CN112574923A - 一株高产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，针对现有技术乳酸菌的胞外多糖的产量有待提升的问题，公开了一株高产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用，所述乳酸菌命名为WHH3379，已于2020年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20089；菌株分类为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus。其公开了高产胞外多糖乳酸菌菌株及其多糖生产分离方法，和由其制备的发酵剂及发酵剂的应用，胞外多糖产量≥526.58±2.91 mg/L，通过实验验证了嗜热链球菌WHH3379所产胞外多糖良好的抗氧化和保湿功能。

Description

一株高产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，尤其是涉及一株高产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用。
背景技术
乳酸菌是指能利用可发酵碳水化合物产生乳酸、无芽孢的革兰氏阳性菌的总称。乳酸菌在乳品发酵中的主要作用是产酸和产生风味物质。嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)是乳酸菌的链球菌属中唯一可应用在发酵食品上的菌株，通常与保加利亚乳杆菌配伍做酸乳的基础发酵剂。
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是指乳酸菌在生长过程中产生并分泌到细胞外、常渗入到外界培养基中的一类碳水化合物，具有来源广泛、反应所需条件温和、易于分离纯化等优点。EPS具有的多种理化性质使其可以作为理想的稳定剂、增粘剂应用于发酵奶制品的生产中，起到改善乳制品口感和质构、防止乳清析出的作用，使产品更稳定、质地更细腻。除此之外，LAB EPS还具有良好的生理活性，比如抗氧化、降血脂、降胆固醇、抗病毒以及增强机体免疫活性等，对人体健康有很好的促进作用，是目前食品、药物等领域的研究热点之一。因此，充分挖掘自然界中丰富的乳酸菌资源，发现高产胞外多糖的乳酸菌细菌菌株，以短周期、低成本获得更多的胞外多糖，一直是微生物学领域的研究热点。
发酵乳是指用脱脂乳或全脂乳经特殊微生物发酵而成的制品，在销售前必须保持微生物的活性，不得含有任何致病菌。随着社会的进步以及人们对大健康的追求，酸乳正朝着保健功能强、风味更饱满、柔和的方向发展。具有功能性的乳酸菌应用广泛，但我国具有自主知识产权的菌株较少，因此，我国急需开发风味优良、功能性强的乳酸菌。
专利号CN201110402950.3，专利名称“一种高产胞外多糖的乳酸菌及其用途及所产生的胞外多糖”，本发明涉及一种高产胞外多糖的乳酸菌及其用途及所产生的胞外多糖，WG3-9菌株的分类名称：乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcus.Lactis subsp cremaris，保藏编号为：CGMCC-No.5260。本发明筛选出的高产胞外多糖乳酸菌WG3-9能够高产胞外多糖，其含量达434.3mg/L，显著高于其它乳酸菌。实验测得本菌株WG3-9发酵所得的酸乳酸度为78°T，酸乳粘度为8600mPa·s，凝乳时间为5.5h，酸乳持水力为29.5％，脱水收缩敏感性为20％。
其不足之处在于，其胞外多糖的产量有待提升。
发明内容
本发明是为了克服现有技术乳酸菌的胞外多糖的产量有待提升的问题，提供一株高产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用，其公开了高产胞外多糖乳酸菌菌株及其多糖生产分离方法，和由其制备的发酵剂及发酵剂的应用，本发明中胞外多糖产量≥526.58±2.91mg/L，通过抗氧化实验以及保湿实验，验证了嗜热链球菌WHH3379所产胞外多糖良好的抗氧化和保湿功能。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一株高产胞外多糖的乳酸菌，所述乳酸菌命名为WHH3379，已于2020年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20089；菌株分类为嗜热链球菌Streptococcusthermophilus。
