，进而影响代谢产物提供了基础。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种调控微生物代谢的方法。

本发明所提供的调控微生物代谢的方法，是在微生物中合成聚羟基脂肪酸酯；所述聚羟基脂肪酸酯的合成是通过在所述微生物中引入聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因而实现的。

所述代谢包括能量和物质代谢。

所述聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因选自下述1)，2)和3)中的任意一种：1)phbCAB基因，2)phaG和phaC基因，3)phaJ和phaC基因。

所述phbCAB基因优选为具有序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；所述PhaG基因优选为AF052507，所述phaC基因优选为来自于AY093685，所述phaJ基因优选为来自于AY093685。

PHA合成途径的相关基因可以通过本领域的常规手段导入宿主微生物中，例如，可以利用表达载体如质粒、粘粒、噬菌体等，通过转化、转导、接合等手段导入宿主微生物中；也可以利用原生质体融合等手段来实现。

所述调控微生物代谢为调控微生物对发酵产物的生产能力。

所述微生物为细菌，古细菌和真菌；所述发酵产物包括有机酸，醇类，抗生素，氨基酸和维生素。

其中，所述微生物可为兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)，优选为兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920，所述发酵产物为乳酸和透明质酸；

所述微生物可为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)，优选为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019，所述发酵产物为丙酮酸；

所述微生物可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338，所述发酵产物为麦角固醇；

所述微生物可为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162，所述发酵产物为肌苷；

所述微生物可为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)，优选为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B，所述发酵产物为弹性蛋白酶；

所述微生物可为红酵母(Rhodotorula glutinis)，优选为红酵母(Rhodotorulaglutinis)NCIM 3353，所述发酵产物为类胡萝卜素；

所述微生物可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032，所述发酵产物为谷氨酰胺；

所述微生物可为乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，优选为乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269，所述发酵产物为赖氨酸；

所述微生物可为大肠杆菌(Escherichia.coli)，优选为大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882，所述发酵产物为苯丙氨酸；

所述微生物可为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，优选为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55，所述发酵产物为葡萄糖酸；

所述微生物可为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556，所述发酵产物为α-淀粉酶；

所述微生物可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063，所述发酵产物为乙醇；

所述微生物可为克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)，优选为克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196，所述发酵产物为甘油；

所述微生物可为热带假丝酵母(Candida tropicalis)，优选为热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH22248，所述发酵产物为十二碳二元酸；

所述微生物可为热带假丝酵母(Candida tropicalis)，优选为热带假丝酵母(Candida tropicalis)T_25-14，所述发酵产物为十五碳二元酸；

所述微生物可为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220，所述发酵产物为鸟苷；

所述微生物可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186，所述发酵产物为谷胱甘肽；

所述微生物可为球拟酵母(ToruLopsis sp)，优选为球拟酵母(ToruLopsis sp)B845，所述发酵产物为赤藓糖醇；

所述微生物可为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，优选为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)ATCC 31095，所述发酵产物为D-核糖；

所述微生物可为丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)，优选为丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260，所述发酵产物为1，3-丙二醇；

所述微生物可为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，优选为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55，所述发酵产物为葡萄糖酸；

所述微生物可为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162，所述发酵产物为肌苷；

所述微生物可为移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选为移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286，所述发酵产物为乙醇。

本发明的另一个目的是提供一种提高微生物抗逆性的方法。

本发明所提供的提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羟基脂肪酸酯；所述聚羟基脂肪酸酯的合成是通过在所述微生物中引入聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因而实现的。

所述聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因选自下述1)，2)和3)中的任意一种：1)phbCAB基因，2)phaG和phaC基因，3)phaJ和phaC基因。

所述phbCAB基因优选为具有序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；所述PhaG基因优选为AF052507，所述phaC基因优选为来自于AY093685，所述phaJ基因优选为来自于AY093685。

其中，所述方法中，所述微生物可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063，所述逆境胁迫为冷胁迫或热胁迫；

所述微生物可为大肠杆菌(Escherichia coli)，优选为大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109，所述逆境胁迫为重金属离子胁迫；所述重金属离子可为Hg²⁺；

所述微生物为移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选为移动假单胞菌(Zymomonasmobilis)NRRL B-4286，所述逆境胁迫为低pH胁迫或高渗透压胁迫；

所述微生物可为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，优选为嗜酸乳杆菌(Lac tobacillus acidophilus)ATCC 53671，所述逆境胁迫为低pH胁迫；

所述微生物可为芽孢杆菌，优选为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，尤其优选为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068；

所述微生物可为芽孢杆菌，优选为芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23；所述逆境胁迫为原油胁迫。

本发明通过引入PHA合成基因，使微生物本身的代谢得到调控，提高了对逆境胁迫的抗性。

所述PHA合成机制包括以Wautersia eutropha，Rhodospirillum rubrum为代表的由乙酰辅酶A直接合成PHB途径；以Pseudomonas aeruginasa为代表的脂肪酸从头合成途径，以Pseudomonas oleovorans为代表的脂肪酸β-氧化途径等。

在本发明的调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法中，可将PHA合成的相关基因克隆到针对于目的菌的质粒载体上，将构建的质粒导入到目的菌中获得重组菌，发酵重组菌获得所需的产物或提高抗逆性。PHA合成的相关基因可以在质粒上或染色体上。

为提高转化效率，将重组质粒表达载体导入目的菌中的方法优选为电转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，包括热激法、原生质体转化法和接合转化法。

本发明通过在微生物重组生产菌中引入PHA合成途径，调节了细胞内的NAD(P)/NAD(P)H代谢以及乙酰辅酶A，丙酮酸等中间代谢产物的流向，为所需的发酵产物提供可调节的合成环境，同时PHA的积累能提高重组生产菌对恶劣环境的耐受力，特别是产物的反馈抑制，也有利于提高发酵产量的提高。

本发明利用PHA合成路径调节微生物代谢，提高微生物发酵产物的生产效率，进一步提高微生物抗逆性。本发明提供的方法是构建含有PHA合成相关基因的质粒，在导入相应菌株中进行表达。所述的菌株可以为各种微生物生产菌。将本发明的方法应用到各种微生物生产菌中，可以有效的影响生产菌的代谢途径，增加菌的抗逆性，提高包括透明质酸、丙酮酸、麦角固醇、啤酒、肌苷、弹性蛋白酶、类胡萝卜素、谷氨酰胺、赖氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖酸、淀粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、苏云金杆菌粉剂、鸟苷、谷胱甘肽、赤藓糖醇、D-核糖，1，3-丙二醇等生物工程产品的生产效率。

在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，这些均在本发明的保护范围之内，如利用根据密码子简并原则或碱基互补原则所获得的与本发明的聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因功能基本相同的核酸分子，对于聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关酶，在其不起主要作用的位点进行氨基酸插入和/或缺失和/或替换所得到的功能基本相同的蛋白质或多肽的编码基因，来实现本发明的目的，均被认为落入了本发明的保护范围。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

本发明中所使用的术语“PHA”是指由微生物合成的聚羟基脂肪酸酯，其结构通式如式(I)所示，包括的PHA分子式例如聚羟基丁酸(PHB)、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸的共聚物PHBV、3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚物PHBHHx以及中长链单体如3-羟基己酸HHx到3-羟基十二酸3-HDD的单聚物或共聚物，。

本发明中所使用的术语“PHA合成途径的相关基因”是指，在PHA合成途径中，参与了PHA整个合成过程的各种相关合成酶和调控蛋白所对应的基因；例如PHA合酶基因phaC，3-羟酰基-酰基转移蛋白辅酶A转运酶基因phaG，(R)-烯酰基-水合酶基因phaJ基因等。

本发明中所使用的术语“抗逆性”是指微生物在偏离其最佳生长条件下的环境中的生存能力，比如较高或较低的温度，较高或较低的pH，较高或较低的渗透压，较高的反馈抑制，有毒物质的存在等。

本发明中所使用的术语“微生物”包括细菌、古细菌、真菌(例如酵母)等。

本发明中所使用的术语“发酵产物”是指一切通过微生物发酵或转化而得到的产品，比如有机酸、酒精、其他醇类、抗生素、氨基酸、维生素等。

实施例1、在兽疫链球菌中表达Wautersia eutropha的phbCAB基因影响乳酸及透明质酸产量

菌种：兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920

1)在标准的聚合酶链式反应条件下，以pBHR68质粒(Spiekermann P，Rehm BHA，Kalscheuer R，Baumeister D，Steinbüchel A.A sensitive，viable-colony stainingmethod using Nile red for direct screening of bacteria that accumulatepolyhydroxyalkanoic acids and other storage compounds.Arch Microbiol 1999，171：73-80)为模板，用引物ATAAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGGCGACCGGCAAAGGC和GTTATCGAT(ClaI)CGGCAGGTCAGCCCATAT扩增出phbCAB基因，然后经过HindIII和ClaI酶切处理后，插入到质粒pEU308(Eichenbaum Z.and Federle MJ.Use of the lactococcalnisA promoter to regulate gene expression in Gram-positive bacteria：comparisonof induction level and promoter strength.Appl.Environ.Microbiol.1998，64：2763-2769)的Spac启动子下限制性内切酶HindIII和ClaI的识别位点间，获得质粒pEUHB。然后通过SphI酶切将质粒上的LacI基因切除，使phbCAB基因的表达不需要IPTG诱导，得到质粒pEUHBNOI。

