CN110903985A - 一株白僵菌t2-2产生的抗氧化和保湿活性胞外多糖及应用 - Google Patents

一株白僵菌t2-2产生的抗氧化和保湿活性胞外多糖及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株白僵菌T2‑2产生的抗氧化和保湿活性胞外多糖及应用，其中一株白僵菌T2‑2(Beauveria bassiana)，保藏编号为：CCTCC NO:M2019145，其产的胞外多糖具有良好的抗氧化性和保湿性，因此，白僵菌T2‑2产的胞外多糖可应用于化妆品和保健品领域中，保护细胞免受自由基侵害，防止老化，并且价格低廉，生产安全，将白僵菌T2‑2产的胞外多糖添加到化妆品当中，可以使皮肤保持湿润，让皮肤保持弹性，柔软，光滑，与皮肤亲和性好，纯天然，是良好的化妆护肤品添加成分。

Description

一株白僵菌T2-2产生的抗氧化和保湿活性胞外多糖及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株白僵菌T2-2产生的抗氧化和保湿活性胞外多糖及应用。
背景技术
多糖是由从各种原材料中提取出来的一种天然高分子化合物，一般至少由10个以上的单糖通过糖苷键连接构成的，可以通过调节淋巴细胞、吞噬细胞、白介素、抗体的水平增强机体免疫机能，多糖种类繁多，来源广泛，根据提取材料的不同，分为动物多糖、植物多糖和微生物多糖，微生物具有繁殖能力强、生产周期短、成本低、易控制的特点,微生物多糖与植物多糖相比具有的优良而且独特的物理性质，因此采用微生物发酵法生产多糖，其产量及性价比较高，许多微生物多糖已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等，广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。
目前，已投入生产的微生物多糖主要有黄原胶(Xanthangum)、结冷胶(Gellangum)、右旋糖酐(Dextran)、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan)、短梗霉多糖(Pollulan)、热凝多糖(Curdlan)、海藻糖(Trehalose)、透明质酸 (Hyaluronic)、壳聚糖(Chitasan)等。
目前我国市场上的化妆品市场呈逐年上升的趋势，对产品的需求层次也越来越高，逐渐从简单的美白、润肤的基础化妆品向具有抗衰老、修复皮肤的功效性产品转化，2018年我国化妆品零售总额达到2,600亿元。市场上的化妆护理产品的有效成分主要来自化学合成与植物提取物，提取工艺成本较大，本发明获得的来至深海白僵菌的活性大分子胞外多糖，可应用到具有化妆品领域，具有良好的市场开发前景。
发明内容
为解决上述背景技术中提到的现有化妆护理产品的有效成分主要是来自化学合成或植物提取物提取工艺成本较大的问题，本发明提供一株白僵菌 T2-2，证明该菌株产生的胞外多糖具有良好的抗氧化和保湿活性，可以应用到化妆品护肤品等领域当中，保护细胞免受自由基侵害，防止老化，其生物活性显著，并且价格低廉，生产安全，无毒副作用。
本发明提供的白僵菌T2-2是从东太平洋2900米深的沉积物中分离得到的，并证明其产生的胞外多糖具有良好的抗氧化和保湿活性；该菌株经分类学研究和分子生物学研究鉴定为虫草胞科真菌(Beauveria bassiana)，保藏编号为：CCTCC NO:M2019145，已于2019年3月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址中国武汉。
所述白僵菌T2-2的微生物学特征为：
在PDA平板上28℃培养三天后，如图1所示，菌落呈现白色，中心凸起，多为营养菌丝，菌丝细长，直径1.5-2.0μm，丝状有隔；菌落呈平绒状，在马铃薯琼脂培养培养的底部无色或淡黄色；菌落白色至乳白色初为疏茸状或棉絮状，培养后期产大量孢子形成乳粉状的孢子层，产胞细胞基部形状，从典型的瓶状到丝状，垂直生于菌丝分枝或者短小的分支上，孢子多数为球形，直径2.0-4.0μm；在PDA液体培养中，按1：50接种，28℃、180RPM摇培3 天可见白色菌丝体出现，液体表面出现大量泡沫，培养液呈淡黄色。
本发明还提供如上所述的白僵菌T2-2在保健品中的应用。
