JP2003235596A - 環状四糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ
−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖
の新規製造法を提供することを課題とする。 【解決手段】 サイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−
Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環状四
糖産生能を有するサッカロマイセス属に属する酵母を、
栄養培地に培養して環状四糖を産生せしめた培養物と
し、この培養物から、環状四糖を採取することを特徴と
する環状四糖の新規製造方法を提供することにより解決
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、サイクロ{→６）
−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→}
の構造を有する環状四糖の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルコースを構成糖とする糖質、例え
ば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物として
は、アミロース、アミロデキストリン、マルトデキスト
リン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知ら
れている。これらの糖質は、通常、分子の両端の何れか
一方が非還元生末端で他方が還元性末端であって、還元
性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物
は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース・イ
クイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎ
ｔ＝ＤＥ）として表される。この値の大きいものは、通
常、低分子、低粘度で、甘味及び反応性が強く、アミノ
酸や蛋白質などのアミノ基を有する物質とアミノカルボ
ニル反応を起し易く、褐変し悪臭を発生し、得られる製
品の品質を劣化し易いとの欠点を有することが知られて
いる。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の
構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力
を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれてい
た。例えば、『ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）』、第
７１巻、３５３乃至３５８頁（１９４９年）に開示され
ているように、澱粉にマセランス アミラーゼ（ｍａｃ
ｅｒａｎｓ ａｍｙｌａｓｅ）を作用させることによ
り、６乃至８分子のグルコースがα−１，４グルコシル
結合したα−、β−またはγ−環状デキストリンを生成
させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれら
環状デキストリンが工業的規模で生産され、それらが有
する非還元性、無味性、包接能などの特性を生かした各
種用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特
開平７−１４３８７６号公報、及び特開平７−２１３２
８３号公報などで開示したように、マルトオリゴ糖など
の澱粉部分分解物に、非還元性糖質生成酵素及びトレハ
ロース遊離酵素を作用させることにより、２分子のグル
コースがα，α−結合したトレハロースを生成させる方
法も知られている。現在では、このトレハロースは澱粉
から工業的規模で生産され、その非還元性で、温和で高
品質な甘味特性などを生かした用途に利用されている。
このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質と
して、グルコース重合度が２のα，α−トレハロース、
グルコース重合度が６乃至８のα−、β−、γ−環状デ
キストリンは工業的規模で生産され、それらの特性を生
かした各種用途に利用されているものの、斯かる非還元
性糖質の種類には限りがあり、更に多種多様な非還元性
糖質乃至低還元性糖質の確立が待たれている。

【０００３】一方、近年、グルコースを構成糖とする新
たな環状の四糖類が報告された。即ち、『ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐ
ｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）』、第２２６巻、６４１乃至６４８（１９９４
年）には、主として、グルコース残基がα−１，３結合
とα−１，６結合とが交互に連なっているアルテルナン
（ａｌｔｅｒｎａｎ）に、加水分解酵素アルテルナナー
ゼ（ａｌｔｅｒｎａｎａｓｅ）を作用させることによ
り、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グル
コピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖（以
下、本明細書では本糖質を「環状四糖」と略称すること
もある。）が生成することが示されている。斯かる環状
構造を有する環状四糖は、非還元性の糖質で、包接能を
示し、揮発性有機物を安定化する作用を有するととも
に、アミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸
念することなく各種用途に利用、加工できることが期待
される。

【０００４】しかしながら、環状四糖の製造に必要な原
料のアルテルナンや酵素のアルテルナナーゼの入手が困
難であるばかりでなく、斯かる酵素を産生する微生物も
容易に入手できる状態にはない。

【０００５】斯かる状況下、本発明者等は、先に、国際
特許公開番号ＷＯ０１／９０３３８Ａ１明細書で開示し
たように、土壌からの分離菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔ
ｅｒ）属に属するα−イソマルトシル転移酵素産生微生
物Ｃ９株、Ｃ１１株、Ｎ７５株およびＡ１９株が、α−
イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルト
シル転移酵素をも産生することを見出し、豊富で安価に
供給される澱粉を原料とする澱粉部分分解物に、α−イ
ソマルトシルグルコ糖質生成酵素とα−イソマルトシル
転移酵素とを作用させることにより、高収率で環状四糖
を生成できることを見出し、α−イソマルトシルグルコ
糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素の諸性質
を明らかにすると共に、その製造方法を確立し、更に
は、両酵素を併用した環状四糖又はこれを含む糖質及び
その製造方法、併せて、これら方法により得られる環状
四糖、又はこれを含む糖質を含有せしめた飲食物、化粧
品、医薬品などの組成物を確立した。しかしながら、環
状四糖の製造方法として、更なる新規な方法の提供が望
まれる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、環状四糖の
新規製造方法を提供することを課題とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために、環状四糖を産生する微生物を広く検
索してきた。その結果、意外にも、先に見いだしたバチ
ルス属、アルスロバクター属などの細菌とは全く異なる
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に
属する酵母が、菌体中に環状四糖を著量生成することを
発見した。