2)制备兽疫链球菌的感受态细胞，并将质粒pEUHBNOI用电转化方法转入兽疫链球菌中。

感受态细胞的制备：

将兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920在含有THYB(Todd-Hewitt broth)(从OXOID购买)36.4g/L和酵母浸出物0.5％的培养基中培养12h；然后将其接种到50mL新鲜的THYB培养基中，接种后D530不超过0.05，培养到OD530＝0.25即可；并在培养结束前半小时加入透明质酸酶0.4mg/mL；

4℃，8000g，离心10分钟，弃上清，用20mL 0.5mmol/L蔗糖溶液重悬细胞；

4℃，8000g，离心10分钟，弃上清，用1mL 0.5mmol/L蔗糖溶液重悬细胞，再离心，弃上清；将细胞重悬在250μL含有10％甘油的0.5mmol/L蔗糖溶液中，按使用体积分装到Eppendorf管中；迅速置于-80℃保存。

兽疫链球菌的电转化

在200μL感受态细胞中加入500-5000ng质粒pEUHBNOI，冰浴10分钟；将混合体系转移到2mm电激杯中电激，电压设为2.5kv；

用1mL冰冷的THYB将混合体系转移到10mLTHYB中，冰浴30-60分钟；然后37℃静置培养1小时；接着在14℃，6000g，离心10分钟，菌体用1mL THYB重悬并涂于抗性平板上进行转化子的筛选，得到重组兽疫链球菌(含有pEUHBNOI的兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920)。

3)重组兽疫链球菌的发酵

种子培养基成分为蔗糖：20g/L，酵母粉：10g/L，牛肉膏：10g/L，MgSO₄·7H₂O：2g/L，MnSO₄·4H₂O：0.1g/L，KH₂PO₄：2g/L，微量元素液：1mL/l，种子缓冲液：40mL/l。发酵培养基成分为酵母粉：20g/L，Na₂HPO₄·12H₂O：6.2g/L，MgSO₄·7H₂O：2g/L，K₂SO₄：1.3g/L，FeSO₄·7H₂O：5mg/L，微量元素液：2.5mL/l，蔗糖：70g/L。其中微量元素液含CaCl₂：2g/L，MnSO₄·4H₂O：24mg/L，ZnCl₂：46mg/L，CuSO₄·5H₂O：19mg/L；种子缓冲液含Na₂HPO₄·12H₂O：36.76g/L，NaH₂PO₄·12H₂O：15.98g/L，NaHCO₃：12.5g/L。

用接种环分别挑取平板上的兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920和重组菌菌种，分别接入装有150mL种子培养基的500mL三角瓶中，于200rpm的摇床上培养14-16小时，培养温度设为37℃；然后按10％(体积比)的接种量将种子接入发酵罐(7.5升发酵罐(NBS Bioflo 3000，NJ，USA)中装液量3升)中。发酵罐控制温度37℃，pH值7.0，通气量5L/min。初始搅拌速度200rpm，当溶氧降到0时升高转速到500rpm，溶氧再次降到0时转速调为650rpm，并维持到发酵结束，兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920发酵14小时，重组菌发酵16小时。分别测定发酵培养基中的透明质酸和乳酸的含量。结果表明兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC 39920发酵14小时的透明质酸(Hyaluronic acid，HA)和乳酸产量分别为5.4g/L和65g/L。重组菌发酵14小时的透明质酸和乳酸产量为5.6g/L和38g/L，乳酸产量下降42％；16小时的产量为7.3g/L和41g/L，透明质酸产量上升34％，乳酸产量下降37％。乳酸合成是兽疫链球菌在缺氧条件下主要的获取细胞内氧化力(NAD)的途径，因此细菌在发酵过程中产生大量的乳酸。而引入PHB合成途径为细胞提供了一条外源的NAD再生途径，从而可以降低乳酸途径的压力，使乳酸合成大大减少，乳酸的大量减少，使更多的的碳源能够流向别的代谢途径，从而使透明质酸产量也得到一定提高。

其中，透明质酸含量测定采用Bitter-Muir氏法(Bitter T.，Muri HM.A modifieduronic acid carbazol reaction.Anal.Biochem.1962，4：330-334)，发酵液的测量样品制备方法如下：a)取1mL发酵液准确稀释到4mL，6000转离心10分钟；b)取1mL上清加入到4mL无水乙醇中，振荡，6000转离心5分钟；c)弃去上清，加入2mL 0.2mmol/LNaCl，放置，间或振荡，直至最终溶解；d)加入4mL无水乙醇，振荡，6000转离心5分钟；e)弃去上清，沉淀用2mL去离子水溶解作为HA测定的样品。乳酸盐浓度的测定：采用HPLC(SpectroSYSTEM P2000，Thermo Separation Products，USA)法。折光检测器，离子交换柱Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm，流动相为0.005mmol/L硫酸溶液，流速0.50mL/min。检测前，取0.2mL发酵样品，准确稀释到4mL，10000rpm/min离心5分钟，去上清，0.45μm滤膜过滤后作为色谱的样品。

实施例2、在光滑球拟酵母中表达phbCAB基因影响丙酮酸产量

菌种：光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019

培养基：斜面和种子培养基(L)：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，琼脂20g/L(斜面用)，pH 5.5。

发酵培养基：葡萄糖80g/L，蛋白胨15g/L(含氮量12％)，KH₂PO₄ 5g/L，KCl 5g/L，MgSO₄·7H2O 0.18g/L，烟酸4mg/L，盐酸硫胺素20μg/L，盐酸吡哆醇100μg/L，生物素10μg/L，核黄素50μg/L，pH5.0。

将质粒pBHR68用BamHI和EcoRI酶切处理后，将获得的5.2kb的片段插入到质粒pPIC9K(购于Invitrogen公司)的BamHI和EcoRI的识别位点间，获得质粒pPICHB。这个质粒以电转化的方法转入到光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019中获得重组菌(含有pPICHB的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019)进行发酵实验。

分别取斜面培养的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在30℃、200rpm下培养12小时后，以10％(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L，温度30℃，通气量2L/min，搅拌转速700rpm，用5mol/L KOH控制pH为5.0。当残糖降至4％时，按一定速率流加400g/L的葡萄糖液进行流加培养，发酵时间48小时。

取2mL发酵液在8000g离心5分钟后，上清用乳酸脱氢酶法测定丙酮酸含量(Lamperecht W，Heinz F.In：Methods of enzymatic analysis，ed.Bergmeyer，H.U.VCH，Weinheim，1984，6：pp570-577)。细胞用去离子水洗两次后真空冰干。结果表明重组菌的丙酮酸产量为68g/L，比光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019的52g/L提高了约31％。糖酵解产生丙酮酸的途径是消耗NAD的，丙酮酸在细胞内被代谢掉则是合成NAD的过程。因此细胞内大量积累丙酮酸需要一个高氧化力的环境。phbCAB基因的引入，能够为细胞提供氧化力，从而提高了丙酮酸的产量。

实施例3、在酿酒酵母中表达phbCAB基因影响麦角固醇产量

菌种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338(中国科学院微生物所菌种中心保藏号)

斜面，种子培养基以及发酵培养基为：葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂20g/L(斜面用)，pH 5.5。

将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338中获得重组菌(含有pPICHB的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在30℃、200rpm下培养12小时后，以10％(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L，温度30℃，通气量2L/min，溶氧自动控制在15％，控制pH为5.5。发酵10小时后每隔6小时补料一次，加入40g葡萄糖，重组菌培养基中加入遗传霉素0.2g/L。发酵30小时后，终止发酵。麦角固醇含量的测定参照文献(许旭萍，李惠珍，佘晨兴，谢华玲，林志军。麦角固醇产生菌Torullopsis famata优化发酵条件的研究。生物学杂志，2002，19：15-17)。

测定结果表明重组菌的麦角固醇含量为1.2％，比酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)IFFI 01338的0.9％提高了33％。有研究表明，麦角固醇的合成具有氧代谢的特征，有氧条件有利于其合成。因此，phbCAB基因的引入，为细胞提供了更多的氧化力，从而促进了细胞内麦角固醇的合成。

实施例4、在酿酒酵母中表达phbCAB基因提高酵母菌的抗逆能力

菌种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063

将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063中获得重组菌(含有pPICHB的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在30℃、200rpm下培养12小时后，以10％(v/v)接种量接入新培养基。培养基成分为：葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂20g/L(斜面用)，pH5.5。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC2063和重组菌的种子在接入新培养基之前，各分为三组，一组在48℃放置1小时，一组在-80℃放置48小时，另一组不做处理。然后将种子分别接入新培养基后，测定其生长曲线。计算未经处理的种子与经过处理的种子延滞期时间之差。结果表明重组菌的种子经过冷或热处理后，其活性并未受到大幅降低，即延滞期时间与未经处理的种子相差不大。而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063的种子活性经过冷或热处理后受到较大的影响。经过热处理后，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063的时间差为7小时，重组菌时间差为1小时，两个相差6小时。即是说积累PHA的细胞具有更好的恶劣环境耐受性，具有更强的生命力。这对于酿酒工业有重要的意义，由于发酵过程中酵母死亡会影响发酵，同时带来不适的口味，因此强壮的菌株有着更好的应用前景。

实施例5、在枯草芽孢杆菌中表达phbCAB影响肌苷的生物合成

菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162。

种子培养基成分为葡萄糖20g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，玉米液7g/L，氯化钠2.5g/L，尿素2g/L，pH值7.0。发酵培养基成分为葡萄糖140g/L，玉米液16g/L，酵母粉16g/L，尿素9g/L，硫酸铵16g/L，七水硫酸镁4g/L，磷酸氢二钾5g/L，碳酸钙20g/L。