为了进一步验证该菌株的种属进而研究该菌株所产胞外多糖的结构和性质，进行了16S rDNA序列分析(上游引物8F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；下游引物1492R：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。该菌株经16S rDNA基因测序，基因测序的结果如下：
CCCAATGGGGCGGCGTTGCCTATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGTTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTTGCGAGTCGGTGACGGCGAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGGGGAACAAAATGG。
一株高产胞外多糖的乳酸菌的筛选方法，从M17培养基中挑取具有拉丝倾向的乳酸菌菌落，纯化培养，然后接种于灭菌脱脂牛奶进行发酵，选取发酵乳质地粘稠，拉丝明显的乳酸菌。
作为优选，所述乳酸菌高产胞外多糖，其胞外多糖产量≥526.58±2.91mg/L。
一种胞外多糖的发酵生产方法，采取所述的乳酸菌进行发酵生产，包括以下步骤：
(1)将嗜热链球菌WHH3379接种于发酵基料中，静置培养，得到发酵乳；
(2)将发酵乳进行离心，去除菌体，取上清；
(3)离心去除菌体后的上清中加入三氯乙酸，去除蛋白，取上清；
(4)将步骤(3)所得上清用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀；
(5)将步骤(4)所得沉淀用超纯水透析，得到胞外多糖溶液。
作为优选，步骤(1)中，所述嗜热链球菌WHH3379产胞外多糖，最佳发酵培养条件为初始培养基pH值为6.24-6.26，温度为38-42℃，培养18-18.2h；步骤(2)中，所述离心转速为12000-12500rpm，离心时间为40-42min。
作为优选，步骤(3)中，所述三氯乙酸添加量最终浓度为5-7％(m/v)，室温下搅拌2-2.5h或4-6℃静置10-12h；步骤(4)中，所述乙醇百分比浓度95-100％，上清液与乙醇的体积比为1：3，所述静置时间22-24h。
作为优选，步骤(5)中，沉淀用去离子水溶解，装入截留分子量为14kDa的透析袋中透析2d以除去小分子物质，期间每8h换一次去离子水，得到粗多糖的水溶液。
在步骤(1)中，所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)WHH3379产胞外多糖，最佳发酵培养条件为初始培养基pH值为6.25，温度为40℃，培养18h。胞外多糖含量为：526.58±2.91mg/L，发酵周期短，产糖量高。在步骤(2)中，所述离心转速最好为12000rpm，离心时间最好为40min。此时菌体和胞外多糖能够得到很好的分离。在步骤(3)中，所述三氯乙酸添加量最好为最终浓度为5％(m/v)，室温下搅拌2h或4℃静置过夜。此条件下蛋白去除效果较好。在步骤(5)中，沉淀用去离子水溶解，装入截留分子量为14kDa的透析袋中透析2d以除去小分子物质，期间每8h换一次去离子水，从而得到粗多糖的水溶液，用苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量，胞外多糖含量为526.58±2.91mg/L。
采用所述发酵生产方法所制备的胞外多糖在制备抗氧化剂中的应用。
本发明通过实验证明了嗜热链球菌WHH3379所产胞外多糖良好的抗氧化和保湿功能，所制备的益生菌胞外多糖具有抗氧化作用和保湿作用，可以应用到医药保健领域。
一种所述高产胞外多糖的乳酸菌的应用，作为酸乳发酵剂的用途。
一种发酵剂，所述发酵剂的活性成分包含所述嗜热链球菌WHH3379。
一种风味发酵乳，由所述嗜热链球菌WHH3379或所述嗜热链球菌WHH3379发酵剂，接种到灭菌乳液中发酵5-10h，发酵温度为37-43℃，得到色泽均匀，质地粘稠，结构细腻，营养丰富的发酵乳。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过系列生物化学技术获得菌株发酵产物胞外多糖，采用现代提取技术对发酵液提取纯化获得高纯度多糖；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)WHH3379在脱脂乳培养基中发酵而得的发酵乳中，含有胞外多糖，具有产糖周期短、产糖量高、安全无毒副作用，具有广泛的商业化应用前景。
