CN108865906B - 一株具有高增殖性能的海洋酵母菌 - Google Patents

一株具有高增殖性能的海洋酵母菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一株具有高增殖性能的海洋酵母菌，命名为：海洋酵母WHH‑2株，该菌株已于2017年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.14432。本发明的酵母菌在pH 9～11的比较高的碱性环境下仍能够具有较高的存活率，且增殖性能极强，培养后容易分层析出，有利于工业化利用。

Description

一株具有高增殖性能的海洋酵母菌
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株具有高增殖性能的海洋酵母菌。
背景技术
酵母是一单细胞真菌，是一种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和 二氧化碳，分布于整个自然界，是一种典型的兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下都能够 存活，是一种天然发酵剂。
在饮料领域中，酵母菌也得到了广泛的应用。但是目前的大多数酵母的存活对环境pH 的要求较高，一般只能在较为狭窄的pH范围内存活。比如目前市售的面包酵母，其只能在 pH 3～8区间较好存活，在pH 8以上的碱性区间则完全不能生存，因此pH 8是该菌株存活 的极限pH值。
此外，现有的酵母菌的增殖性能也不够理想，培养后也相对不容易分层析出，不利于 工业化利用。因此，有必要开发出一种在pH比较高的碱性环境下仍能够保持较好增殖性能、 利于工业化利用的新的酵母菌株。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株具有高增殖性能的海洋酵母菌。本发明的 酵母菌在pH比较高的碱性环境下仍能够具有较高的存活率，且增殖性能极强，培养后容易 分层析出，有利于工业化利用。
本发明的具体技术方案为：一株具有高增殖性能的海洋酵母菌，命名为：海洋酵母WHH-2株，该菌株已于2017年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.14432。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，微生物分类命名为Saccharomyces cerevisiae。
作为优选，所述海洋酵母WHH-2株具有在pH值为3-11的环境下生长增殖的能力。
作为优选，所述海洋酵母WHH-2株具有在pH值为9-11的环境下生长增殖的能力。
目前大多数酵母的存活和增殖对环境pH的要求较高，一般只能在较为狭窄的pH范围 内存活和增殖。比如目前市售的面包酵母，其只能在pH 3～8区间实现较好生长增殖，在pH 8以上的碱性区间则完全不能生长，因此pH 8是该菌株的生长极限pH值。此外，现有的酵母菌的增殖性能也不够理想，培养后也相对不容易分层析出，不利于工业化利用。
本发明的海洋酵母WHH-2株除了在pH 3～8区间能很好生长增殖外，在pH 9～11的比较高的碱性区间也能很好生长，pH 11是该菌株的生长极限pH值。并且，本发明的海洋酵母WHH-2株还具有极强的增殖性能，与现有的市售面包酵母相比，湿菌泥得率显著提高。 此外，本发明人通过研究表明，本发明的海洋酵母WHH-2株的菌体在实际生产中更容易分 层析出，工业化生产成本更低。
作为优选，所述海洋酵母WHH-2株的18S rDNA序列如SEQ ID No.1所示；海洋酵母WHH-2株的ITS-5.8S rRNA序列如SEQ ID No.2所示。
所述海洋酵母WHH-2株应用于发酵食品、发酵乳制品、发酵果蔬汁饮料、发酵茶饮料、奶粉及各种固体饮食品中。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
本发明的酵母菌在pH 9～11的比较高的碱性环境下仍能够具有较高的存活率，且增殖性能极 强，培养后容易分层析出，有利于工业化利用。
附图说明
图1为从海水中筛选到的海洋酵母WHH-2株的生长菌落图；
图2为从海水中筛选到的海洋酵母WHH-2株的菌体的显微镜图(500倍放大)；
图3为海洋酵母WHH-2株在不同pH条件下的生长曲线；
图4为市售面包酵母株在不同pH条件下的生长曲线；
图5为市售面包酵母株(左)和海洋酵母WHH-2株(右)在培养结束后静止状态下的物性 比较图；
图6为海洋酵母WHH-2株在系统树上的位置图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例
一株具有高增殖性能的海洋酵母菌，命名为：海洋酵母WHH-2株，该菌株已于2017年7月 17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.14432。
海洋酵母WHH-2菌株的筛选：
为了筛选出培养性能优异，培养后菌体得率较高的菌株，从前期筛选出的535株海洋酵母菌 株中进一步择优筛选出了1株最佳菌株、即海洋酵母WHH-2株。