按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 19162中获得重组菌(含有pEUHB的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在32℃、200rpm下培养12小时后，以5％(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L，自动控制温度35℃，pH6.5，搅拌速度600rpm，通气量1L/min，到肌苷产量不再增加停止发酵，发酵时间68小时。肌苷含量用HPLC测定，流动相为0.5％磷酸氢二钾，流速1.2mL/min，色谱柱为HypersilODS C18反相柱，检测波长为254nm。HPLC测定结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 19162的苷产量为19g/L，重组菌的产量为24g/L，提高了26％。在细胞内代谢途径中，为肌苷合成提供前体的单磷酸己糖途径会消耗大量的NADP，同时从6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途径的调控酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶受到NADPH的反馈抑制，因此NADPH的减少能促进葡萄糖向磷酸戊糖途径的转化。总的来说，肌苷合成是一个需要大量氧化力的生化代谢过程，高的NADP/NADPH水平能够有效的促进肌苷的合成。phbCAB基因的引入，正能实现这一要求，因此能够显著的提高肌苷的产量。

实施例6、在嗜碱芽孢杆菌中表达phbCAB基因影响弹性蛋白酶产量

菌种：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B(Takagi H，Tsai YC，NakamoriS，Yamasaki M.Improved Production and Recovery of Alkaline Elastase fromAlkalophilic Bacillus Strains by a Change of Medium Composition.Biosci BiotechBiochem，1995，59：1591-1592)

种子培养基成分为葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钠5g/L，碳酸钠10g/L。发酵培养基成分为葡萄糖20g/L，豆饼粉5g/L，酵母粉2.5g/L，磷酸氢二钾0.75g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钠20g/L，碳酸钠10g/L。

将实施例1中获得的pEUHB以电转化的方法转入到嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)Ya-B中获得重组菌(含有pEUHB的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B)进行发酵实验。获得重组菌进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在37℃、250rpm下培养12小时后，以1％(v/v)接种量接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶)，37℃，250rpm培养48小时，停止发酵。将发酵液8000g离心十分钟，收集上清，用硫酸铵分级盐析(30％-65％饱和度)，沉淀溶于0.05mol/l pH9.0硼酸缓冲液中，得到粗酶液。1mL粗酶液中与20mg地衣红-弹性蛋白中分别加入1mL 0.05mol/L pH9.0硼酸缓冲液于55℃水浴保温一小时，不时振荡。分别以2mL 0.7mol/L pH6.0磷酸缓冲液终止反应，8000g离心10分钟，上清于590nm测吸光度值。20mg地衣红-弹性蛋白完全水解后，590nm处光吸收值的一半为10个酶活力单位。

经过48小时发酵培养后，重组菌的酶活198U/mL比嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)176U/mLYa-B高12.5％，重组菌具有更高的弹性蛋白酶产量。研究表明，高溶氧有利于弹性蛋白酶的合成，其合成是一个需要氧化力的过程。phbCAB基因的引入，正好能够为细胞提供更多的氧化力，这是有利于弹性蛋白酶的合成的。

实施例7、在红酵母中表达phbCAB基因影响类胡萝卜素产量

菌种：红酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353(印度国家工业微生物菌种保存中心)

斜面培养基成分为：葡萄糖35g/L，麦芽提取物3g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 3g/L，K₂HPO₄ 3g/L，MgSO₄·7H2O 0.2g/L，琼脂20g/L，pH6.0。

液体培养基为：葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L，KH₂PO₄ 2g/L，K₂HPO₄ 2g/L，pH6.0。

将实施例2中获得的pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到红酵母(Rhodotorulaglutinis)NCIM 3353中获得重组菌(含有pPICHB的红酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的红酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在28℃、240rpm下培养18小时后，以5％(v/v)接种量接入新鲜液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)，28℃，240rpm培养72小时。发酵液3000rpm离心十分钟收集菌体，用去离子水洗两次后冰干称重。每克菌体加5mL 3mol/L HCl，室温下浸泡1小时，在沸水浴中煮4分钟，迅速冷却，3000g离心十五分钟，弃去上清，沉淀用去离子水洗两次后加3mL丙酮，室温下振荡三十分钟，再3000g离心二十分钟，上清即为类胡萝卜素提取液，将提取液稀释后，测475nm处吸光度值，按下式计算胡萝卜素含量：胡萝卜素含量(μg/g菌体)＝A₄₇₅×V×D/0.16w。A475为胡萝卜素吸光度值，V为提取所用溶剂量(mL)，D为样品稀释倍数，w为菌体量(g)，0.16为胡萝卜素的摩尔消光系数。

结果表明红酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353的类胡萝卜素含量为76μg/g，而重组菌的含量为92μg/g，提高了21％。高氧化力环境有利于类胡萝卜素的合成。phbCAB基因的导入，能够为细胞提供氧化力，从而促进类胡萝卜素的合成。

实施例8、在谷氨酸棒杆菌种表达phbCAB影响谷氨酰胺合成

菌种：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032。

种子培养基及发酵成分为：一水葡萄糖50g/L，(NH₄)₂SO₄ 7.5g/L，NaCl 2g/L，CH₃COONa·2H₂O 3g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 8g/L，KH₂PO₄ 2g/L，尿素5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，盐溶液10mL/l，生物素6μg/L，维生素B1 1mg/L，卡那霉素20mg/L。其中盐溶液为：MnSO₄·7H₂O 20mg，Na₂B₄O₇·10H₂O 2mg，(NH₄)₅MO₇O₂₄·4H₂O 1mg，FeCl₂·6H₂O 20mg，ZnSO₄·7H₂O 5mg，CuSO₄·5H₂O 2mg，FeSO₄·7H₂O 250mg，溶于50mL 1mol/L HCl中。

将实施例1中获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中获得重组菌(含有pEUHB的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032和重组菌，分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在30℃、200rpm下培养12小时后，以5％(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L，自动控制温度30℃，pH 6.5，搅拌速度600rpm，通气量1L/min，发酵48小时，停止发酵，测定发酵液中谷氨酰胺含量。谷氨酰胺的测定用新华3号滤纸在室温下用不饱和法展开，展开剂用体积比为5∶2的正丙醇和浓氨水的混合液，上行法展开。称取谷氨酰胺标准品，配成1％，1.5％，2％，2.5％，3％等不同质量浓度的溶液，每种溶液点样1μL，发酵液离心取上清点样1μL。展析完成后风干滤纸，用0.5g/L茚三酮丙酮溶液显色，105℃烘干5分钟，滤纸上出现紫红色氨基酸斑点，剪下氨基酸斑点，用洗脱液(体积比为2∶38的0.1g/L CuSO₄·5H₂O和75％乙醇的混合液)洗脱30分钟，然后在520nm处测光吸收，从标准曲线上求得发酵液中谷氨酰胺含量。结果表明谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的谷氨酰胺产量为11g/L，重组菌产量为14g/L，提高约27％。phbCAB基因的引入，能够减少丙酮酸向乳酸的代谢，促进丙酮酸转化为乙酰辅酶A，而谷氨酰胺的前体正是三羧酸循环的中间产物，这样能够为谷氨酰胺的合成提供更多的前体，因此产量得到提高。

实施例9、在乳酸发酵短杆菌中表达phbCAB影响赖氨酸产量

菌种：乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269。

斜面培养基成分为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，pH7.2-7.4。

种子培养基成分为：葡萄糖2％，KH₂PO₄ 0.1％，(NH₄)₂SO₄ 1％，MgSO₄·7H₂O 0.04％，FeSO₄·7H₂O 1mg/L，MnSO₄·H₂O 0.8mg/L，生物素5μg/L，VB1 20mg/L，豆饼水解液5％，pH 7.0。

发酵培养基成分为：葡萄糖14％，KH₂PO₄ 0.1％，(NH₄)₂SO₄ 4％，MgSO₄·7H₂O 0.04％，FeSO₄·7H₂O 1mg/L，MnSO₄·H₂O 0.8mg/L，生物素5μg/L，维生素B1 20mg/L，豆饼水解液5％，碳酸钙2％，pH 7.0。

将实施例1中获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269中获得重组菌(含有pEUHB的乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269和重组菌，接种于一级种子培养基中，500mL摇瓶装液量30mL，于摇床上30℃，110rpm，培养12小时。接种2mL一级种子于30mL二级种子培养基中，于摇床上30℃，110rpm，培养10-12小时。然后取1mL二级种子接种于发酵培养基，500mL摇瓶装液量20mL，30℃，110rpm，培养72小时。赖氨酸含量用茚三酮比色法测量：发酵液经3500g离心15分钟，取上清0.1mL稀释到100mL，取1mL稀释液加入到4mL茚三酮试剂(取水合茚三酮1.0g，加入乙二醇甲醚75mL，另取1.34g CuCl₂·2H₂O加入pH1.3柠檬酸缓冲液25mL中，混合两种溶液后，再加蒸馏水100mL，得到茚三酮溶液)中，沸水浴加热20分钟，快速冷却后测定478nm处吸光度值。根据标准曲线测定赖氨酸含量。

结果表明乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269赖氨酸产量为53g/L，而重组菌的产量为58g/L，约有10％的提高。在合成代谢中，赖氨酸的前体物质草酰乙酸有三条途径合成，但都与丙酮酸和NADP/NADPH的代谢有关，因此phbCAB基因的导入能对赖氨酸的产量产生影响。