(2)通过本发明的方法制备的益生菌胞外多糖具有抗氧化作用和保湿作用，可以应用到医药保健领域。
(3)本发明筛选出的高产胞外多糖乳酸菌WHH3379发酵所得发酵酸乳色泽均匀、无乳清、结构细腻、质构粘稠，风味良好，产品无需添加稳定剂，满足消费者对纯天然食品的需求。
附图说明
图1为本发明嗜热链球菌WHH3379的菌落照片。
图2为本发明嗜热链球菌WHH3379的电子显微镜照片。
图3为本发明嗜热链球菌WHH3379的产酸曲线图。
图4为本发明嗜热链球菌WHH3379的发酵酸乳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
总实施例
一株高产胞外多糖的乳酸菌，所述乳酸菌命名为WHH3379，已于2020年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20089；菌株分类为嗜热链球菌Streptococcusthermophilus。所述乳酸菌高产胞外多糖，其胞外多糖产量≥526.58±2.91mg/L。
一种胞外多糖的发酵生产方法，采取所述的乳酸菌进行发酵生产，包括以下步骤：
(1)将嗜热链球菌WHH3379接种于发酵基料中，静置培养，得到发酵乳；所述嗜热链球菌WHH3379产胞外多糖，最佳发酵培养条件为初始培养基pH值为6.24-6.26，温度为38-42℃，培养18-18.2h。
(2)将发酵乳进行离心，去除菌体，取上清；所述离心转速为12000-12500rpm，离心时间为40-42min。
(3)离心去除菌体后的上清中加入三氯乙酸，去除蛋白，取上清；所述三氯乙酸添加量最终浓度为5-7％(m/v)，室温下搅拌2-2.5h或4-6℃静置10-12h。
(4)将步骤(3)所得上清用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀；所述乙醇百分比浓度95-100％，上清液与乙醇的体积比为1：3，所述静置时间22-24h。
(5)将步骤(4)所得沉淀用超纯水透析，得到胞外多糖溶液，沉淀用去离子水溶解，装入截留分子量为14kDa的透析袋中透析2d以除去小分子物质，期间每8h换一次去离子水，得到粗多糖的水溶液。
采用所述胞外多糖的发酵生产方法所制备的胞外多糖在制备抗氧化剂中的应用。
一种所述高产胞外多糖的乳酸菌的应用，作为酸乳发酵剂的用途。
一种发酵剂，所述发酵剂的活性成分包含所述嗜热链球菌WHH3379。
一种风味发酵乳，由权利要求1所述嗜热链球菌WHH3379或由权利要求9所述嗜热链球菌WHH3379发酵剂，接种到灭菌乳液中发酵5-10h，发酵温度为37-43℃，得到色泽均匀，质地粘稠，结构细腻，营养丰富的发酵乳
实施例1：嗜热链球菌WHH3379的筛选与鉴定
1.嗜热链球菌WHH3379的筛选
(1)培养基
M17固体培养基：乳糖5g，大豆胨5g，蛋白胨2.5g，牛肉膏5g，酵母提取物2.5g，柠檬酸铵2g，β-甘油磷酸钠19.0g，抗坏血酸钠0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂12.75g，蒸馏水1000mL，115℃灭菌20min。
灭菌脱脂牛乳：脱脂乳粉120g，蔗糖20g，葡萄糖20g，蒸馏水840mL(55℃)，均质，105℃灭菌10min。
(2)样品预处理
取农家自制酥油1mL加入装有9mL的无菌生理盐水中，制成10-1浓度的样品液，震荡混匀后逐级稀释到适宜浓度，静置备用。
(3)产粘菌落初筛
取上述各稀释度的菌液100μL涂布于M17固体培养基上，于43℃恒温培养箱中培养48h。挑取平板上具有粘性的菌落，于M17琼脂平板上反复三区划线，直至整个平板上的菌落形态一致，单菌落接种到M17液体培养基于43℃培养24h。得到的菌株在含有50％甘油的M17液体培养基中于～80℃冷冻保存。
(4)菌株复筛
①凝乳实验
将步骤(3)得到的产粘菌株按5％接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，40℃培养24h进行活化，活化后的菌株接种于含5mL全脂牛乳培养基试管中，40℃静置培养至牛乳凝固，按5％接种量接种于含100mL全脂牛乳三角瓶中，40℃静置培养至牛乳凝固，观察并记录凝乳状态。
②感官评定
对上述的酸乳进行感官评价，包括口感，气味和滋味，组织状态等。最终得到一株凝乳快、质地粘稠并且风味优良的菌株，编号为WHH3379。