本发明的菌株Saccharomyces cerevisiae WHH-2株系从我国舟山岛东海岸距陆地约10 公里处的海面下5米深处的海水中筛选得到的。采样之前将装有冰的箱子已经用70％乙醇完 全消毒，所采取的海水装入无菌袋后放入冰箱中送达实验室。将海水用0.2μm的无菌过滤膜 过滤，将截留在过滤膜上的微生物菌体称好重量后放入无菌海水进行稀释至菌体数为10-6。 然后取0.1mL涂布于YPD琼脂培养基上(含有2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母抽取物、2％ 琼脂、0.03％KH2PO4、0.05％MgSO4、pH6.0，并添加0.2％的100ng/μL录霉素以抑制细菌 的生长)，于25℃培养3～5天。之后，挑取少量培养皿上长出的乳白色酵母单菌落分散于15 mL无菌水后，再次在YPD琼脂培养基上进行划线纯化培养。如此进行5～6次后，将纯化好 的酵母单菌落(即为本发明的海洋酵母WHH-2株)保存在含有25％甘油的YPD液体培养基 中，储存于-80℃，以供后续其它试验使用。图1为从海水中筛选到的海洋酵母WHH-2株的 生长菌落图；图2为从海水中筛选到的海洋酵母WHH-2株的菌体的显微镜图(500倍放大)； 与市售面包酵母在不同pH区间的生长曲线的比较：
[试验例]海洋酵母WHH-2株与市售面包酵母(安琪酵母股份有限公司制造)在不同pH区间 的生长曲线的比较：取保存于甘油管中的海洋酵母WHH-2株的菌液0.1mL涂布于YPD琼脂 培养基上，于25℃培养3天进行复活。挑取少量培养皿上长出的乳白色酵母单菌落分散于约 150mL的无菌水中，调整酵母细胞数至10-6浓度。之后，各取1mL分别注入装有15mLpH 3～ 11梯度缓冲液的、含有YPD培养基成分的的20mL容的L型试管中，并分别置于TN-2612 型自动振荡培养装置中，在25℃、30rpm振荡培养3天。培养中每间隔一小时自动测定各培 养液在OD660处的吸亮度，之后以此资料制作各培养液在不同pH条件下的生长曲线(如图3)。 作为对照，市售面包酵母株也按照同样的方法，测定了其培养液在pH 3～11梯度缓冲液中的 生长曲线(如图4)。
从图4可知，市售面包酵母在pH 3～8区间能较好生长增殖，在pH 8以上的碱性区间 则完全不能生长，因此pH 8是该菌株的生长极限pH值。从图3可知，海洋酵母WHH-2株 除了在pH 3～8区间能很好生长增殖外，在pH 9～11的碱性区间也能很好生长，pH 11是该 菌株的生长极限pH值。以上结果说明海洋酵母WHH-2株的生长性能要比市售面包酵母更好。
市售面包酵母株和海洋酵母WHH-2株高密度培养得率的比较
①小规模摇瓶培养
培养基组成：2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.1％麦精、0.03％磷酸二氢钾、0.05％硫酸镁、0.5％ 硫酸铵。
培养条件：在两个1000mL容的三角烧瓶中分别添加以上培养液各500mL，经95℃、15min灭菌后，分别添加面包酵母(安琪酵母股份有限公司制造)、海洋酵母WHH-2株的一 次培养液各50mL，将三角烧瓶置于25℃的恒温摇床中，150rpm振荡培养48h。培养中，每 隔12h分别取出培养液各100mL，经离心分离(6000g×15min)后测定其湿菌泥重量。表 1显示了两种不同菌株在各个不同培养时间内的湿菌泥得率的差异。(由于每次测定湿菌泥中 的固形物含量一般都在76.0～76.5％范围内，考虑到每次离心分离(6000g×15min)的实验 条件都相同，湿菌泥中的残留水分含量不会有很大变化，故为方便起见，以下所有实验中的 菌体得率均以湿菌泥得率表示，不再测定其水分含量，并直接以湿菌泥得率的高低来比较菌株生长增殖速度的快慢。)
表1.海洋酵母WHH-2株与市售面包酵母株的湿菌泥得率差异的比较
Figure BDA0001451099110000041
从以上结果可知，在培养的不同时间间隔内，海洋酵母WHH-2株的湿菌泥得率都要高于市 售面包酵母。比如在培养24h后，海洋酵母WHH-2株的湿菌泥得率要高于市售面包酵母约 40.6％。在培养48h后，海洋酵母WHH-2株的湿菌泥得率则要高于市售面包酵母约66.9％。 可见海洋酵母WHH-2株具有极佳的高增殖性能，具有巨大的工业化利用价值。
②10L培养缶的放大培养
培养条件：按2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.1％麦精、0.03％磷酸二氢钾、0.05％硫酸镁、0.5％ 硫酸铵的培养基组成进行10体积的放大培养。培养温度自动控制在25℃；培养初始pH 5.0 (培养中pH无调节)；搅拌速度250rpm/min，通气量4L/min。按以上培养条件分别进行海洋 酵母WHH-2株和面包酵母株的10L放大培养。培养48h后结束培养，经离心分离(6000g× 15min)后测定湿菌泥重量。表2显示了两种不同菌株湿菌泥得率的差异。
表2.海洋酵母WHH-2株与市售面包酵母株的湿菌泥得率差异的比较
市售面包酵母 海洋酵母WH-2株 湿菌泥增加率
第一回培养 227.1g 382.8g 68.6％
第二回培养 225.6g 385.1g 70.7％
从表2结果可知，海洋酵母WHH-2株的湿菌泥得率要大大高于市售面包酵母株，其湿菌泥収 量的增加率可高达68％～70％。因此，可以确认海洋酵母WHH-2株更适合于工业化大规模生 产。后继的酵母发酵与自溶反应的最佳条件探讨将使用该酵母株为主要原料进行。
③两种不同酵母菌在培养结束后静止状态下的物性比较
图5是海洋酵母WHH-2株(右图)与市售面包酵母株(左图)在培养结束后，静止30min 后的培养液物性状态的比较。从图5可知，在培养结束后的静止状态，市售面包酵母株的培 养罐中无明显分层，而海洋酵母WHH-2株的培养罐中有明显分层，説明海洋酵母WHH-2株 要比市售面包酵母株更容易分层析出酵母因此在今后的实际生产中，海洋酵母WHH-2株的 菌体更容易分离回收，工业化生产成本可以更便宜。
海洋酵母WHH-2株的种属鉴定
18S rRNA序列分析：