实施例10、在大肠杆菌中表达phbCAB基因影响苯丙氨酸产量

菌种：大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882。

种子培养基成分为：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，葡萄糖2％，pH7.5。

发酵培养基成分为：Na₂HPO₄·12H₂O：20g/L，柠檬酸钠6g/L，谷氨酸钠0.4g/L，酪氨酸0.6g/L，葡萄糖20g/L。

补料培养基：CaCl₂·2H₂O 0.6g/L，酪氨酸500mg/L，葡萄糖500g/L，MgSO₄·7H₂O1g/L，维生素B1 500mg/L，氨水28％。

将pBHR68质粒以电转化的方法转入到大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882中获得重组菌(含有pBHR68的大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882和重组菌，分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在37℃、200rpm下培养12小时后，以5％(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L，自动控制温度38.5℃，pH 7.0，溶氧20％，通过补料控制葡萄糖浓度在1.5％，发酵时间48小时。苯丙氨酸含量测定方法如下：取2μL发酵液上清点样于滤纸上，置于层析液中单向上行展析16小时，烘干后以茚三酮喷涂显色，以标准氨基酸为对照，剪下层析后的着色斑点，置于65％的乙醇溶液中脱色2小时，测定520nm下光吸收，氨基酸量＝标准氨基酸溶液浓度×被测发酵液光密度/标准氨基酸溶液光密度。

结果表明大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882发酵得到苯丙氨酸浓度为8.2g/L，而重组菌产物浓度为10.6g/L，提高了29％。对于大肠杆菌的氨基酸合成，如果用全局的代谢调控能够取得较好的效果。而phbCAB基因的引入，一个有效的调控是能增强磷酸戊糖途径，有利于氨基酸的合成。

实施例11、在荧光假单胞菌中表达phbCAB基因影响葡萄糖酸产量

菌种：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55

斜面培养基成分为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，pH7.0。

种子培养基成分为：葡萄糖2％，玉米浆1％，尿素0.2％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，pH7.0。

发酵培养基成分为：淀粉水解糖14％，玉米浆1.5％，轻质碳酸钙4％，pH 6.7。

将质粒pBHR68经过HindIII和BamHI酶切处理后，插入到质粒pBBR1MCS2(KovachME，Elzer PH，Hill DS，Robertson GT，Farris MA，Roop RM，Peterson KM.Four newderivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS，carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Gene.1995，166：175-176)的HindIII和BamHI的识别位点间，获得质粒pBBRHB。这个质粒以电转化的方法转入到荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)AS 1.55中获得重组菌(含有pBBRHB的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)AS 1.55)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在30℃、230rpm下培养16小时后，以10％(v/v)接种量接入发酵培养基。发酵瓶500mL装液量50mL，在30℃、230rpm下培养72小时。发酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法测定：发酵液中酮基葡萄糖酸含量＝25℃下发酵液旋光度绝对值/0.88。

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1005的发酵液中酮基葡萄糖酸含量为13.4g/L，重组菌的产量为16g/L，提高了大约19％，phbCAB基因的导入，有利于提高菌的的耐受力，生长得更好，从而得到更高的转化率。

实施例12、在枯草芽孢杆菌中表达phbCAB基因影响α-淀粉酶合成

菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556。

种子培养基成分为(300mL)：葡萄糖1g，牛肉膏1g，蛋白胨1g，NaCl 1g，KH₂PO₄ 1g，淀粉1g，pH 7.0。

发酵培养基成分为(200mL)：牛肉膏1g，蛋白胨1g，NaCl 1g，KH₂PO₄ 1g，NaH₂PO₄1g，淀粉3g。

将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB乙酸锂转化的方法转入到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556中获得重组菌(含有pEUHB的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 21556)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在32℃、200rpm下培养12小时后，以10％(v/v)接种量接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶)，32℃，200rpm培养72小时，测定α-淀粉酶酶活力。酶活力测定：取5mL发酵液，4000g离心15分钟，取上清与5-乙缩醛-麦芽庚糖-对-硝基苯反应，酶活力单位定义为：37℃，1分钟分解1μmol淀粉为葡萄糖即为1个酶活单位。

结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556的发酵液中酶活为67U/L，而重组菌酶活为76U/L。重组菌的发酵液中有更高的淀粉酶活力，这可能是因为phbCAB基因导致细胞内的代谢途径发生变化，使其倾向于有利于细胞生长的方向，提高了细胞利用淀粉作为碳源的能力，即是增加了细胞的淀粉酶产率。

实施例13、在酿酒酵母中表达phbCAB基因影响酒精产量

菌种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063。

将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063中获得重组菌(含有pPICHB的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063)进行发酵实验。

固体培养基配制：量取5Bx麦汁200mL放入500mL烧杯中，在沸腾状态下加入4g琼脂，不断搅拌直至完全融化，分装于试管中高压灭菌，然后放斜面；液体培养基配制：量取5Bx麦汁110mL装入250mL三角瓶中，调pH4.8-5.0，然后高压灭菌；发酵培养基配制：称淀粉300g倒入1200mL 40℃温水中，搅拌均匀，加入0.2％氯化钙，调节pH6.0-6.2，称取液化酶1g，于90℃-93℃温度下液化30分钟，直至加入碘液不变色，液化结束后将其迅速冷却到58℃-60℃，并调pH值为4.4-4.6，加入1mL糖化酶(十万单位)进行糖化，在淀粉水解液的糖度在23Bx时停止，加入2％的玉米浆，并煮沸1小时，冷却过滤，然后调pH到4.8-5.0，灭菌待用。发酵时按10％(v/v)的接种量接入到发酵培养基中，30℃保温发酵72小时。乙醇浓度用高效液相色谱测量：发酵液8000g离心十分钟，取上清过滤后作为样品；色谱柱为Beckman公司L2Spherogel配合基交换柱，流动相为98％的浓硫酸∶H₂O(体积比为0.5∶1000)，流速1mL/min。

结果表明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063发酵液乙醇浓度为15％，而重组酵母的乙醇浓度为20％，提高了33％，phbCAB基因的引入，不仅可以改变细胞内的代谢流，而且PHA的合成能够提高重组酵母对高乙醇环境的耐受性，从而提高了乙醇的产量。

实施例14、在克鲁斯假丝酵母中表达phbCAB基因影响甘油产量

菌种：克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196。

斜面培养基成分为：葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，碳酸钙5g/L，琼脂20g/L。

种子培养基成分为：葡萄糖200g/L，尿素2g/L，玉米浆7g/L。

发酵培养基成分为：葡萄糖200g/L，尿素2g/L，玉米浆6g/L。

将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196中获得重组菌(含有pPICHB的克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)ACCC 2196)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196和重组菌分别接种到种子培养基(40mL/500mL锥形瓶)，在30℃、230rpm下培养12小时后，以10％(v/v)接种量接入发酵培养基，7.5L发酵罐装液量3L，自动控制pH5.5，温度30℃，通气量0.5L/min，搅拌转速450rpm，残糖接近0时停止发酵，测定发酵液中甘油含量。发酵液中甘油含量用高效液相色谱检测：发酵液8000g离心十分钟，取上清过滤后作为样品；色谱柱为Beckman公司L2 Spherogel配合基交换柱，流动相为98％的浓硫酸∶H₂O(体积比为0.5∶1000)，流速1mL/min。

结果表明克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196最终甘油浓度为62g/L，而重组菌为75g/L，提高了21％。在发酵过程中，有相当部分的碳源会流向乙醇合成，这降低了甘油的得率。乙醇途径是为细胞提供氧化力的一条途径，phbCAB基因得引入，能够降低乙醇途径的压力，促进糖酵解，使更多的碳源流向甘油合成，增加了甘油的得率。

实施例15、在热带假丝酵母中表达phbCAB基因影响十二碳二元酸的合成

菌种：热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH22248(任刚，陈远童，十二碳二元酸的发酵研究，生物工程学报，2000，16：198-202)。

斜面培养基成分为：10Bx的麦芽汁，1.5％琼脂粉。

种子培养基成分为：酵母膏5g，玉米浆3g，蔗糖5g，KH₂PO₄ 8g，加水定容至1L灭菌，接种时再加入尿素0.3％，重腊5％。

发酵培养基为：酵母膏2g，玉米浆1g，蔗糖2g，KH₂PO₄ 8g，NaCl 1g，加水定容至100mL灭菌，接种时再加正十二烷20％，尿素0.12％，重腊3.3％，pH 7.3。

将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH22248中获得重组菌(含有pPICHB的热带假丝酵母(Candidatropicalis)UH22248)进行发酵实验。

将斜面培养48小时的热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH22248和重组菌分别接种到种子培养基中(100mL/500mL摇瓶)，在30℃、180rpm下培养48小时后，接种3mL到100mL发酵培养基中，30℃、180rpm培养4天，发酵结束。取15ml发酵液，用6mol/LHCl调pH值到3.0，加入120mL乙醚，摇动100次，放置30分钟，然后倒出40mL乙醚提取液，通风橱中风干得到白色固体，然后将其用95％的中性热乙醇溶解，加入一滴酚酞，用标准NaOH溶液滴定，记录所用的NaOH，计算十二碳二元酸产量。