2.嗜热链球菌WHH3379的鉴定
(1)形态学鉴定
嗜热链球菌WHH3379在M17琼脂培养基培养48h后，观察记录菌株在平板上的单菌落特征。菌落为圆形，边缘整齐，略突起，正反面颜色一致，中央与边缘颜色一致。
对嗜热链球菌WHH3379菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察细胞个体形态及排列方式。革兰氏染色呈阳性，不生芽，球形，成对或成链状。
生理生化鉴定
嗜热链球菌WHH3379为革兰氏阳性菌，不产芽孢和鞭毛，能以乳糖、葡萄糖、蔗糖等多种糖类为碳源进行发酵。接触酶阴性，不产吲哚。精氨酸产氨试验、H2S试验，淀粉水解试验，明胶液化试验均为阴性。
(3)16S rDNA序列分析
①细菌基因组DNA的提取
吸取100μL WHH3379菌株菌悬液于灭菌后的M17液体培养基中，于40℃培养24h。按细菌基因组DNA抽提试剂盒操作步骤提取菌株WHH3379的基因组DNA。
②PCR扩增
PCR引物为：
上游引物8F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’
下游引物1492R：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反应条件为：95℃预热3min，95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，循环30次，72℃保持5min，4℃保温。
③琼脂糖凝胶电泳
用移液枪先吸取2μL loading buffer，再吸取5μL PCR扩增产物，反复抽吸混匀，混合液加到样品槽中。待测样品加样完毕后，在电泳槽一端加入5μL DNA marker。在120V恒电压、80A恒电流下进行电泳，当loading buffer指示剂移动到凝胶底部时，取出凝胶用凝胶成像仪在UV下成像，扩增片段长度为1.5kb左右。
④16S rDNA测序及序列比对
阳性PCR产物送样至金唯智生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI数据库中应用BLAST工具与GenBank数据库已有序列进行比对分析，分析待测菌株与已知菌株相应序列的同源性，确定筛选出来的产糖菌株种属。该菌株经16S rDNA基因测序，基因测序的结果如下：
CCCAATGGGGCGGCGTTGCCTATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGTTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTTGCGAGTCGGTGACGGCGAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGGGGAACAAAATGG。
根据其生理生化特性及16S rRNA序列分析的结果，确定筛选的乳酸菌WHH3379为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
实施例2：嗜热链球菌WHH3379的胞外多糖的制备
(1)脱脂牛乳制备
脱脂乳粉12％(w/v)，蔗糖2％(w/v)，葡萄糖2％(w/v)溶于55℃蒸馏水中，均质，105℃灭菌10min。
(2)制备种子液
将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)WHH3379接种于基础M17培养基中，使培养基中初始细胞浓度为1.0×108个/mL，即为种子液。
(3)产糖发酵条件
将嗜热链球菌WHH3379以2.0％(V/V)的接种量，接种于灭菌脱脂牛乳中，40℃下静置培养18～24h，得到发酵乳。
(4)胞外多糖制备
取发酵乳在95℃水浴中加热10min去除其中可能降解多糖的酶，冷却到室温。然后4℃、8000rpm离心30min去除细胞和部分蛋白沉淀。向上清液中加入80％(W/V)的TCA(三氯乙酸)至终浓度4％(W/V)，充分搅拌后4℃静置18小时，12000×g 4℃离心40min。将上清液用95％的乙醇以料液比1：3进行醇沉，4℃静置18小时，离心取沉淀，加纯水溶解即得多糖溶液。多糖溶液装入透析袋中(截留分子量14000Da)，4℃冰箱中超纯水透析2d，每8h换一次水。冷冻干燥24h后，得到干燥多糖。
(5)胞外多糖纯度鉴定