【０００８】本発明者等は、酵母を培養し、この培養物
から環状四糖を採取することによる環状四糖の新規製造
方法を確立し、本発明を完成した。

【０００９】本発明の酵母は、サイクロ{→６）−α−D
−グルコピラノシル−（１→３）−α−D−グルコピラ
ノシル−（１→６）−α−D−グルコピラノシル−（１
→３）−α−D−グルコピラノシル−（１→}の構造を有
する環状四糖産生能を有するサッカロマイセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母であればよく、
その由来は問わない。例えば、サッカロマイセス・セレ
ビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）が有利に用いられ、例えば、ＩＦＯ０３０
４、ＡＴＣＣ９７６３などや、更には、パン酵母、ビー
ル酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母などからの酵
母であってもよい。

【００１０】本発明の酵母の培養に用いる培地は、酵母
が生育でき、環状四糖を産生しうる栄養培地であればよ
く、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源
としては、酵母が生育に利用できる物であればよく、例
えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、ラクトー
ス、スクロース、マンニトール、Ｌ−ソルビトール、糖
蜜など糖質、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動
物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これ
らの部分分解物や、また、クエン酸、コハク酸などの有
機酸、エタノールなどのアルコール類も使用することが
できる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の
種類により適宜選択される。窒素源としては、例えば、
アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、
例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイ
ン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含
有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、
カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウ
ム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モ
リブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。更に、
必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いられ
る。

【００１１】培養は、通常、温度４乃至４０℃、好まし
くは１０乃至３７℃、ｐＨ４乃至１０、好ましくは２乃
至９から選ばれる条件で行われる。培養時間は酵母が増
殖し環状四糖を産生しうる時間であればよく、好ましく
は１０時間乃至５００時間である。また、培養液の溶存
酸素濃度には特に制限はなく、通常は、０．５乃至２０
ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、
攪拌したり、通気に酸素を追加したり、また、ファーメ
ンター内の圧力を高めるなどの手段が採用される。ま
た、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでも
よい。

【００１２】このようにして酵母を培養した後、この培
養物から環状四糖を回収する。環状四糖は、主に酵母菌
体中に認められ、菌体そのものを環状四糖含有物として
採取することも、培養物全体を環状四糖含有物として用
いることもできる。菌体を回収するには公知の固液分離
法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離す
る方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて
濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により
分離する方法などが適宜採用される。また、公知の方法
によって、環状四糖を菌体から抽出、さらに、精製し
て、利用することもできる。抽出する方法としては、水
抽出、熱水抽出、アルコールなど溶媒抽出、細胞壁分解
酵素など酵素処理、超音波やフレンチプレスなどの破砕
処理、ガラスビーズやアルミナなどを用いた磨砕処理な
どが採用される。精製方法としては、公知の方法を適宜
採用すればよく、例えば、活性炭での脱色、Ｈ型、ＯＨ
型イオン交換樹脂での脱塩、イオン交換カラムクロマト
グラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグ
ラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有
機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分
離、更には、環状四糖を利用せず夾雑物質を資化又は分
解する微生物、例えば、乳酸菌、酢酸菌、酵母などによ
る発酵処理、アルカリ処理などによる残存している還元
性糖質の分解除去などの方法を１種または２種以上を組
み合わせた精製方法が有利に採用できる。

【００１３】このようにして得られた環状四糖またはこ
れの含量を向上させた水溶液は、通常、環状四糖を、固
形物当り、１ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にこと
わらない限り、ｗ／ｗ％を％と略称する。）以上、望ま
しくは１０％以上含有する水溶液で、通常、これを濃縮
し、シラップ状製品とする。更に、乾燥して粉末状製品
にすることも随意である。