结果表明重组菌(十二碳二元酸产量为92g/L)显示出了比热带假丝酵母(Candidatropicalis)UH22248(十二碳二元酸产量为78g/L)更高的十二碳二元酸产量，发酵液比较粘稠，细胞处于一种低溶氧水平的环境，phbCAB基因的引入能够在这种条件下为细胞提供氧化力，同时其可能也对脂肪酸氧化途径有抑制作用，从而增加了发酵液中的二元酸产量。

实施例16、在热带假丝酵母中表达phbCAB基因影响十五碳二元酸的合成

菌种：热带假丝酵母(Candida tropicalis)T_25-14(陈远童，郝秀珍，庞月川，十五碳二元酸的发酵研究，微生物学报，1995，35：433-437)。

斜面培养基成分为：10Bx的麦芽汁，1.5％琼脂粉。

种子培养基成分为：酵母膏5g/L，玉米浆3g/L，蔗糖5g/L，KH₂PO₄ 8g/L配好灭菌，接种时再加入尿素0.3％，重腊5％。

发酵培养基为：酵母膏2g/L，玉米浆1g/L，蔗糖1g/L，KH₂PO₄ 8g/L，NaCl 1g/L加水定容至100mL灭菌，接种时再加正十五烷20％，尿素0.12％，pH 7.5。

将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到热带假丝酵母(Candida tropicalis)T_25-14中获得重组菌(含有pPICHB的热带假丝酵母(Candidatropicalis)T_25-14)进行发酵实验。

将斜面培养48小时的热带假丝酵母(Candida tropicalis)T_25-14和重组菌的种子分别接种到种子培养基中(50mL/500mL摇瓶)，在30℃、220rpm下培养48小时后，5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中(50mL/500mL摇瓶)，30℃、220rpm培养72小时。取15ml发酵液，用6mol/l HCl调pH值到3.0，加入120ml乙醚混匀，放置直到分层，除去水层，放出乙醚提取液，通风橱中风干得到白色固体，然后将其用95％的中性热乙醇溶解，加入一滴酚酞，用标准NaOH溶液滴定，记录所用的NaOH，计算二元酸产量。

结果表明热带假丝酵母(Candida tropicalis)T_25-14的二元酸产量为36g/L，重组菌为43g/L，提高了19％。重组菌发酵液比较粘稠，细胞处于一种低溶氧水平的环境，phbCAB基因的引入能够在这种条件下为细胞提供氧化力，同时其可能也对脂肪酸氧化途径有抑制作用，从而增加了发酵液中的二元酸产量。

实施例17、在苏云金芽孢杆菌中表达phbCAB基因对芽孢形成的影响

菌种：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068。

将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068中获得重组菌(含有pEUHB的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068和重组菌，分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在25℃、220rpm下培养12小时后，以1％(v/v)接种量接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶)，25℃，220rpm发酵36小时。培养基成分均为：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，pH7.2。发酵后用血球计数板计量孢子含量。

通过显微镜观测可以看到，重组菌的菌体量(10.2*10⁹个/ml)以及孢子数(1.5*10⁹个/ml)都高于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068(菌体量9.1*10⁹个/ml，孢子数1.1*10⁹个/ml)。发酵实验表明高溶氧是有利于孢子形成的。phbCAB基因的引入，能够促进孢子形成。

实施例18、在枯草芽孢杆菌中表达phbCAB影响鸟苷合成

菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220。

种子培养基成分为葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，玉米液10g/L，氯化钠5g/L，尿素2g/L，味精5g/L，pH 7.0-7.2。

发酵培养基成分为葡萄糖120g/L，豆饼水解液50g/L，酵母粉16g/L，硫酸铵15g/L，七水硫酸镁4g/L，磷酸氢二钾2g/L，味精10g/L，碳酸钙2g/L，pH 7.0-7.2。

将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB通过乙酸锂转化的方法转入到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220中获得重组菌(含有pEUHB的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 19220)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在36℃、140rpm下培养10小时后，以10％(v/v)接种量接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶)，36℃、220rpm下培养60小时，测定鸟苷含量。鸟苷含量用HPLC测定，流动相为0.5％磷酸氢二钾，流速1.2mL/min，色谱柱为Hypersil ODS C18反相柱，检测波长为254nm。

结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220鸟苷产量为16g/L，重组菌的产量为20g/L，提高了25％。在细胞内代谢途径中，为鸟苷合成提供前体的单磷酸己糖途径会消耗大量的NADP，高的NADP/NADPH水平能够有效的促进鸟苷的合成。phbCAB基因的引入，正能实现这一要求，因此能够显著的提高鸟苷的产量。

实施例19、在酿酒酵母中表达phbCAB基因影响谷胱甘肽产量

菌种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186(Sakato K，Tanaka H.Advancedcontrol of glutathione fermentation process.Biotechnol Bioeng，1992，40：904-912)。

斜面培养基成分为：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2。

种子培养基成分为：葡萄糖30g/L，酵母粉6g/L，磷酸氢二铵3g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH 7.0-7.2。

发酵培养基为：葡萄糖70g/L，酵母粉15g/L，麦汁60g/L，磷酸氢二铵10g/L，硫酸镁5g/L，蜜糖28g/L，玉米浆16g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，ZnCl₂ 10mg/L，FeCl₂ 6mg/L，CuCl₂ 6mg/L，MnCl₂ 6mg/L，pH 7.0-7.2。

将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化转入到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186中获得重组菌(含有的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)KY6186)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在30℃、180rpm下培养24小时后，以10％(v/v)接种量接入发酵培养基，7.5L发酵罐中装液量3L发酵，自动控制温度30℃，pH5.4，通气量2L/min，前两小时转速200rpm，之后每小时升高100rpm，直到600rpm，维持到发酵结束，36小时停止发酵。取发酵得到的新鲜酵母用蒸馏水洗三次后，在40％的乙醇中，30℃萃取2小时，3000g离心，取上清用ALLOXAN法(上海市医药化验所临床生化检验(上册)，上海，上海科学与技术出版社，1979)测定谷胱甘肽含量。

结果表明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186发酵液谷胱甘肽浓度为1.3g/L，而重组菌的谷胱甘肽浓度为1.6g/L，提高了23％。研究表明乙醇合成的降低有利于谷胱甘肽的合成，而乙醇合成是一个消耗还原力，获得氧化力的过程，phbCAB基因的引入可以抑制乙醇的合成，提高谷胱甘肽产量。

实施例20、在球拟酵母中表达phbCAB基因对赤藓糖醇产量的影响

菌种：球拟酵母(ToruLopsis sp)B845(吴燕，杨晓伟，陆茂林，赤藓糖醇产生菌B845的形态，生理特征，生物技术，2002，12：20-21)。

斜面培养基成分为：葡萄糖10％，酵母膏1％，脲0.1％，琼脂2％，pH 7.0-7.2。

种子和发酵培养基为：葡萄糖20％，酵母膏0.5％，脲0.1％，pH 7.0-7.2。

将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以电转化的方法转入到球拟酵母(ToruLopsis sp)B845中获得重组菌(含有pPICHB的球拟酵母(ToruLopsis sp)B845)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的球拟酵母(ToruLopsis sp)B845和重组菌分别接种到种子培养基(40mL/500mL锥形瓶)，在30℃、180rpm下培养3天后，以5％(v/v)接种量接入发酵培养基中(50mL/500mL锥形瓶)，30℃、180rpm下培养3天，测定赤藓醇的产量。赤藓糖醇产量用高碘酸氧化法测量(原野，应向贤，范光先，诸葛健，高碘酸氧化法直接测定发酵液中赤藓糖醇，无锡轻工大学学报，2000，19：72-75)。结果表明球拟酵母(ToruLopsis sp)B845的赤藓糖醇产量为50g/L，重组菌为55g/L，提高在10％左右，作为赤藓糖醇生产菌，需要有良好的耐高渗能力和代谢碳源能力，而phbCAB基因的引入，导致胞内PHA的合成，是有利于提高上述能力的，因此对赤藓糖醇的合成也有一定的促进作用。

实施例21、在短小芽孢杆菌中表达phbCAB基因影响D-核糖产量

菌种：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095。

种子培养基成分为：葡萄糖20g/L，玉米浆26g/L，磷酸氢二钾0.03g/L，磷酸二氢钾0.01g/L，pH 6.7。

发酵培养基成分为：葡萄糖180g/L，玉米浆28g/L，硫酸铵13g/L，硫酸锰0.05g/L，pH 7.0。

将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以乙酸锂转化的方法转入到短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095中获得重组菌(含有pEUHB的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)ATCC 31095)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在37℃、180rpm下培养18-20小时，以10％(v/v)的接种量接入到发酵培养基中。7.5L发酵罐装液量3L，控制温度37℃，通气量3L/min，搅拌速度650rpm，发酵72小时，测定发酵液中的D-核糖含量。D-核糖用地衣酚法测量：发酵液5000g离心10分钟，上清用蒸馏水稀释，使核糖量控制在10-90g/3mL范围内；取3mL稀释液，依次加入0.1％氯化铁浓盐酸溶液3mL，0.1％地衣酚乙醇溶液0.3mL，摇匀，沸水浴40分钟，自来水冷却后在60分钟内测量670nm吸光度值，通过标准曲线计算核糖浓度。结果表明短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095的核糖浓度为55g/L，而重组菌可以达到72g/L，上升了31％。细胞内核糖的合成是通过磷酸戊糖途径，这个途径消耗大量的细胞内氧化力，而通过增加溶氧满足细胞的代谢需求会促进孢子的形成，这不利于通过细胞营养生长生产核糖，因此phbCAB基因的引入，能从内源的途径为细胞提供一定的氧化力NADPH，从而有利于核糖的合成。