准确称取纯化后的多糖5mg，溶于5mL超纯水中，制成1mg/mL的多糖溶液，用紫外可见光谱仪于190-350nm波段进行紫外扫描，检测多糖纯度。如果在260nm及280nm处有观察到明显的特征吸收峰，说明提取的多糖样品纯度不高，含有核酸和蛋白质。反之，如果在260nm和280nm处没有观察到吸收峰的存在或者吸收峰极小，说明胞外多糖样品纯度较高，不含核酸和蛋白质。
实验测得嗜热链球菌WHH3379在260nm、280nm波长处没有紫外特征吸收峰，保证了一定的纯度。
(6)胞外多糖含量测定
采用苯酚硫酸法测定胞外多糖的含量，以葡萄糖作为标准品绘制标准曲线。取干燥至恒重的葡萄糖配置浓度为20％(w/v)的葡萄糖标准溶液。反应体系如表1所示，溶液添加顺序依次为标准葡萄溶液、6％(v/v)苯酚溶液、浓硫酸溶液，混匀，静置冷却至室温，在490nm处测定其吸光度，每组3个平行。以葡萄糖含量(mg/L)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得到的回归方程为：y＝0.0091x-0.011(R2＝0.9984)。同法测得分离菌株所产胞外多糖溶液在490nm处的吸光度，带入回归方程计算EPS产量。
本实施例获得的嗜热链球菌WHH3379胞外多糖产量为526.58±2.91mg/L。
表1 苯酚硫酸法标准曲线绘制
Figure BDA0002875989410000091
实施例3：嗜热链球菌WHH3379产胞外多糖的抗氧化能力
嗜热链球菌WHH3379的胞外多糖的制备方法见实施案例2。取嗜热链球菌WHH3379产胞外多糖样品，配制成不同浓度(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和8.0mg/mL)的多糖溶液，按照如下方法分别测定四项抗氧化指标。其中，三项自由基清除能力大小以EC50值表示，为清除率在50％时的有效作用浓度。该值越小，表示物质的抗氧化能力越强。
(1)DPPH自由基清除实验
取2mL多糖样品溶液于试管中，加入2mL 0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液混合均匀，室温下避光反应1h，517nm处测定吸光值。空白组以等体积甲醇代替DPPH溶液，对照组以等体积无菌水代替样品溶液。以VC作阳性对照。DPPH自由基清除率公式为：
DPPH自由基清除率(％)＝[1－(A1－A)/A0]×100％
式中：A为空白组的吸光度；A0为对照组的吸光度；A1为样品组的吸光度。
(2)羟自由基(·OH)清除实验
采用Fenton法测定菌株对羟自由基的清除作用。Fenton反应体系：1mL0.435mmol/L的亮绿，2mL 0.5mmol/L的硫酸亚铁，1.5mL 3％(w/v)的过氧化氢。向Fenton反应体系中加入1mL不同浓度的多糖样品，混合均匀后，37℃恒温水浴20min，4℃、8000rpm离心10min，取上清液，用分光光度计测定624nm处吸光值。以VC作阳性对照。羟自由基清除率计算公式：
清除率(％)＝[(A1－A0)/(A－A0)]×100
式中：A1为Fenton试剂+样品+亮绿溶液体系的吸光度；A0为Fenton试剂+亮绿的溶液体系吸光度；A为仅含亮绿溶液的吸光度。
(3)超氧阴离子(O2·–)清除实验
25℃条件下，取50mmol/L pH 8.2(含1mmol/L的EDTA)的Tris-HCl缓冲溶液3mL，加入25mmol/L邻苯三酚10μL，迅速混匀，置于石英比色杯中，在325nm处每隔30s测定一次吸光值，反应4.5min结束，控制自氧化速率在吸光值每分钟变换0.07。以吸光值对时间作图，斜率即为邻苯三酚自氧化速率A0。在3mL Tris-HCl缓冲液中入加适量样品，同样方法测样品的邻苯三酚自氧化速率A1。以VC作阳性对照。超氧阴离子清除率计算公式：
清除率(％)＝[(A0－A1)/(A0)]×100
式中：A0是以吸光度对时间作图的斜率，即邻苯三酚自氧化速率；A1是同样方法测得样品的邻苯三酚自氧化速率。
(4)还原能力测定
采用铁氰化钾法。取1mL样品于试管中，加入0.2mol/L pH 6.6的PBS及1％的铁氰化钾溶液各1mL，混匀。50℃水浴反应20min，骤冷。再加入1mL 5％三氯乙酸，4000r/min离心5min，取上清液2.5mL，加入蒸馏水2.5mL、0.1％三氯化铁0.5mL，摇匀，静置反应10min后，于700nm处测定吸光值。A700nm值越大，代表还原能力越强。以VC作阳性对照。