【００１４】更には、本発明における環状四糖の結晶を
製造するには、通常、前記の精製方法を用いた、望まし
くは環状四糖を、固形物当り約４０％以上含有する水溶
液が用いられる。結晶の形態として、５乃至６含水結晶
を製造する場合には、通常、この水溶液を環状四糖の過
飽和水溶液、例えば、濃度約４０％乃至９０％水溶液と
し、これを助晶缶にとり、約０．１乃至２０％の種結晶
共存下で、過飽和を保つ温度、望ましくは１０乃至９０
℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、結晶を含有するマスキ
ットを製造する。１含水結晶や無水結晶を晶出させる場
合には、一般的には、更に高濃度、高温度での過飽和条
件が採用される。マスキットから結晶またはこれを含有
する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブ
ロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知
の方法を採用すればよい。また、１含水結晶や無水結晶
は５乃至６含水結晶を脱水又は乾燥させて製造すること
もできる。このようにして製造される本発明の環状四糖
結晶又はこれの高含有粉末は、上品で温和な低甘味を有
する非還元性乃至低還元性の白色粉末で、耐酸性、耐熱
性に優れた安定な糖質であり、他の素材、特にアミノ
酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物
質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生す
ることも少なく、混合した他の素材を損なうことも少な
い。また、吸湿性も低く、粉末状物の付着、固結を防止
できる。

【００１５】また、環状四糖自体は、包接能を有してい
ることから、香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化
が防止されることから、香気成分、有効成分の安定化保
持に極めて優れており、保香剤、安定剤などとして好適
である。この際、必要ならば、他の環状糖質、例えば、
環状デキストリン類、分岐環状デキストリン類、環状デ
キストラン類、環状フラクタン類などを併用して、安定
化を強化することも有利に実施できる。

【００１６】更に、環状四糖自体は、アミラーゼやα−
グルコシダーゼによって分解されないことから、経口摂
取しても消化吸収されず、また、腸内細菌によって醗酵
されにくく、極めて低カロリーの水溶性食物繊維として
利用することができる。換言すれば、環状四糖を摂取す
れば、糖質としての重量、容量があるので、満腹感が得
られるものの実質的に消化されず、低カロリー食品素
材、ダイエット食品素材として好適である。また、虫歯
誘発菌などによっても、醗酵されにくく、虫歯を起こし
にくい甘味料としても利用できる。

【００１７】更に、環状四糖自体は、耐酸性、耐アルカ
リ性、耐熱性に優れた無毒、無害の天然甘味料である。

【００１８】また環状四糖自体は、安定な甘味料である
ことにより、結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキ
シエチルスターチ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤
と併用して錠剤や糖衣錠として利用することも有利に実
施できる。また、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、
保湿性、粘性、離水防止性、固結防止性、保香性、安定
性、他の糖の晶出防止性、難醗酵性、澱粉老化防止性、
蛋白質変性防止性、脂質劣化防止性などの性質を具備し
ている。

【００１９】従って、本発明の環状四糖又はこれを含む
含有物は、甘味料、難醗酵性食品素材、難消化性食品素
材、低う蝕性食品素材、低カロリー食品素材、呈味改良
剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、固結防止
剤、保香剤、澱粉老化防止剤、蛋白質変性防止剤、脂質
劣化防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材など
として、そのままで、又は必要に応じて、公知材料と適
宜併用して、各種組成物、例えば、飲食物、嗜好物、飼
料、餌料、化粧品、医薬品などに有利に利用できる。公
知の材料としては、例えば、呈味料、着色料、着香料、
強化剤、乳化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、薬効成分
などが適宜利用できる。

【００２０】本発明の環状四糖又はこれを含む含有物
は、そのまま甘味付のための調味料として使用できる。
必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、異性化
糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース（α，α）、蜂蜜、メ
ープルシュガー、エリスリトール、キシリトール、ソル
ビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオ
シド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、
グリチルリチン、ソーマチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−
フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、アセス
ルファムＫ、スクラロース、グリシン、アラニンなどの
ような他の甘味料と併用して使用することも、また、デ
キストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して
使用することもできる。とりわけ、エリスリトール、キ
シリトール、マルチトールなどの低カロリー甘味料やα
−グリコシルステビオシド、ソーマチン、Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリ
ン、アセスルファムＫ、スクラロースなどの高甘味度甘
味料などと併用して、低カロリー甘味料又はダイエット
甘味料などとして利用することも好適である。

【００２１】また、本発明の環状四糖又はこれを含む含
有物の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、または必要
に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆
粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に
成形して使用することも随意である。

【００２２】また、本発明の環状四糖又はこれを含む含
有物の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味など
の他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、
耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良
に、風味改良に、また品質改良などに有利に利用でき
る。