实施例22、在大肠杆菌中表达phbCAB提高细菌对重金属离子Hg²⁺的耐受性

菌种：大肠杆菌(Escherichia coli)JM109。

大肠杆菌(Escherichia coli)JM109的基本培养基为LB培养基(g/100mL)：蛋白胨1.0；酵母提取物0.5；NaCl 1.0，pH 7.0。

重组菌的基本培养基为：LB培养基中加入氨苄青霉素至终浓度60μg/mL。

将质粒pBHR68用电转化的方法转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109获得重组菌(含有pBHR68的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109)。野生型E.coli JM109作为对照。

将大肠杆菌(Escherichia coli)JM109和重组菌分别接入加入了1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、8mg/L或10mg/L HgCl₂的各自的基本培养基中，培养条件为500mL三角瓶装液量100mL，37℃，200rpm，培养24小时，测定发酵液的OD₆₀₀。结果表明当Hg²⁺浓度为4mg/L时，重组菌的生长受到一定抑制，最大OD₆₀₀从2.7降到了1.9；当Hg²⁺浓度上升到10mg/L时，菌体生长几乎完全停止。实验还表明对于未经外源基因转化的原始宿主菌E.coli JM109，在Hg²⁺浓度为2mg/L时就完全不能生长。PHB基因的转入使细菌对汞的耐受力得到了增强。

在相同操作条件下两种菌体从2.5mg/L Hg²⁺浓度的模拟废水中富集汞离子，重组菌的最终富集量为5.1mg/g细胞干重，而原始E.coli JM109则仅为1.7mg/g细胞干重。其中，细胞干重用冰干法测量。

实验表明加入PHB合成基因的重组菌与大肠杆菌(Escherichia coli)JM109相比对于Hg²⁺的耐受程度有了较大的提高，在相同的条件下能够更好的在含有重金属离子的培养基中生长。

实施例23、移动单胞菌中表达phbCAB提高细菌的对高酒精环境耐受性

菌种：移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286。

将按照实施例11的方法获得的质粒pBBRHB以电转化的方法转入到移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286中获得重组菌(含有pBBRHB的移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286)进行发酵实验。

种子培养基组分(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨10，酵母膏15，pH 6.0。

发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖150，蛋白胨25，酵母膏25，pH4.5或pH6.0。

发酵液中乙醇质量浓度、菌体浓度、还原糖质量浓度的测定参考(Ingram LO，GomezPF，Lai X，Moniruzzaman M，Wood BE，Yomano LP and York SW.Metabolic engineeringof bacteria for ethanol production.Biotechnol.Bioeng.1998，58：204-214)

培养条件：

冰箱保藏的菌种分别接入种子培养基中，培养12小时后，以10％(v/v)的接种量分别接入发酵培养基中，进行静止厌氧乙醇发酵。

发酵三角瓶250mL，装液量为100mL，发酵pH4.5(重组菌)，温度35℃，发酵时间48小时。移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286的发酵pH 4.5和6.0作为对照。

实验表明，移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286在pH 4.5和6.0的乙醇产量分别为21.1g/L和62.5g/L，重组菌在pH4.5的乙醇产量为59.2g/L，接近移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286在pH 6.0时的水平，表明phbCAB基因的转入有效的提高了细菌的耐酸性，进一步优化发酵条件可以在较低的pH下实现乙醇的高效生产。

实施例24、在移动假单胞菌中表达phbCAB提高细菌对葡萄糖的利用能力

菌种：移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286。

将按照实施例11的方法获得的质粒pBBRHB以电转化的方法转入到移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286中获得重组菌(含有pBBRHB的移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286)进行发酵实验。

种子培养基组分(g/L)：蛋白胨10，酵母膏15，pH 6.0。

发酵培养基组分(g/L)：蛋白胨25，酵母膏25，pH 6.0，葡萄糖。其中，葡萄糖的浓度分别为120，150，160，180，210g/L梯度。

发酵液中乙醇质量浓度、菌体浓度、还原糖质量浓度的测定参考(Ingram LO，GomezPF，Lai X，Moniruzzaman M，Wood BE，Yomano LP and York SW.Metabolic engineeringof bacteria for ethanol production.Biotechnol.Bioeng.1998，58：204-214)

培养条件：

冰箱保藏的菌种分别接入种子培养基中，培养12小时后，以体积分数10％的接种量分别接入发酵培养基中，进行静止厌氧乙醇发酵。

发酵三角瓶500mL，装液量为100mL，发酵pH 6.0，温度35℃，发酵时间48h。分别在不同浓度的葡萄糖条件下培养移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286和重组菌。

实验结果表明，移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286在葡萄糖浓度150g/L时，乙醇的产量达到最大，为65g/L，而重组菌在葡萄糖浓度增加到210g/L时乙醇的产量一直是上升趋势，最大为95g/L。PHB合成途径的导入使得细菌对于渗透压的抗性增强，初糖浓度很高时依然保持良好的生长。移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286的乙醇发酵过程有着比酵母更高的葡萄糖的利用率，但是当初始的葡萄糖浓度达到一定程度后，乙醇产量反而下降。当转入PHB的合成基因后，发酵达到乙醇最大产量的初糖浓度比移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286有了一定的提高。表明phbCAB的转入有利于提高细菌对渗透压抵抗程度。

实施例25、在丁酸梭芽孢杆菌中表达phbCAB提高从甘油发酵制备1，3-丙二醇(1，3-PDO)的生产

菌种：丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260。

将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以乙酸锂转化的方法转入到丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260中获得重组菌(含有pEUHB的丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260)进行发酵实验。

该发酵需厌氧培养，发酵培养基为：甘油6％，葡萄糖1％，玉米浆2％，(NH₄)₂SO₄0.2％。发酵温度为34℃，初始pH为6.5～7。

培养条件：

间歇发酵分为两步进行，首先将丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260和重组菌分别接于装液量为100mL的150mL三角瓶中，在厌氧条件下，于36℃，100rpm，培养15h，然后以10％(v/v)的接种量接入装液量为200mL的250mL三角瓶中，石蜡液封，于34℃、150rpm、初始pH 6.8进行发酵。定期取样测定甘油残余量和1，3-PDO的生成量。

发酵液中甘油和1，3-PDO的浓度用气相色谱法检测，色谱柱为大口径毛细管，0.5mm×20m，柱温170℃、气化室温度260℃，载气为氮气，流速50mL/min，采用内标法(内标物质为1，62己二醇)定量。

产物分离：发酵液离心后，上清液用油浴蒸馏得到1，3-PDO产品。

菌体生长的生物量：用比色法检测(OD₆₅₀nm)。

丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260的1，3-丙二醇产量为15.7g/L，而重组菌为20.4g/L。丁酸梭杆菌的生长pH在6～7.5之间，其以甘油为底物的发酵代谢的副产物主要为丁酸和乙酸，因而在发酵过程中的酸度的上升将会严重影响菌体生长，同时抑制1，3-PDO生成。由此可见要获得高产的1，3-PDO在发酵过程中须将pH控制在6.5～7之间。如果将PHB的合成基因导入到细菌中，使得细菌对酸性条件的耐受性增强，则可以在不用调节pH的条件下获得较高的1，3-PDO产量。

实施例26、芽孢杆菌中表达phbCAB提高细菌厌氧条件下的对原油的分解

菌种：芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23(李清心，康从宝，王浩，张长铠，芽孢杆菌发酵条件的优化及其在室内条件下提高原油采收率的初步研究，工业微生物，2002，32：28-31)。

重组菌的获得：将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以乙酸锂转化的方法转入到芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23中获得重组菌(含有pEUHB的芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23)进行发酵实验。

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，Na₂HPO₄ 4，KH₂PO₄ 2，MgSO₄ 0.5，CaCl₂ 0.005，pH7.2。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，(NH₄)₂SO₄ 15，Na₂HPO₄ 2，KH₂PO₄ 2，MgSO₄ 0.5，pH 7.2。

将芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23和重组菌菌种分别接入种子培养基中，培养12小时后，以体积分数10％的接种量分别接入发酵培养基中，发酵三角瓶500mL，装液量为100mL，温度35℃，发酵时间48小时。

发酵液中菌体浓度测定

取培养液经6000g离心30分钟后，用等量蒸馏水制成菌悬液，然后稀释，用722型分光光度计于660nm处测定菌悬液的OD值，事先作好标准曲线，求得标准曲线的方程，然后依此测得发酵液中菌体浓度。

原油降粘实验：将不同浓度的芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23或重组菌的发酵液，加入到来源不同的原油中，45℃培养24h，用离心机离心脱水后，再用粘度计测粘度的变化，求出降粘率。对于来源不同的原油，细菌的降粘效果有所不同，可能是这些原油的组成成分不同所致。原油中含有丰富的烃类、胶质、沥青质类等物质，从而使得原油具有一定的粘度。细菌在原油中生长时可以利用原油中的成分作为其生长的碳源，因此，对于其能降低原油粘度的原因分析有以下两种可能：一是通过对原油中烃类及其它物质的降解使原油的粘度下降；二是微生物利用原油产生了一些代谢产物，这些产物的作用使原油粘度下降。

通过野生菌(芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23)和转入PHB合成基因的重组菌的比较可以看出，重组菌对于原油的降粘作用更为明显，以一种原油的结果为例，结果表明重组菌在原油中的生长情况好于芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23，因而对原油的降粘效果更好。这是由于PHB合成基因的转入使得细菌对渗透压的抗性提高，能在原油中更好的生长。