实验测得嗜热链球菌WHH3379产胞外多糖具有较好的抗氧化活性，清除DPPH·、OH·、O2 -·的EC50值分别为3.85、2.36和1.06mg/mL，5mg/mL时还原能力A700nm为1.068。科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基、超氧阴离子的产生有关联，研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害，嗜热链球菌WHH3379所产胞外多糖本身具有的良好抗氧化活性，可用于制备成各种化妆品和保健品，保护细胞免受自由基侵害，防止老化，其生物活性显著，并且价格低廉，生产安全，无毒副作用。
表2 WHH3379产EPS抗氧化能力
抗氧化指标 whh3379 EPS V<sub>C</sub>
DPPH· 3.85±0.07 0.45±0.02
OH· 2.36±0.02 3.56±0.04
O<sub>2</sub><sup>-</sup>· 1.06±0.03 0.55±0.05
还原力(5mg/mL，A<sub>700nm</sub>) 1.068±0.01 2.502±0.03
实施例4嗜热链球菌WHH3379产胞外多糖的保湿性
准确称取5g实施例2中嗜热链球菌WHH3379胞外多糖，加入2g水，放在培养皿中，将培养皿放在烘干干燥器内，温度为40℃；同时将2g水放在培养皿中放在干燥器内作为对照，分别于1h，2h，3h，4h称重。通过下式求出保湿率。
保湿率＝(Wn/W)*100％
其中，Wn为放置后试样质量，W---放置前试样质量。
表3WHH3379产EPS保湿能力
时间 对照组保湿率(％) 样品组保湿率(％)
1h 51.2 89.5
2h 16.8 73.2
3h 0 65.4
4h 0 52.1
由此可见，嗜热链球菌WHH3379胞外多糖具有良好的保湿效果，可能具有良好的成膜性从而减少水分蒸发，由于其纯天然，无毒副作用，是良好的化妆护肤品添加成分。
实施例5利用嗜热链球菌WHH3379制备直投式菌粉发酵剂
1.嗜热链球菌WHH3379菌泥的制备
将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)WHH3379接种于50mL基础M17培养基中，放置40℃培养箱中培养18～24h。再按2％的接种量于250mL M17液体培养基中二次活化，放置40℃培养箱中培养18～24h。最后将活化好的嗜热链球菌WHH3379以5％接种量于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于40℃、恒pH6.0的条件下培养18～24h，得到发酵液。8000r/min、4℃离心15min，弃上，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗菌体1次，即得到嗜热链球菌WHH3379菌泥。
2.冻干保护剂的制备
冻干保护剂含有10％的脱脂乳粉，5％的乳糖，2％的谷氨酸钠，2％的甘油，水作为溶剂，于105℃灭菌5min。
3.嗜热链球菌冻干冻干菌粉的制备
将上述制备的嗜热链球菌冻干菌体沉淀以1:5的比例与保护剂溶液充分搅拌混匀。混合液于～80℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上。放入真空冷冻干燥箱干燥20h后，得到嗜热链球菌冻干菌粉。平板计数得嗜热链球菌冻干中活菌数为1.3×1011CFU/g。
实施例6嗜热链球菌冻干制备脱脂酸乳
1.脱脂酸乳的制备
将脱脂乳粉12％(w/v)，蔗糖2％(w/v)，葡萄糖2％(w/v)溶于55℃蒸馏水中，均质，95℃灭菌10min，冷却至40℃。将嗜热链球菌WHH3379冻干菌粉按最终活菌数为1.0×106CFU/mL的接种量接种于灭菌脱脂乳中，40℃静置培养5～6h，冷却至15℃，得到不需要添加增稠剂的酸乳。
嗜热链球菌冻干发酵得到的酸乳色泽均匀、无乳清、结构细腻、质构粘稠，风味良好。
2.酸乳理化指标测定
1)pH值测定
采用梅特勒-托利多METTLER TOLEDO pH计直接测定，三次平行实验，取平均值。
实验测得嗜热链球菌冻干发酵酸乳的终点pH为4.42±0.15。
2)滴定酸度的测定
参照GB 5009.239-2016中的方法，称取10g(精确到0.001g)已混匀的试样，置于150mL锥形瓶中，加20mL新煮沸冷却至室温的水，混匀，用氢氧化钠标准溶液电位滴定至pH8.3为终点。滴定过程中，向锥形瓶中吹氮气，防止溶液吸收空气中的二氧化碳。记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数(V1)，代入下式中进行计算。三次平行实验，取平均值。