CCCCCTTTCCTAAACCAATCCGGAAGCCTCACTAAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACG GGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTA GGAATTCCTCGTTGAAGAGCAACAATTACAATGCTCTATCCCCAGCACGACGGAGTTTC ACAAGATTTCCCAGACCTCTCGGCCAAGGTTTATACTCGCTGGCTCCGTCAGTGTAGCGC GCGTGCGGCCCAGAACGTCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATC GACTTGAAATCGATAGTCCCTCTAAGAAGTGACTATACCAGCAAATGCTAGCAGCACTAT TTAGTAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTA AGAACGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCT TATTGTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCAC TCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCC AGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGATTGCGTCAATAAAAGAACAACAA CCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCATCTTCGATC CCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACGTCCTTGGTAAATGCTTTCGCAGTAGTTAGT CTTCAGTAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAACTGAATACTGATACCCCCGACCGTCCC TATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCATAACGTCCTATTCTATT ATTCCATGCTAATATATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCAAAGTAA AAGTCCTGGTTCGCCAAAAGGCTAGCCAGAAGGAAAGGCTCGGTTGGGTCCAGTACGC ATCAGAAAGATGGACCGGCCAACCAAGCCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA ACAACTTTAATATACGCTTTTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCC CTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGTATTTACATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCGAAAG GGCCCTGTATCGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGC CTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCT TATTCCCCGTTACCCGTTGAAACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAG GGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCAGCACAAGGCCATGCGATTCGAAAAGTTATTAT GAATCATCAAAGAGTCCGAAGACATTGATTTTTTATCTAATAAATACATCCCTTCCAAACA GTCGGGATTTTAAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAGGTAC TATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTATAAATTGCTTAT ACTTAG
ITS-5.8S rRNA序列分析：
AAGGGATTGGCTTATTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGG AGCAATCCTACCGCCAGTAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTATTTACAGTCAAACTTC GATTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTAGGTTCTCGCATCGATG AAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATC TTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTC TCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAC GTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAAAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCAC CACAATTTATTTCATAACTTGACCTCCAATGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATC CAAAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTGACCTCCAA 海洋酵母WHH-2株的种属鉴定结果：