表1野生菌和重组菌的降粘效果比较

加入菌液占总体积的百分比(％)	0	0.5	1	2	5
						原油粘度野生菌降粘率(％)	2100	2042.8	1966.7	18312.8	15128.1

原油粘度重组菌降粘率(％)

2100

2023.8

1909.5

17118.6

13336.7

实施例27、在嗜酸乳杆菌中表达phbCAB提高细菌在酸性条件下的存活率

菌种：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671。

按照实施例1的方法获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671中获得重组菌(含有pEUHB的嗜酸乳杆菌(Lac tobacillus acidophilus)ATCC 53671)进行发酵实验。

实验方法如下：

菌种传代培养基：12.8g脱脂奶粉溶于100mL蒸馏水中，121℃灭菌15min。

计数培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，酵母膏0.6％，葡萄糖0.5％，琼脂1.8％，pH6.8，121℃灭菌20min。

豆汁的制备：将大豆室温(20℃左右)浸泡48小时，使大豆充分溶涨，磨浆(水∶豆＝3∶1)，两层纱布过滤除去豆渣即得。115℃灭菌15min。

不同pH值豆汁的制备：以乳酸作为调节剂，将豆汁pH值分别调至4.0、4.5、5.0或5.5。豆汁的自然pH值为6.5左右，配制是在磁力搅拌器上进行，用pH酸度计监测。

保存实验：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671和重组菌分别于豆汁培养基(pH6.5)中培养48小时，然后取菌液分别添加至不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5)的灭菌豆汁中，使活菌数目为1×10⁷-10⁸cfu/ml，置于4℃冰箱中保存10周，检测活菌数目变化。其中，计数方法：根据样品中含菌量的不同，作10倍系列浓度稀释，倒平板，37℃恒温培养72小时，计菌落数。存活率的计算：存活率＝样品的活菌数目/样品中起始活菌数目×100％。

结果表明嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671在不同的pH值的豆汁中保存，存活率不同，pH 4.0下存活率最低(2％)，pH 5.0最高(11％)。在pH 4.5-pH5.5中保存，存活率变化不明显都在9％左右。10周保存实验的结果表明，pH 5.5下的存活率(9％)仅高于pH 4.5(8.2％)下的不足一倍。从活菌数目上看，10周后pH 4.0下活菌数目仍能维持在1×10⁶cfu/ml以上水平，pH 4.5-5.5都在1×10⁷cfu/ml以上水平。

重组菌的存活率在实验的几个pH(4.0、4.5、5.0、5.5)下变化不明显，都在20％左右，活菌的数目较野生菌有明显的提高，10周保存实验的活菌数目均在1×10⁷cfu/ml以上水平。表明PHB的合成提高了细菌在酸性条件下的活菌数目。

重组的嗜酸乳杆菌在较低pH值(4.0、4.5)培养条件下具有较高的存活率和活菌数目在生产上具有重要的意义：一方面可以提高存活率，使制剂具有较高的活菌数：另一方面，较低的pH值环境可防止杂菌污染。

实施例28、从脂肪酸β-氧化途径合成PHA的相关基因在荧光假单胞菌中的表达影响葡萄糖酸产量

菌种：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55。

斜面培养基成分为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，pH7.0。

种子培养基成分为：葡萄糖2％，玉米浆1％，尿素0.2％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，pH7.0。

发酵培养基成分为：淀粉水解糖14％，玉米浆1.5％，轻质碳酸钙4％，pH 6.7。

在标准的聚合酶链式反应条件下，以质粒pEE32(Fukui T，Doi Y.Cloning andanalysis of the poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)biosynthesis geneof Aeromonas caviae.J.Bacteriol.，1997，179：4821-4830)为模板，用引物TAAGGTACCGAAGGAGAGCACATGAGCCA和TCTAAGCTTGGCTGATTGTGCCTGCGTG扩增出phaCJ基因，然后经过KpnI和HindIII酶切处理后，插入到质粒pBBR1MCS2的限制性内切酶KpnI和HindIII的识别位点间，获得质粒pBBRCJ。pBBRCJ以电转化的方法转入到荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55中获得重组菌(含有pBBRCJ的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在30℃、230rpm下培养16小时后，以10％(v/v)接种量分别接入发酵培养基。发酵瓶500mL装液量50mL，在30℃、230rpm下培养72小时，测定发酵液中酮基葡萄糖酸含量。发酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法测定：发酵液中酮基葡萄糖酸含量＝25℃下发酵液旋光度绝对值/0.88。

结果表明荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55的发酵液中酮基葡萄糖酸含量为13.6g/L，重组菌的产量为15.8g/L，提高了大约16％，phaCJ基因的导入，能够在细胞内积累PHA，有利于提高菌的的耐受力，生长得更好，从而得到更高的转化率。

实施例29、从脂肪酸从头合成途径合成PHA的相关基因在枯草芽孢杆菌中的表达影响肌苷的生物合成

菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162。

种子培养基成分为葡萄糖20g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，玉米液7g/L，氯化钠2.5g/L，尿素2g/L，pH值7.0。

发酵培养基成分为葡萄糖140g/L，玉米液16g/L，酵母粉16g/L，尿素9g/L，硫酸铵16g/L，七水硫酸镁4g/L，磷酸氢二钾5g/L，碳酸钙20g/L，pH值7.0。

在标准的聚合酶链式反应条件下，以质粒pQH-CG(邱远征，聚羟基丁酸羟基己酸酯生物合成途径的基因工程改造，清华大学，2005，博士论文。)为模板，用引物ATACGACTCACTATAGGGC和AGTGCCAGATCTCGCAACGCAATTAATG扩增出phaGC基因，然后经过BamHI和BglII酶切处理后，插入到质粒pEU308的限制性内切酶BglII和BamHI的识别位点间，获得质粒pEUGC。pEUGC以乙酸锂转化的方法转入到枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 19162中获得重组菌(含有pEUGC的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在32℃、200rpm下培养12小时后，以5％(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L，自动控制温度35℃，pH 6.5，搅拌速度600rpm，通气量1L/min，发酵时间68小时(肌苷产量不再增加)，测定发酵液中肌苷含量。肌苷含量用HPLC测定，流动相为0.5％磷酸氢二钾，流速1.2mL/min，色谱柱为Hypersil ODS C18反相柱，检测波长为254nm。结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 19162的肌苷产量为19.7g/L，重组菌的产量为24.9g/L，提高了26.4％。在细胞内代谢途径中，为肌苷合成提供前体的单磷酸己糖途径会消耗大量的NADP，同时从6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途径的调控酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶受到NADPH的反馈抑制，因此NADPH的减少能促进葡萄糖向磷酸戊糖途径的转化。总的来说，肌苷合成是一个需要大量氧化力的生化代谢过程，高的NADP/NADPH水平能够有效的促进肌苷的合成。phaG C基因的引入，能够促进脂肪酸的从头合成途径，提高细胞内的氧化力，因此能够显著的提高肌苷的产量。

实施例30、在移动假单胞菌中表达phbCAB基因影响乙醇产量

菌种：移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286。

斜面培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉15g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸铵1g/L，七水硫酸镁1g/L，NaCl 1g/L，琼脂15g/L，pH值7.0。

种子培养基成分为：葡萄糖100g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.0。

发酵培养基成分为：葡萄糖200g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.0。

将按照实施例11的方法获得的质粒pBBRHB以电转化的方法转入到移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286中获得重组菌(含有pBBRHB的移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286)进行发酵实验。

分别取培养在新鲜斜面上的移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在30℃、200rpm下培养16小时后，以10％(v/v)接种量分别接入发酵培养基。发酵瓶500mL装液量50mL，在30℃、200rpm下培养72小时，测定发酵液中的乙醇含量。乙醇浓度用高效液相色谱测量：发酵液8000g离心十分钟，取上清过滤后作为样品；色谱柱为Beckman公司L2Spherogel配合基交换柱，流动相为98％的浓硫酸∶H₂O(体积比为0.5∶1000)，流速1mL/min。

结果表明野生菌的发酵液乙醇浓度为14％，重组菌的乙醇浓度为18％，提高了28％，phbCAB基因的引入，不仅可以改变细胞内的代谢流，而且PHA的合成能够提高细菌对高乙醇环境的耐受性，从而提高了乙醇的产量。