Figure BDA0002875989410000121
式中：
X1——样品的酸度，单位为度(°T)[以100g样品所消耗的0.1mol/L氢氧化钠的毫升数计，单位为毫升每100克(ml/100g)]；
C1——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
V1——滴定时所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(ml)；
V0——空白实验所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(ml)；
100——100g样品；
m1——样品的质量，单位克(g)；
0.1——酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)。
实验测得嗜热链球菌冻干发酵酸乳的终点酸度为72～78°T。
3)脱水收缩敏感性的测定
在4℃下，称取50.0g酸奶样品，置于带有滤纸的漏斗烧杯收集沥出的乳清并称重，收集时间2h。三次平行实验，取平均值。
脱水收缩性(％)＝乳清析出质量(g)/样品质量(g)×100％
实验测得嗜热链球菌冻干发酵酸乳的持水力为42％。
4)酸乳粘度的测定
采用流变仪(美国博勒飞公司DV2T型)，在4℃下测试粘度，转子型号为64，分别在30r/min的速度下测定三次，选取第30s的数据为测量值。三次平行实验，取平均值。
实验测得嗜热链球菌whh3379发酵酸乳的粘度为5486mPa﹒s。粘稠的质感赋予酸奶良好的品质。
图1说明了：嗜热链球菌WHH3379在平板上的单菌落特征为圆形，边缘整齐，略突起，正反面颜色一致，中央与边缘颜色一致，符合乳酸菌典型特征。
图2说明了：嗜热链球菌WHH3379革兰氏染色呈阳性，不生芽，球形，成对或成链状。
图3说明了：嗜热链球菌WHH3379产酸快，后酸化程度低，有作为商业发酵剂的潜能。
图4说明了：嗜热链球菌WHH3379冻干菌粉发酵得到的酸乳质构粘稠、结构细腻、色泽均匀、无乳清、风味良好。
由上述实施例1～6相关的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到最优的高产胞外多糖的乳酸菌及其应用方案。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 杭州娃哈哈科技有限公司
<120> 一株高产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA/RNA
<213> 嗜热链球菌WHH3379(Streptococcus thermophilusWHH3379)
<400> 1
cccaatgggg cggcgttgcc tatacatgca agtagaacgc tgaagagagg agcttgctct 60
tcttggatga gttgcgaacg ggtgagtaac gcgtaggtaa cctgccttgt agcgggggat 120
aactattgga aacgatagct aataccgcat aacaatggat gacacatgtc atttatttga 180
aaggggcaat tgttccacta caagatggac ctgcgttgta ttagctagta ggtgaggtaa 240
tggctcacct aggcgacgat acatagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 300
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttcggca atgggggcaa 360
ccctgaccga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgta 420
agtcaagaac gggtgtgaga gtggaaagtt cacactgtga cggtagctta ccagaaaggg 480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt cccgagcgtt gtccggattt 540
attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttg ataagtctga agttaaaggc tgtggctcaa 600