本发明还提供如上所述的白僵菌T2-2在化妆品中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种如上所述的白僵菌T2-2生产的胞外多糖。
在上述方案的基础上，进一步地，所述胞外多糖包括以下单糖：古洛糖醛酸、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。
本发明还提供如上所述的胞外多糖在化妆品中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种如上所述的胞外多糖的制备方法，包括以下制备步骤：
步骤一、将白僵菌T2-2的种子液加入至灭菌后的培养基中进行发酵；
步骤二、将发酵80h后得到的发酵液经抽滤、离心、旋转蒸发浓缩至原体积的1/10；
步骤三、向发酵液中加入5μg/ml的蛋白酶K，在55℃-65℃下孵育2小时，加Sevag除去发酵液和结合在多糖表面的蛋白质，其中，Sevag为氯仿与正丁醇按体积比4:1混合制得；
步骤四、向发酵液中加入4倍体积的无水乙醇，在4℃的冰箱中静置12h 后离心除去上清液，冷冻干燥后得到胞外多糖粗品。
在上述方案的基础上，进一步地，所述培养基的配方为蔗糖20‰、蛋白胨30‰、硫酸铵1.5‰、K2HPO4 1.5‰、MgS04 0.5‰，其余为水。
在上述方案的基础上，进一步地，所述白僵菌T2-2的发酵条件为：pH为6、温度为30℃、转速200rpm、接种量为8％。
本发明具有的有益效果是：
本发明提供的白僵菌T2-2产的胞外多糖具有良好的抗氧化性可用于制备成各种化妆品和保健品，保护细胞免受自由基侵害，防止老化，并且价格低廉，生产安全；
同时本发明提供的白僵菌T2-2产的胞外多糖还具有良好的保湿效果，可以封闭水分，具有良好的成膜性，可在皮肤表面形成一层均匀的薄膜，减少皮肤表面的水分蒸发并从潮湿空气中吸收水；将白僵菌T2-2产的胞外多糖添加到化妆品当中，可以使皮肤保持湿润，让皮肤保持弹性，柔软，光滑，与皮肤亲和性好，纯天然，是良好的化妆护肤品添加成分。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的白僵菌T2-2菌落形态图；
图2为本发明提供的白僵菌T2-2透射电子显微镜检形态图；
图3为本发明提供的单糖分析-标准品色谱图；
图4为本发明提供的白僵菌T2-2的单糖分析色谱图；
图5为本发明提供的白僵菌T2-2的白僵菌T2-2的分子量分布图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：白僵菌T2-2的分离和鉴定：
A、白僵菌T2-2分离纯化：
将浓度为50ml/L的链霉素和浓度为50ml/L的青霉素加入到YPD固体平板中，再将5g大洋21航次采集到的东太平洋(W101.5°，N1.2°)2900 米深的沉积物样品涂到平板上，48h后使用牙签挑取单菌落在28℃条件下培养，分离得到该白僵菌T2-2；
该菌的微生物学特征为：
在PDA平板上28℃培养三天后，如图1所示，菌落呈现白色，中心凸起，多为营养菌丝，菌丝细长，直径1.5-2.0μm，丝状有隔；菌落呈平绒状，在马铃薯琼脂培养培养的底部无色或淡黄色；菌落白色至乳白色初为疏茸状或棉絮状，培养后期产大量孢子形成乳粉状的孢子层，产胞细胞基部形状，从典型的瓶状到丝状，垂直生于菌丝分枝或者短小的分支上，孢子多数为球形，直径2.0-4.0μm；在PDA液体培养中，按1：50接种，28℃、180RPM 摇培3天可见白色菌丝体出现，液体表面出现大量泡沫，培养液呈淡黄色；
如图2所示，扫描电镜下白僵菌T2-2的菌丝体细长直径约为1.5-2.0 μm，孢子多数成球形直径2.0-4.0μm，菌丝体顶端膨大为产孢结构，上面成簇长出分生孢子产孢细胞基部形状,从典型的瓶状到丝状,垂直着生于菌丝分支或短的小分支上；分生孢子着生在产孢细胞延伸而成的之字形结构上。
B、白僵菌T2-2的基因组DNA提取：
(1)将保种或已纯化的真菌接种到PDA平板上，28℃生长2-3天后，用无菌的牙签挑取少量菌丝体至EP管，放入液氮中冻30-60min；
(2)取出冷冻的菌体，每管加入400μl 65℃预热的CTAB buffer抽提液，65℃振荡水浴摇床中保温45-60min；
(3)加入400μl的混合溶液，其中混合溶液为酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1混合制得，充分混匀，13000r/min离心20-30min，将上层水相移入新管；