根据海洋酵母WHH-2株的18S rRNA序列和ITS-5.8S rRNA序列分析结果可知，海洋酵母 WHH-2株属于Saccharomyces属的cerevisiae种(相似度100％)，学名为Saccharomyces cerevisiac，该酵母与通常市场上流通的Saccharomyces cerevisiae株一样，属于食品上可使用 的酵母株。该海洋酵母在系統树上的位置如图6所示。
海洋酵母WHH-2株的生理生化特征：
海洋酵母WHH-2株是一种单细胞生物，属真菌类，在植物学分类上为子囊菌纲的酵母属， 啤酒酵母种。该酵母菌以单端(顶端)出芽方式实行无性繁殖，在显微镜下(500倍放大)观察， 其菌体常为椭圆形、卵圆形，一般为3～10μm×5～15μm，细胞丰满，在葡萄糖琼脂培养基 上，25℃培养3d后，可形成乳白色的浑圆形菌落，表面光滑湿润，边缘整齐，中心部位略凸 出，质地呈明胶状，较易被接种针挑起。
该酵母为兼性厌氧性微生物，在有氧及无氧条件下都可以进行发酵。能在18～35℃的 温度范围内生长，生长的最适温度为25～30℃。能在pH 3～11的广泛酸性和碱性范围内生 长，生长的最适pH为3.0～6.0。该酵母的特点是在高pH条件下还能保持较好的增殖性能， 而普通面包酵母在pH 8以上就不能增殖生长了。同时，该酵母增殖结束后的菌体有较好的凝 集力和较快的沉降速度。
市售面包酵母株及海洋酵母WHH-2株对不同碳源的发酵性差异如表3，对不同碳源的 资化性差异如表4，对不同氮源的资化性差异如表5所示。
表3.两种不同酵母菌株对14种碳源的发酵性的差异
Figure BDA0001451099110000061
Figure BDA0001451099110000071
备考：“+”表示对该碳源具有发酵性；“-”表示对该碳源不具有发酵性。
表4.两种不同酵母菌株对15种碳源的资化性的差异
序号 糖类名称 市售面包酵母 海洋酵母WHH-2
C1 D-Glucose + +
C2 D-Galactose + +
C3 L-Sorbose - -
C4 D-Glucosamine - -
C5 D-Ribose - -
C6 D-Xylose + -
C7 L-Arabinose - -
C8 D-Arabinose - -
C9 L-Rhamnose - -
C10 Sucrose + +
C11 Maltose + +
C12 α，α-Trehalose + +
C13 Meα-D-glucoside + +
C14 Cellobiose + +
C15 Salicin - -
备考：“+”表示对该碳源具有资化性；“-”表示对该碳源不具有资化性。
表5.两种不同酵母菌株对10种氮源的资化性的差异
序号 糖类名称 市售面包酵母 海洋酵母WHH-2
N1 Nitrate + +
N2 Nitrite - -
N3 Ethylamine - -
N4 L-Lysine - -
N5 Cadaverine + +
N6 Creatine + +
N7 Creatinine + +
N8 Glucosamine + +
N9 Imidazole - -
N10 D-Tryptophane - ±
备考：“+”表示对该氮源具有资化性；“-”表示对该氮源不具有资化性；“±”表示对该氮 源具有的资化能力很弱。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技 术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的 保护范围。
序列表
<110> 杭州娃哈哈科技有限公司
杭州娃哈哈集团有限公司
<120> 一株具有高增殖性能的海洋酵母菌
<130> 2017-09-29
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1626
<212> DNA
<213> 海洋酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
ccccctttcc taaaccaatc cggaagcctc actaagccat tcaatcggta gtagcgacgg 60
gcggtgtgta caaagggcag ggacgtaatc aacgcaagct gatgacttgc gcttactagg 120
aattcctcgt tgaagagcaa caattacaat gctctatccc cagcacgacg gagtttcaca 180
agatttccca gacctctcgg ccaaggttta tactcgctgg ctccgtcagt gtagcgcgcg 240
tgcggcccag aacgtctaag ggcatcacag acctgttatt gcctcaaact tccatcgact 300
tgaaatcgat agtccctcta agaagtgact ataccagcaa atgctagcag cactatttag 360
taggttaagg tctcgttcgt tatcgcaatt aagcagacaa atcactccac caactaagaa 420