【００２３】例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味
噌、もろみ、ひしお、粉末みりん、粉末アルコール、ふ
りかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉
末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャ
ップ、焼き肉のたれ、カレールウ、シチューの素、スー
プの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テ
ーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料へ
甘味料、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤などとし
て使用することも有利に実施できる。また、例えば、せ
んべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、う
いろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステ
ラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッ
カー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カス
タードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジ
ケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キ
ャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、ア
イスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロッ
プ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピー
ナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、
ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、
野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬、ら
っきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素
などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、
魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷら
などの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきす
るめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、エビなどの田麩
などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝など
で製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻な
どの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶
詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、果実酒、ウィスキー、清
酒、ビール、発泡酒、リキュール、カクテル、スピリッ
ツ類、焼酎などの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸
飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリン
ミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席
コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更
には、離乳食、治療食、ドリンク剤、アミノ酸含有飲
料、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味
付に、呈味改良に、風味改良に、品質改良などに有利に
実施できる。

【００２４】また、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚
などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上又
はカロリーを低減させるなどの目的で使用することもで
きる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリー
ム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼
剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペースト
状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成
物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤とし
て、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用で
きる。

【００２５】品質改良剤、安定剤としては、有効成分、
活性など失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健
康食品、化粧品、医薬品などに有利に適用できる。例え
ば、インターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネク
ロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻
止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクタ
ー、インターロイキンＩＩなどのリンホカイン含有液、
インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロ
ポエチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、
ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、
ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒
素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシ
リン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テト
ラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシン
などの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−
アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロー
ル、トコフェロールなどのビタミン含有液、リパーゼ、
エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミ
ラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼな
どの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、ク
ロレラエキス、アロエエキス、クマザサエキス、モモの
葉エキス、ビワの葉エキス、ユズの皮エキス、プロポリ
スエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母など
の生菌ペースト、ローヤルゼリーなどの各種生理活性物
質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品
質の液状、ペースト状または固状の健康食品、化粧品、
医薬品などを容易に製造できることとなる。

【００２６】以上述べたような各種組成物に環状四糖又
はこれを含む含有物を含有させる方法としては、その製
品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例え
ば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗
布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適
宜選ばれる。その量は、環状四糖の種々の特性、とりわ
け包接作用、呈味改良、風味改良などを発揮させるため
には、環状四糖として、固形物当たり０．１％未満では
不充分で、通常０．１％以上、望ましくは１％以上含有
せしめるのが好適である。

【００２７】以下、本発明の実施例を述べる。

【００２８】

【実施例１】＜酵母からの環状四糖の調製＞グルコース
１．０ｗ／ｖ％、ポリペプトン（日本製薬製）０．５ｗ
／ｖ％、酵母抽出物（商品名『粉末酵母エキス−Ｓ』、
日本製薬株式会社製）０．３ｗ／ｖ％、麦芽抽出物（商
品名『Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、 Ｂａｃｔｏ』、デ
ィフコ社製）０．３ｗ／ｖ％、および水からなる液体培
地をｐＨ６．０に調整した後、５００ｍｌ容三角フラス
コに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃、
２０分間滅菌し、冷却して、酵母サッカロマイセス セ
レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ９７６３を接種し、２７℃、２３
０ｒｐｍで７２時間回転振盪培養したものを種培養とし
た。

【００２９】スクロース３０ｗ／ｖ％、アスパラギン１
水和物０．３ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム七水和物０．
３ｗ／ｖ％、リン酸一カリウム０．１ｗ／ｖ％、および
水からなる液体培地をｐＨ５．５に調整した後、３ｌ容
三角フラスコに１．６ｌずつ入れ、オートクレーブで１
２０℃、２０分間滅菌し、冷却して温度２７℃とした
後、種培養液２００ｍｌを接種し、温度２７℃で２５日
間静置培養した。この培養液に、予めオートクレーブ
（１２０℃、２０分間）した濃度６６．７％のスクロー
ス水溶液６００ｇを加えて、さらに温度２７℃で１４日
間静置培養を続けた。得られた培養液約１８ｌを遠心分
離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間）して、湿菌体重量
として酵母菌体約８４ｇを回収した。