ccatagttcg ctttggaaac tgtcaaactt gagtgcagaa ggggagagtg gaattccatg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggag gaacaccggt ggcgaaagcg gctctctggt 720
ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 780
tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggatccttt ccgggattca gtgccgcagc 840
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatcccga tgctatttct agagatagaa agttacttcg gtacatcggt 1020
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccctattgtt agttgccatc attcagttgg gcactctagc gagactgccg 1140
gtaataaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatggt tggtacaacg agttgcgagt cggtgacggc gagctaatct 1260
cttaaagcca atctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt ggagccagcc 1440
gcctaagggg gaacaaaatg g 1461

Claims (10)

1.一株高产胞外多糖的乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌命名为WHH3379，已于2020年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20089；菌株分类为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus。
2.根据权利要求1所述的一株高产胞外多糖的乳酸菌，其特征在于：所述乳酸菌高产胞外多糖，其胞外多糖产量≥526.58±2.91 mg/L。
3.一种胞外多糖的发酵生产方法，其特征在于：采取如权利要求1所述的乳酸菌进行发酵生产，包括以下步骤：
（1）将嗜热链球菌WHH3379接种于发酵基料中，静置培养，得到发酵乳；
（2）将发酵乳进行离心，去除菌体，取上清；
（3）离心去除菌体后的上清中加入三氯乙酸，去除蛋白，取上清；
（4）将步骤（3）所得上清用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀；
（5）将步骤（4）所得沉淀用超纯水透析，得到胞外多糖溶液。
4.根据权利要求3所述的发酵生产方法，其特征在于：步骤（1）中，所述嗜热链球菌WHH3379产胞外多糖，最佳发酵培养条件为初始培养基pH值为6.24-6.26，温度为38-42℃，培养18-18.2 h；步骤（2）中，所述离心转速为12000-12500 rpm，离心时间为40-42 min。
5.根据权利要求3或4所述的发酵生产方法，其特征在于：步骤（3）中，所述三氯乙酸添加量最终浓度为5-7%（m/v），室温下搅拌2 -2.5h或4-6℃静置10-12h；步骤（4）中，所述乙醇百分比浓度95-100%，上清液与乙醇的体积比为1：3，所述静置时间为22-24 h。
6.根据权利要求3所述的发酵生产方法，其特征在于：步骤（5）中，沉淀用去离子水溶解，装入截留分子量为14 kDa的透析袋中透析2 d以除去小分子物质，期间每8 h换一次去离子水，得到粗多糖的水溶液。
7.采用权利要求3的方法所制备的胞外多糖在制备抗氧化剂中的应用。
8.一种如权利要求1所述高产胞外多糖的乳酸菌的应用，其特征在于：作为酸乳发酵剂的用途。
9.一种发酵剂，其特征在于：所述发酵剂的活性成分包含权利要求1所述嗜热链球菌WHH3379。
10.一种风味发酵乳，其特征在于：由权利要求1所述嗜热链球菌WHH3379或由权利要求9所述嗜热链球菌WHH3379发酵剂，接种到灭菌乳液中发酵5-10 h，发酵温度为37-43℃，得到色泽均匀，质地粘稠，结构细腻，营养丰富的发酵乳。
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