                                  序列表

<160>1

<210>1

<211>3884

<212>DNA

<213>Wautersia eutropha

<400>1

ataaagctta aggaggatgg cgaccggcaa aggcgcggca gcttccacgc aggaaggcaa      60

gtcccaacca ttcaaggtca cgccggggcc attcgatcca gccacatggc tggaatggtc     120

ccgccagtgg cagggcactg aaggcaacgg ccacgcggcc gcgtccggca ttccgggcct     180

ggatgcgctg gcaggcgtca agatcgcgcc ggcgcagctg ggtgatatcc agcagcgcta     240

catgaaggac ttctcagcgc tgtggcaggc catggccgag ggcaaggccg aggccaccgg     300

tccgctgcac gaccggcgct tcgccggcga cgcatggcgc accaacctcc catatcgctt     360

cgctgccgcg ttctacctgc tcaatgcgcg cgccttgacc gagctggccg atgccgtcga     420

ggccgatgcc aagacccgcc agcgcatccg cttcgcgatc tcgcaatggg tcgatgcgat     480

gtcgcccgcc aacttccttg ccaccaatcc cgaggcgcag cgcctgctga tcgagtcggg     540

cggcgaatcg ctgcgtgccg gcgtgcgcaa catgatggaa gacctgacac gcggcaagat     600

ctcgcagacc gacgagagcg cgtttgaggt cggccgcaat gtcgcggtga ccgaaggcgc     660

cgtggtcttc gagaacgagt acttccagct gttgcagtac aagccgctga ccgacaaggt     720

gcacgcgcgc ccgctgctga tggtgccgcc gtgcatcaac aagtactaca tcctggacct     780

gcagccggag agctcgctgg tgcgccatgt ggtggagcag ggacatacgg tgtttctggt     840

gtcgtggcgc aatccggacg ccagcatggc cggcagcacc tgggacgact acatcgagca     900

cgcggccatc cgcgccatcg aagtcgcgcg cgacatcagc ggccaggaca agatcaacgt     960

gctcggcttc tgcgtgggcg gcaccattgt ctcgaccgcg ctggcggtgc tggccgcgcg    1020

cggcgagcac ccggccgcca gcgtcacgct gctgaccacg ctgctggact ttgccgacac    1080

gggcatcctc gacgtctttg tcgacgaggg ccatgtgcag ttgcgcgagg ccacgctggg    1140

cggcggcgcc ggcgcgccgt gcgcgctgct gcgcggcctt gagctggcca ataccttctc    1200

gttcttgcgc ccgaacgacc tggtgtggaa ctacgtggtc gacaactacc tgaagggcaa    1260

cacgccggtg ccgttcgacc tgctgttctg gaacggcgac gccaccaacc tgccggggcc    1320

gtggtactgc tggtacctgc gccacaccta cctgcagaac gagctcaagg taccgggcaa    1380

gctgaccgtg tgcggcgtgc cggtggacct ggccagcatc gacgtgccga cctatatcta    1440

cggctcgcgc gaagaccata tcgtgccgtg gaccgcggcc tatgcctcga ccgcgctgct    1500

ggcgaacaag ctgcgcttcg tgctgggtgc gtcgggccat atcgccggtg tgatcaaccc    1560

gccggccaag aacaagcgca gccactggac taacgatgcg ctgccggagt cgccgcagca    1620

atggctggcc ggcgccatcg agcatcacgg cagctggtgg ccggactgga ccgcatggct    1680

ggccgggcag gccggcgcga aacgcgccgc gcccgccaac tatggcaatg cgcgctatcg    1740

cgcaatcgaa cccgcgcctg ggcgatacgt caaagccaag gcatgacgct tgcatgagtg    1800

ccggcgtgcg tcatgcacgg cgccggcagg cctgcaggtt ccctcccgtt tccattgaaa    1860

ggactacaca atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt    1920

tggcggctcg ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc    1980

gctggagcgc gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct    2040

gaccgccggt tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc    2100

gatggtgccg gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct    2160

ggccgccaac gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa    2220

catgagcgcc gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc    2280

caagctggtc gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat    2340

gggcatcacc gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga    2400

gttcgccgtc ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga    2460

agagatcgtc ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga    2520

cgagttcgtg cgccagggcg ccacgctgga cagcatgtcc ggcctcaagc ccgccttcga    2580

caaggccggc acggtgaccg cggccaacgc ctcgggcctg aacgacggcg ccgccgcggt    2640

ggtggtgatg tcggcggcca aggccaagga actgggcctg accccgctgg ccacgatcaa    2700

gagctatgcc aacgccggtg tcgatcccaa ggtgatgggc atgggcccgg tgccggcctc    2760

caagcgcgcc ctgtcgcgcg ccgagtggac cccgcaagac ctggacctga tggagatcaa    2820

cgaggccttt gccgcgcagg cgctggcggt gcaccagcag atgggctggg acacctccaa    2880

ggtcaatgtg aacggcggcg ccatcgccat cggccacccg atcggcgcgt cgggctgccg    2940

tatcctggtg acgctgctgc acgagatgaa gcgccgtgac gcgaagaagg gcctggcctc    3000

gctgtgcatc ggcggcggca tgggcgtggc gctggcagtc gagcgcaaat aaggaagggg    3060

ttttccgggg ccgcgcgcgg ttggcgcgga cccggcgacg ataacgaagc caatcaagga    3120

gtggacatga ctcagcgcat tgcgtatgtg accggcggca tgggtggtat cggaaccgcc    3180

atttgccagc ggctggccaa ggatggcttt cgtgtggtgg ccggttgcgg ccccaactcg    3240

ccgcgccgcg aaaagtggct ggagcagcag aaggccctgg gcttcgattt cattgcctcg    3300

gaaggcaatg tggctgactg ggactcgacc aagaccgcat tcgacaaggt caagtccgag    3360

gtcggcgagg ttgatgtgct gatcaacaac gccggtatca cccgcgacgt ggtgttccgc    3420

aagatgaccc gcgccgactg ggatgcggtg atcgacacca acctgacctc gctgttcaac    3480

gtcaccaagc aggtgatcga cggcatggcc gaccgtggct ggggccgcat cgtcaacatc    3540

tcgtcggtga acgggcagaa gggccagttc ggccagacca actactccac cgccaaggcc    3600

ggcctgcatg gcttcaccat ggcactggcg caggaagtgg cgaccaaggg cgtgaccgtc    3660

aacacggtct ctccgggcta tatcgccacc gacatggtca aggcgatccg ccaggacgtg    3720

ctcgacaaga tcgtcgcgac gatcccggtc aagcgcctgg gcctgccgga agagatcgcc    3780

tcgatctgcg cctggttgtc gtcggaggag tccggtttct cgaccggcgc cgacttctcg    3840

ctcaacggcg gcctgcatat gggctgacct gccggatcga taac                     3884

Claims (10)

1、一种调控微生物代谢的方法，是在微生物中合成聚羟基脂肪酸酯；所述聚羟基脂肪酸酯的合成是通过在所述微生物中引入聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因而实现的。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因选自下述1)，2)和3)中的任意一种：1)phbCAB基因，2)phaG和phaC基因，3)phaJ和phaC基因。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述phbCAB基因为具有序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；所述PhaG基因为AF052507；所述phaC基因来自于AY093685，所述phaJ基因来自于AY093685。

4、根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述调控微生物代谢为调控微生物对发酵产物的生产能力。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述微生物为细菌，古细菌和真菌；所述发酵产物包括有机酸，醇类，抗生素，氨基酸和维生素。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述微生物为兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)，优选为兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC 39920，所述发酵产物为乳酸和透明质酸；

所述微生物为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)，优选为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019，所述发酵产物为丙酮酸；

所述微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338，所述发酵产物为麦角固醇；

所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162，所述发酵产物为肌苷；

所述微生物为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)，优选为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B，所述发酵产物为弹性蛋白酶；

所述微生物为红酵母(Rhodotorula glutinis)，优选为红酵母(Rhodotorulaglutinis)NCIM 3353，所述发酵产物为类胡萝卜素；

所述微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032，所述发酵产物为谷氨酰胺；

所述微生物为乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，优选为乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269，所述发酵产物为赖氨酸；

所述微生物为大肠杆菌(Escherichia.coli)，优选为大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882，所述发酵产物为苯丙氨酸；

所述微生物为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，优选为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55，所述发酵产物为葡萄糖酸；

所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556，所述发酵产物为α-淀粉酶；

所述微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063，所述发酵产物为乙醇；

所述微生物为克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)，优选为克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196，所述发酵产物为甘油；

所述微生物为热带假丝酵母(Candida tropicalis)，优选为热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH22248，所述发酵产物为十二碳二元酸；

所述微生物为热带假丝酵母(Candida tropicalis)，优选为热带假丝酵母(Candida tropicalis)T_25-14，所述发酵产物为十五碳二元酸；

所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220，所述发酵产物为鸟苷；

所述微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186，所述发酵产物为谷胱甘肽；

所述微生物为球拟酵母(ToruLopsis sp)，优选为球拟酵母(ToruLopsis sp)B845，所述发酵产物为赤藓糖醇；

所述微生物为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，优选为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095，所述发酵产物为D-核糖；

所述微生物为丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)，优选为丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260，所述发酵产物为1，3-丙二醇；

所述微生物为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，优选为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55，所述发酵产物为葡萄糖酸；

所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162，所述发酵产物为肌苷；

所述微生物为移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选为移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286，所述发酵产物为乙醇。

7、一种提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羟基脂肪酸酯；所述聚羟基脂肪酸酯的合成是通过在所述微生物中引入聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因而实现的。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因选自下述1)，2)和3)中的任意一种：1)phbCAB基因，2)phaG和phaC基因，3)phaJ和phaC基因。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述phbCAB基因优选为具有序列表中SEQID NO：1的DNA序列；所述PhaG基因优选为AF052507，所述phaC基因优选为来自于AY093685，所述phaJ基因优选为来自于AY093685。

10、根据权利要求7、8或9所述的方法，其特征在于：所述微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063，所述逆境胁迫为冷胁迫或热胁迫；

所述微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)，优选为大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109，所述逆境胁迫为重金属离子胁迫；所述重金属离子为Hg2+；

所述微生物为移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选为移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286，所述逆境胁迫为低pH胁迫或高渗透压胁迫；

所述微生物为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，优选为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671，所述逆境胁迫为低pH胁迫；

所述微生物为芽孢杆菌，优选为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，尤其优选为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068；

所述微生物为芽孢杆菌，优选为芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23；所述逆境胁迫为原油胁迫。