【００３０】得られた酵母湿菌体（約８４ｇ）に８０ｖ
／ｖ％エタノール水溶液６７２ｍｌを加え懸濁し、温度
８５℃で還流抽出を３０分間行った後、珪藻土濾過して
濾過液を回収した。得られた濾液をエバポレーターで減
圧濃縮してエタノールを留去し、さらに水約６００ｍｌ
を加えた後、エタノール臭が無くなるまで約３００ｍｌ
に減圧濃縮した。得られた濃縮液を珪藻土濾過して不溶
物を除去した後、再度減圧濃縮して濃縮抽出液約５０ｍ
ｌを得た。

【００３１】得られた濃縮抽出液（約５０ｍｌ）に濃度
１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌを加え、温度約
１００℃で１時間加熱して、混在する還元糖をアルカリ
分解した後、塩酸で中和し、イオン交換樹脂で脱塩し、
エバポレーターで減圧濃縮して、固形分濃度約１１ｗ／
ｖ％の濃縮液約３ｍｌを得た。この濃縮液を分取用高速
液体クロマトグラフィーカラムＯＤＳ−ＡＱ Ｒ−３５
５−１５ＡＱ（内径５０ｍｍ、長さ５００ｍｍ、ワイ・
エム・シー株式会社製造）に注入し、溶離液には水を用
いてカラム温度３５℃、流速３０ｍｌ／ｍｉｎの条件で
溶出させ、溶出時間約３２分乃至３９分の溶出液約２１
０ｍｌを回収し、エバポレーターで減圧濃縮し、真空乾
燥して固形分として約２４０ｍｇの糖質粉末を得た。

【００３２】得られた糖質粉末について、高速液体クロ
マトグラフィー法（ＨＬＰＣ）で純度を分析したとこ
ろ、溶出時間約１１．１分に溶出ピークを示す糖質の本
糖質粉末中の純度は約９８．２％であり、高純度の糖質
標品であることがわかった。また、対照として国際特許
公開番号ＷＯ０１／９０３３８ Ａ１明細書の実験２３
に記載の方法で調製した環状四糖を用いて同様にＨＰＬ
Ｃを行ったところ、同一の溶出時間の約１１．１分に溶
出ピークを示すことも判明した。尚、ＨＰＬＣは、カラ
ムにＯＤＳ ＡＱ−３０３カラム（内径４．６ｍｍ、長
さ２５０ｍｍ、ワイ・エム・シー株式会社製造）を、溶
離液に水を用いてカラム温度４０℃、流速０．５ｍｌ／
ｍｉｎの条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩ−８０１２
（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。

【００３３】得られた糖質標品について、高速原子衝撃
法による質量分析（通称ＦＡＢ−ＭＳ）したところ、質
量数６４９のプロトン付加分子イオンが顕著に検出さ
れ、本糖質の質量数が６４８であり、環状四糖の質量数
と同じであることが判明した。

【００３４】また、常法に従って、硫酸を用い加水分解
し、ガスクロマトグラフィー法で構成糖を調べたとこ
ろ、Ｄ−グルコースのみが検出され、得られた糖質の構
成糖はＤ−グルコースであり、環状四糖の構成糖と同じ
であることも判明した。

【００３５】さらに、得られた糖質標品を用いて核磁気
共鳴法（以下、ＮＭＲと略称する）を行ったところ、図
１に示す^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、図２に示す^１３Ｃ
−ＮＭＲスペクトルが得られ、これらスペクトルを環状
四糖標品のものと異同を比較したところ、実質的に同一
であることが判明した。

【００３６】以上のことから、酵母菌体から抽出・精製
した糖質がサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ
−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖
であることが判明した。

【００３７】

【実施例２】＜酵母含有物からの環状四糖の調製＞市販
の酒粕（兵庫県加東郡滝野町、山田酒造食品（株）製
造）１ｋｇに８０ｖ／ｖ％エタノール水溶液約６ｌを加
え懸濁し、温度８５℃で還流抽出を３０分間行った後、
珪藻土濾過して濾過液を回収した。得られた濾液をエバ
ポレーターで減圧濃縮してエタノールを留去し、さらに
水約３ｌを加えた後、エタノール臭が無くなるまで減圧
濃縮した。得られた濃縮液を珪藻土濾過して不溶物を除
去した後、再度減圧濃縮して、固形分を約５８ｇ含む抽
出液約１０００ｍｌを得た。

