CN113151067A - 一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺 - Google Patents

一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺,包括以下步骤:发酵、提取、分离得到乳酸菌发酵提取物,其中,使用三段变温方式,调节温度和时间,有效提高乳酸菌提取物的提取率,使用三段变温方式,调节温度和时间,有效提高乳酸菌提取物的提取率,本发明的乳酸菌发酵提取物具有一定抗氧化效果、保湿效果可应用于抗氧化日化产品。

Description

一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域,特别涉及一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺。
背景技术
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。这类细菌在自然界分布极为广泛,具有丰富的物种多样性,至少包含18个属,共200多种。除极少数外,其绝大部分都是人体内必不可少的、且具有重要生理功能的菌群,广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料,而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域具有极高的应用价值。
专利“一种富含酶解多肽的复合乳酸菌制剂的生产工艺”,申请号202010007448.1,通过酶解鸡血多肽,制得复合乳酸菌制剂;
专利“一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺及其运用”申请号201511007402.5,制备扩大菌种液和一级种子培养液得到一级菌种液,再将一级菌种液与种子培养基在种子罐混合培养得到种子罐菌种,再将所述的种子罐菌种与发酵罐培养基混合培养并通过诱导液进行发酵得到发酵液,当发酵完毕后,进行发酵液离心,得到湿菌泥,目前对乳酸菌发酵产物的提取大部分采用酶解或者分步进行,这样生产周期长,提取率低,且含有的抗氧化因子和保湿因子含量低等问题。
发明内容
鉴于此,本发明提出一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺,解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的:一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺:包括以下步骤:
S1、发酵:将乳酸菌进行发酵培养,第一段发酵温度为20~25℃,发酵时间3~5h,第二段发酵温度为26~30℃,发酵时间8~10h,第三段发酵温度为10~15℃,发酵时间为2~6h,得到菌落数为1.0~3.0×108CFU/ml的种子液,所述发酵培养基均由葡萄糖、乙酸钠、蛋白胨、蒲桃提取物制得;
S2、提取:将种子液接种至上述发酵培养基中,种子液和发酵培养基的体积比为1:20~60,在30~35℃,转速为80~100rpm下调节pH6.0-8.0,再进行培养12~25h,得到乳酸菌发酵初液;
S3、分离:对乳酸菌发酵初液离心,离心转速为3000~3500rpm,离心10~30min,收集上清液,用0.22~0.28μm滤膜过滤,得到乳酸菌发酵提取物。
进一步的,所述乳酸菌为乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌中的一种。
进一步的,所述发酵步骤在摇床中进行,控制摇床的160~200rpm。
进一步的,所述发酵培养基配方:葡萄糖2~8g/L、乙酸钠8~10g/L、蛋白胨10~15g/L、蒲桃提取物3~5g/L制得。
进一步的,所述蒲桃提取物:将干燥粉碎的蒲桃新鲜叶用提取剂浸提10~24h,然后在20~60℃条件下在20~50KHz频率超声波下提取0.5~1h,制得蒲桃提取物;其中,所述蒲桃新鲜叶与提取剂的质量体积比为1g:5~15mL;所述提取剂为85~90wt%乙醇溶液。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明的乳酸菌发酵提取物,通过改进发酵工艺,使用三段变温方式,调节温度和时间,有效提高乳酸菌提取物的提取率,控制种子液和发酵培养基之间的体积比,能使种子液在培养基中适宜生长,提供较高的营养进行发酵,同时,在发酵培养基中添加蒲桃提取物能有效促进发酵,利用蒲桃植物中的糖分,破坏其组织结构,提取率明显提高;另外,本发明的乳酸菌发酵提取物具有一定抗氧化效果、保湿效果可应用于抗氧化日化产品。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容,下面提供具体实施例,对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺:包括以下步骤:
S1、发酵:将乳酸杆菌进行发酵培养,第一段发酵温度为20℃,发酵时间3h,第二段发酵温度为26℃,发酵时间8h,第三段发酵温度为10℃,发酵时间为2h,得到菌落数为1.0×108CFU/ml的种子液,所述发酵均在摇床中进行,控制摇床的160rpm,所述发酵培养基配方:葡萄糖2g/L、乙酸钠8g/L、蛋白胨10g/L、蒲桃提取物3g/L制得;所述蒲桃提取液:将干燥粉碎的蒲桃新鲜叶用提取剂浸提10h,然后在20℃条件下在20KHz频率超声波下提取0.5h,制得蒲桃提取物;蒲桃新鲜叶与提取剂的质量体积比为1g:5mL;所述提取剂为85wt%乙醇溶液;
S2、提取:将种子液接种至上述发酵培养基中,种子液和发酵培养基的体积比为1:20,在30℃,转速为80rpm下调节pH6.0,再进行培养12h,得到乳酸菌发酵初液;
S3、分离:对乳酸菌发酵初液离心,离心转速为3000rpm,离心10min,收集上清液,用0.22μm滤膜过滤,得到乳酸菌发酵提取物。
实施例2
一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺:包括以下步骤:
S1、发酵:将乳酸杆菌进行发酵培养,第一段发酵温度为25℃,发酵时间5h,第二段发酵温度为30℃,发酵时间10h,第三段发酵温度为15℃,发酵时间为6h,得到菌落数为3.0×108CFU/ml的种子液,所述发酵均在摇床中进行,控制摇床的200rpm,所述发酵培养基配方:葡萄糖8g/L、乙酸钠10g/L、蛋白胨15g/L、蒲桃提取物5g/L制得;所述蒲桃提取液:将干燥粉碎的蒲桃新鲜叶用提取剂浸提24h,然后在60℃条件下在50KHz频率超声波下提取1h,制得蒲桃提取物;所述蒲桃新鲜叶与提取剂的质量体积比为1g:15mL;所述提取剂为90wt%乙醇溶液;
S2、提取:将种子液接种至上述发酵培养基中,种子液和发酵培养基的体积比为1:60,在35℃,转速为100rpm下调节pH8.0,再进行培养25h,得到乳酸菌发酵初液;
S3、分离:对乳酸菌发酵初液离心,离心转速为3500rpm,离心30min,收集上清液,用0.28μm滤膜过滤,得到乳酸菌发酵提取物。
实施例3
一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺:包括以下步骤:
S1、发酵:将乳酸杆菌进行发酵培养,第一段发酵温度为23℃,发酵时间4h,第二段发酵温度为28℃,发酵时间9h,第三段发酵温度为13℃,发酵时间为4h,得到菌落数为2.0×108CFU/ml的种子液,所述发酵均在摇床中进行,控制摇床的180rpm,所述发酵培养基配方:葡萄糖6g/L、乙酸钠9g/L、蛋白胨13g/L、蒲桃提取物4g/L制得;所述蒲桃提取液:将干燥粉碎的蒲桃新鲜叶用提取剂浸提17h,然后在40℃条件下在40KHz频率超声波下提取0.8h,制得蒲桃提取物;其中,蒲桃新鲜叶与提取剂的质量体积比为1g:10mL;所述提取剂为88wt%乙醇溶液;
S2、提取:将种子液接种至上述发酵培养基中,种子液和发酵培养基的体积比为1:40,在33℃,转速为90rpm下调节pH7.0,再进行培养20h,得到乳酸菌发酵初液;
S3、分离:对乳酸菌发酵初液离心,离心转速为3300rpm,离心20min,收集上清液,用0.25μm滤膜过滤,得到乳酸菌发酵提取物。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于,所述发酵培养基配方:葡萄糖10g/L、乙酸钠5g/L、蛋白胨18g/L、蒲桃提取液2g/L。
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于,所述摇床的速率为250rpm。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于,所述发酵步骤中发酵采用一段恒温发酵,发酵温度为28℃,发酵时间为20h。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于,所述提取步骤中种子液和发酵培养基的体积比为1:15。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于,所述发酵培养基中不含有蒲桃提取物。
一、提取率
将实施例1~5和对比例1~3所提取的乳酸菌发酵提取物测定提取率,采用高效液相色谱仪测定,
(1)色谱条件
色谱仪:Agilent1100高效液相色谱仪,UV213nm检测器;
色谱柱:Walts sunfireC18,4.6×250nm,5μm;
柱温:35℃;