(4)重复第(3)步；
(5)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，于4℃中静置30min或者过夜；
(6)将步骤(5)中的静置液在13000r/min的转速下离心15min，除去上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，吹干；
(7)以20ul DDW溶解沉淀，-20℃保存；
取5μL DNA与1μL溴酚蓝；在0.8％的琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度。
C、菌株鉴定：
通过引物ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’和ITS5 5’-GGA AGT AAAAGT CGT AAC AAG G-3’对A65基因组DNA进行扩增，PCR为95℃预变性3min 95℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸45s：32个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
白僵菌T2-2的ITS序列结果详见序列表，对白僵菌T2-2序列进行BLAST 分析，结果显示该序列和Beauveria bassiana voucher(GENE Bank ID： JQ320361.1)相似度最高，达到99％；故可鉴定该株菌属于白僵菌属 (Beauveria bassiana)。
实施例2:白僵菌T2-2的发酵培养基和发酵条件的优化配制：
本发明选取了多种能用于白僵菌T2-2发酵培养基的碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糖蜜)、氮源(蛋白胨、牛肉膏、玉米面)、无机盐和其他生长因子，在30℃，180RPM条件下进行白僵菌T2-2发酵培养比较，通过单因子实验和正交试验，综合考虑菌含量，培养成本和产糖含量等指标，参照表1设计实验，每组实验设置三个平行组，如表2所示，筛选出其中最适合白僵菌T2-2发酵的培养基：
表1白僵菌T2-2发酵培养基正交实验因素水平
水平 蔗糖(g/L) 蛋白胨(g/L) 硫酸铵(g/L) MgSO<sub>4</sub>(g/L) K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(g/L)
1 10 10 0.5 0.5 0.5
2 20 20 1 1 1
3 30 30 1.5 1.5 1.5
表2白僵菌T2-2发酵培养基正交实验部分结果
Figure BDA0002320881960000071
Figure BDA0002320881960000081
Figure BDA0002320881960000091
从表2的测试结果可以得出，75号的测试结果最佳，白僵菌T2-2的最佳发酵液体培养基为：蔗糖20‰、蛋白胨30‰、硫酸铵1.5‰、MgS04 0.5‰、 K2HPO4 1.5‰，其余为水。
本发明选取了使用PDA培养基对白僵菌T2-2的进行发酵条件优化，在不同pH，温度，转速，接种量的条件下通过单因子实验和正交试验，综合考虑菌含量，培养成本和产糖含量等指标，参照表3设计实验，每组实验设置三个平行组，如表4所示，筛选出其中最适合白僵菌T2-2发酵条件：
表3白僵菌T2-2发酵条件交实验因素水平
水平 pH 温度(℃) 摇床转速(rpm) 接种量(％)
1 6 28 180 4
2 7 30 200 6
3 8 32 220 8
表4白僵菌T2-2发酵条件交实验结果
Figure BDA0002320881960000092
Figure BDA0002320881960000101
Figure BDA0002320881960000111
从表4的测试结果可以得出，15号的测试结果最佳，白僵菌T2-2的最佳发酵条件为：pH为6，温度为30℃，转速200rpm，接种量8％。
实施例3:白僵菌T2-2胞外多糖的提取和结构鉴定
A、白僵菌T2-2胞外多糖的提取
在pH为6，温度为30℃，200rpm，接种量8％的条件下，将白僵菌T2-2 的种子液加入至灭菌后的优化培养基中(蔗糖20‰、蛋白胨30‰、硫酸铵 1.5‰、K2HPO4 1.5‰、MgS040.5‰，其余为水)进行发酵。