【００３８】得られた抽出液をｐＨ５．０、温度５０℃
に調整し、α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグル
コシダーゼＬ』天野製薬製造）を固形分１ｇ当たり１
０，０００単位を加え、温度５０℃で２４時間保持した
後、温度約１００℃で１０分間加熱し、水冷し、珪藻土
濾過して不溶物を除去した。得られた濾過液に水酸化ナ
トリウム２３ｇを加え溶解させた後、温度約１００℃で
１時間加熱して、混在する還元糖をアルカリ分解した
後、塩酸で中和し、イオン交換樹脂で脱塩し、エバポレ
ーターで減圧濃縮して、固形分として約２ｇを含む糖液
約１３．９ｍｌを得た。

【００３９】得られた糖液を２回に分けて分取用高速液
体クロマトグラフィーカラムＯＤＳ−ＡＱ Ｒ−３５５
−１５ＡＱ（内径５０ｍｍ、長さ５００ｍｍ、ワイ・エ
ム・シー株式会社製造）に注入し、溶離液に水を用いて
カラム温度３５℃、流速３０ｍｌ／ｍｉｎの条件で溶出
させ、示差屈折計ＥＲＣ−７５３０（エルマ社製造）で
モニターして溶出時間約３４分乃至３６分の溶出液約１
８０ｍｌ（約９０ｍｌ×２回）を回収し、エバポレータ
ーで減圧濃縮して、真空乾燥して約２２７ｍｇの糖粉末
を得た。得られた糖粉末について、実施例１で用いたの
と同様のＨＰＬＣで分析したところ、糖組成として環状
四糖の純度が約９７．５％であることが判明した。

【００４０】得られた糖粉末を蓋付き遠心管（１．５ｍ
ｌ容）に移し、それに水０．２５ｍｌを加え、加熱して
完全に溶解させた後、密栓して室温で２４時間放置した
ところ、結晶が析出した。遠心分離（１００００ｒｐ
ｍ、２分間）して、結晶と蜜を分離し、結晶を回収し、
温度６０℃で常圧乾燥して約１２０ｍｇの結晶粉末を得
た。得られた結晶粉末について、実施例１に記載のＨＰ
ＬＣで分析したところ、糖組成として環状四糖の純度が
約９９％以上で極めて高純度であることが判明した。さ
らに、粉末Ｘ線回折法で分析したところ、得られた粉末
Ｘ線回折スペクトルが環状四糖５乃至６含水結晶のもの
と一致することがわかり、得られた結晶粉末が環状四糖
５乃至６含水結晶であることが判明した。

【００４１】

【発明の効果】以上、説明したように、本発明によれ
ば、酵母の培養菌体よりサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有
する環状四糖を製造することが可能となる。

【００４２】従って、本発明の確立は、これまで酵素法
のみが知られていたサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環
状四糖の製造方法に加え、サッカロマイセス属に属する
酵母を用いた培養物からの新規な製造方法を提供し、そ
の製造法の幅を広げ、必要に応じて製造方法を使い分け
ることを可能とするものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵母サッカロマイセス セレビシアエ
ＡＴＣＣ９７６３の培養菌体より得られた環状四糖の核
磁気共鳴スペクトル（^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル）を示す
図である。

【図２】本発明の酵母サッカロマイセス セレビシアエ
ＡＴＣＣ９７６３の培養菌体より得られた環状四糖の核
磁気共鳴スペクトル（^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル）を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 福田 恵温 岡山県岡山市下石井１丁目２番３号 株式 会社林原生物化学研究所内 (72)発明者 三宅 俊雄 岡山県岡山市下石井１丁目２番３号 株式 会社林原生物化学研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AF04 CA06 CC06 CC07 CD02 CD09 CD13 CE08 CE10 CE20 DA01 DA10 DA16

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラ
   ノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１
   →６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−
   Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環状四
   糖産生能を有するサッカロマイセス属に属する酵母を、
   栄養培地に培養してサイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコ
   ピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−
   （１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−
   α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環
   状四糖を産生せしめた培養物とし、この培養物から、サ
   イクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
   ３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ
   −グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラ
   ノシル−（１→}の構造を有する環状四糖を採取するこ
   とを特徴とするサイクロ{→６）−α−Ｄ−グルコピラ
   ノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１
   →６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−
   Ｄ−グルコピラノシル−（１→}の構造を有する環状四
   糖の製造方法。
2. 【請求項２】 サッカロマイセス属に属する酵母が、サ
   ッカロマイセス セレビシアエであることを特徴とする
   請求項１記載の環状四糖の製造方法。
3. 【請求項３】 培養物が、酵母または酵母含有物である
   請求項１または２記載の環状四糖の製造方法。