cggccatgca ccaccaccca caaaatcaag aaagagctct caatctgtca atccttattg 480
tgtctggacc tggtgagttt ccccgtgttg agtcaaatta agccgcaggc tccactcctg 540
gtggtgccct tccgtcaatt cctttaagtt tcagccttgc gaccatactc cccccagaac 600
ccaaagactt tgatttctcg taaggtgccg attgcgtcaa taaaagaaca acaaccgatc 660
cctagtcggc atagtttatg gttaagacta cgacggtatc tgatcatctt cgatccccta 720
actttcgttc ttgattaatg aaaacgtcct tggtaaatgc tttcgcagta gttagtcttc 780
agtaaatcca agaatttcac ctctgacaac tgaatactga tacccccgac cgtccctatt 840
aatcattacg atggtcctag aaaccaacaa aatagaacca taacgtccta ttctattatt 900
ccatgctaat atattcgagc aaaggcctgc tttgaacact ctaatttttt caaagtaaaa 960
gtcctggttc gccaaaaggc tagccagaag gaaaggctcg gttgggtcca gtacgcatca 1020
gaaagatgga ccggccaacc aagcccaagg ttcaactacg agctttttaa ctgcaacaac 1080
tttaatatac gcttttggag ctggaattac cgcggctgct ggcaccagac ttgccctcca 1140
attgttcctc gttaaggtat ttacattgta ctcattccaa ttacaagacc cgaaagggcc 1200
ctgtatcgtt atttattgtc actacctccc cgtgtcggga ttgggtaatt tgcgcgcctg 1260
ctgccttcct tggatgtggt agccgtttct caggctccct ctccggaatc gaacccttat 1320
tccccgttac ccgttgaaac catggtaggc cactatccta ccatcgaaag ttgatagggc 1380
agaaatttga atgaaccatc gccagcacaa ggccatgcga ttcgaaaagt tattatgaat 1440
catcaaagag tccgaagaca ttgatttttt atctaataaa tacatccctt ccaaacagtc 1500
gggattttaa gcatgtatta gctctagaat taccacggtt atccaagtag taaggtacta 1560
tcaaataaac gataactgat ttaatgagcc attcgcagtt tcactgtata aattgcttat 1620
acttag 1626
<210> 2
<211> 538
<212> DNA
<213> 海洋酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 2
aagggattgg cttattgcac cacatgtgtt ttttattgaa caaatttctt tggtggcggg 60
agcaatccta ccgccagtag gttataacta aaccaaactt tttatttaca gtcaaacttc 120
gatttattat tacaatagtc aaaactttca acaacggatc tcttaggttc tcgcatcgat 180
gaagaacgca gcgaaatgcg atacgtaata tgaattgcag atattcgtga atcatcgaat 240
ctttgaacgc acattgcgcc ctttggtatt ccaaagggca tgcctgtttg agcgtcattt 300
ctccctcaaa cccccgggtt tggtgttgag caatacgcta ggtttgtttg aaagaattta 360
cgtggaaact tattttaagc gacttaggtt tatccaaaac gcttattttg ctagtggcca 420
ccacaattta tttcataact tgacctccaa tggaaactta ttttaagcga cttaggttta 480
tccaaaacgc ttattttgct agtggccacc acaatttatt tcataacttg acctccaa 538

Claims (2)

1.一株具有高增殖性能的海洋酵母菌，其特征在于，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WHH-2，该菌株已于2017年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.14432。
2.如权利要求1所述的具有高增殖性能的海洋酵母菌的用途，其特征在于，所述海洋酵母应用于发酵乳制品、发酵果蔬汁饮料、发酵茶饮料中。
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