将发酵80h后得到的发酵液抽滤过后，然后使用离心机在8000转每分钟的离心力下离心30分钟，再使用旋转蒸发浓缩至原体积的1/10；向发酵液中加入5μg/ml的蛋白酶K(其中，蛋白酶K选自翊圣生物科技公司生产的型号为10401ES60的产品)，在55℃-65℃下孵育2小时，加Sevag除去发酵液和结合在多糖表面的蛋白质(其中，Sevag为氯仿与正丁醇按体积比4:1的混合液)；
将经过除蛋白发酵液中加入4倍体积的无水乙醇，放入4℃的冰箱中静置过夜，次日将发酵液离心除去上清液，冷冻干燥后得到胞外多糖粗品；称重表明，每升发酵液约能提取到0.9g的白僵菌T2-2胞外多糖。
B、白僵菌T2-2胞外多糖的单糖组成
采用HPLC液相色谱法对白僵菌T2-2胞外多糖的单糖分进行解析，如图 3和图4所示，图中峰值上的数值代表的物质参照表5：
表5
Figure BDA0002320881960000121
结果表明白僵菌T2-2的胞外多糖组成为：古洛糖醛酸5.60％，甘露糖11.54％，核糖0.76％，半乳糖醛酸0.53％，氨基半乳糖0.70％，葡萄糖67.95％，半乳糖11.52％，木糖0.88％，阿拉伯糖0.51％。
C、白僵菌T2-2胞外多糖的分子量
使用GPC凝胶渗透色谱法对白僵菌T2-2的胞外多糖的分子量进行检测，如图5所示，测试结果表明，白僵菌T2-2胞外多糖在210-1200g/mol的分布为58.9％，1200-3000g/mol的分布为37.8％,3000-39300g/mol的分布为 3.4％；因此，白僵菌T2-2T2-2胞外多糖共有三个组分，重均分子量Mw为 2.736×103g/mol，平均分子量Mz为4.219×103g/mol。
实施例4：白僵菌T2-2胞外多糖的抗氧化活性测试及其应用
A、白僵菌T2-2胞外多糖的DPPH自由基清除率
DPPH溶液的配制：称取DPPH 4mg，配制浓度为0.004％的DPPH无水乙醇溶液；
样品溶液配制：准确称取适量的实施例3中制备的白僵菌T2-2胞外多糖，溶解于70％的乙醇溶液中，配制10mg/ml的样品溶液，现用现配；
DPPH自由基清除能力:将上述样品溶液梯度稀释，分别得2、4、6、8、 10mg/ml的样品液，将不同浓度的多糖样品液200μl(蒸馏水做空白对照，每组样品设三个平行)避光条件下加入800μl DPPH(0.004％)溶液，摇匀，避光反应30min，在517nm处测定样品和空白溶液的吸光度值计算百分清除率:
百分清除率(％)＝[(A0-A1)/A0]×100％；
其中A1表示样品的吸光度值；
A0表示空白组的吸光度值；清除率越大，抗氧化能力越强，测试结果如表6所示：。
表6
T2-2浓度 A1 A0 A0-A1 清除率
10mg/ml 0.0323 0.2098 0.1775 0.8459
8mg/ml 0.0343 0.2098 0.1838 0.8365
6mg/ml 0.0353 0.2098 0.1745 0.8317
4mg/ml 0.0417 0.2098 0.1681 0.8011
2mg/ml 0.0451 0.2098 0.1647 0.7849
B、白僵菌T2-2胞外多糖胞外多糖的超氧阴离子清除率
Tris-盐酸缓冲液的配制：称取Tris-盐酸3.95g，溶于490ml中，转移到500ml容量瓶中，然后通过加NaOH或HCL溶液，利用pH计调节溶液的 pH值为8.2,定容，既得0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液；
邻苯三酚的配制：称取邻苯三酚189.0g，置50ml容量瓶中定容，得 30mmol/L的邻苯三酚溶液，现用现配；
样品溶液配制：准确称取适量的实施例3中制备的白僵菌T2-2胞外多糖，溶于水，使浓度为10mg/ml，现用现配。
超氧阴离子自由基清除能力测定：先在洁净试管中分别加入3.0mLpH 8.2的0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲溶液，再分别加入不同浓度 (0.0,2.0,4.0,6.0,8.0和10.0mg/mL)的多糖样品溶液0.2mL，于25℃电热恒温水浴锅中保温10min；之后再加入200uL同样预热的30mmol/L 的邻苯三酚溶液，混合均匀后精确反应4min；以等体积pH8.2的0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲溶液作为空白，以VC作为阳性对照，在320nm处测定样品和空白溶液以及对照组的吸光度值，并以下式计算清除率:
清除率＝(对照–样品)/(对照–空白)×100％
测试结果如表7所示：
表7
T2-2浓度 对照-样品 对照-空白 清除率
10mg/ml 0.271 0.526 0.515
8mg/ml 0.266 0.526 0.506
6mg/ml 0.265 0.526 0.504
4mg/ml 0.259 0.526 0.492
2mg/ml 0.249 0.526 0.473
从表6和表7的测试结果可以得出，白僵菌T2-2所产生的胞外多糖具有良好的抗氧化活性；科学研究表明,癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基、超氧阴离子的产生有关联，研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害, 白僵菌T2-2所产生的胞外多糖本身具有的良好抗氧化活性，可用于制备成各种化妆品和保健品，保护细胞免受自由基侵害，防止老化，其生物活性显著，并且价格低廉，生产安全，无毒副作用。
实施例5：白僵菌T2-2胞外多糖的保湿效果及其应用
准确称取5g实施例3中制备的白僵菌T2-2胞外多糖，加入2g水，放在培养皿中，将培养皿放在烘干干燥器内，温度为40℃；同时将2g水放在培养皿中放在干燥器内作为对照，分别于1h，2h，3h，4h称重，保湿率＝(Wn/W)*100％(Wn---每次称的水重量，W---放置前水重量)，测试结果如表8所示：
表8
时间 对照组(％) 样品组(％)
1h 46.0 87.6
2h 16.3 75.5
3h 0 63.1
4h 0 49.8
由此可见，白僵菌T2-2胞外多糖具有良好的保湿效果，可以封闭水分，具有良好的成膜性，减少水分蒸发；
将白僵菌T2-2胞外多糖添加到化妆品当中，可在皮肤表面形成一层均匀的薄膜，使皮肤保持湿润，让皮肤保持弹性，柔软，光滑，与皮肤亲和性好，纯天然，无毒副作用，是良好的化妆护肤品添加成分。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Figure IDA0002320886040000011

Claims (8)

1.一种白僵菌T2-2(Beauveria bassiana)，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO:M2019145。
2.根据权利要求1所述的白僵菌T2-2在化妆品中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的白僵菌T2-2生产的胞外多糖。
4.根据权利要求3所述的胞外多糖，其特征在于：包括以下单糖：古洛糖醛酸、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。
5.根据权利要求3或4所述的胞外多糖在化妆品中的应用。
6.一种根据权利要求3所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
步骤一、将白僵菌T2-2的种子液加入至灭菌后的培养基中进行发酵；
步骤二、将发酵80h后得到的发酵液经抽滤、离心、旋转蒸发浓缩至原体积的1/10；
步骤三、向发酵液中加入5μg/ml的蛋白酶K，在55℃-65℃下孵育2小时，加Sevag除去发酵液和结合在多糖表面的蛋白质；
步骤四、向发酵液中加入4倍体积的无水乙醇，在4℃的冰箱中静置12h后离心除去上清液，冷冻干燥后得到胞外多糖粗品。
7.根据权利要求6所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述培养基的配方为蔗糖20‰、蛋白胨30‰、硫酸铵1.5‰、K2HPO4 1.5‰、MgS04 0.5‰，其余为水。
8.根据权利要求6所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述白僵菌T2-2的发酵条件为：pH为6、温度为30℃、200rpm、接种量8％。
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