流动相:甲醇:0.01%体积百分比浓度的盐酸溶液=5:95,比例为体积比;
流速:1.0mL/min;
进样量:20μL;
(2)样品测定
在相同的色谱分析条件下,取20μl步骤1)制备的试样溶液注入高效液相色谱仪分析,测定色谱峰面积或峰高,与标准曲线比较确定进样液中提取物质量,绘制色谱;
(3)结果计算
X=(M1×V)/(M×V1)*100%
X为乳酸菌发酵提取物的含量
M1为乳酸菌发酵提取物的质量,单位为g
M为乳酸菌的质量,单位g
V为样品溶液体积,单位μL
V1为进样体积,单位μL
测定结果如下:
组别 提取率(%)
实施例1 82.1
实施例2 83.9
实施例3 87.7
实施例4 79.1
实施例5 80.3
对比例1 68.4
对比例2 63.1
对比例3 60.5
由上述表格结果可知,本发明的实施例1~5和对比例1比较,采取三段式变温发酵,更能提高乳酸菌提取物的提取率,与对比例2比较,控制种子液和发酵培养基之间的体积比,能使种子液在培养基中适宜生长,提供较高的营养进行发酵,和对比例3比较,说明蒲桃提取物能有效促进发酵,利用蒲桃植物中的糖分,破坏其组织结构,提高提取率;实施例1~3和实施例4比较,调整发酵培养基配方,科学配比,在此配比下达到最佳的提取效率;实施例1~3和实施例5比较,发酵过程中摇床的速率对发酵进程起到一定的影响。
二、抗氧化活性和保湿效果评价
将上述实施例1~5和对比例1~3中的乳酸菌发酵提取物,做DPPH清除实验和测定添加在面膜中使用后皮肤含水量实验,评价抗氧化活性和保湿效果。
取4mgDPPH溶解于100ml的95%乙醇;
1ml样品与1ml的95%乙醇和2ml DPPH乙醇溶液混合(T)
1ml样品与3ml的95%乙醇混合(T0)
2ml DPPH乙醇溶液与2ml的95%乙醇混合(C)
4ml的95%乙醇(C0)
混合后25℃避光30min后检测
清除率(%)=(1-(T-T0)/(C-C0))×100%
每个样品测量三次取平均值
测量结果如下:
组别 DPPH清除率%
实施例1 50.3
实施例2 52.1
实施例3 56.9
实施例4 49.6
实施例5 48.7
对比例1 32.6
对比例2 33.7
对比例3 31.5
由上表可知,实施例1~5和对比例1~3比较,DPPH的清除率随着提取率的变化,说明提取率对清除率也有一定的影响,同时,本发明的乳酸菌发酵提取物具有一定抗氧化效果可应用于抗氧化日化产品。
三、保湿效果评价试验
将乳酸菌发酵提取物加入面膜液中,选取18~36岁年龄段人群,随机分为8组,每组20人,清洁脸部后敷面膜20min,擦干剩余的面膜液等三分钟,再经皮肤测试仪测定皮肤含水量,标定为100%,10小时后再次测量皮肤含水量,结果如下表:
Figure BDA0003002403320000071
Figure BDA0003002403320000081
由上表可以看出,本发明的乳酸菌发酵提取物加入到面膜中,实施例1~5皮肤含水量在80.1~87.6%之间,与对比例1~3比较,能有效减缓皮肤水分丢失,起到保湿效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺,其特征在于:包括以下步骤:
S1、发酵:将乳酸菌进行发酵培养,第一段发酵温度为20~25℃,发酵时间3~5h,第二段发酵温度为26~30℃,发酵时间8~10h,第三段发酵温度为10~15℃,发酵时间为2~6h,得到菌落数为1.0~3.0×108CFU/ml的种子液,所述发酵培养基均由葡萄糖、乙酸钠、蛋白胨、蒲桃提取物制得;
S2、提取:将种子液接种至上述发酵培养基中,种子液和发酵培养基的体积比为1:20~60,在30~35℃,转速为80~100rpm下调节pH6.0-8.0,再进行培养12~25h,得到乳酸菌发酵初液;
S3、分离:对乳酸菌发酵初液离心,离心转速为3000~3500rpm,离心10~30min,收集上清液,用0.22~0.28μm滤膜过滤,得到乳酸菌发酵提取物。
2.如权利要求1所述的一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺,其特征在于:所述乳酸菌为乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌中的一种。
3.如权利要求1所述的一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺,其特征在于:所述发酵步骤在摇床中进行,控制摇床的160~200rpm。
4.如权利要求1所述的一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺,其特征在于:所述发酵培养基配方:葡萄糖2~8g/L、乙酸钠8~10g/L、蛋白胨10~15g/L、蒲桃提取液3~5g/L制得。
5.如权利要求1所述的一种乳酸菌发酵提取物的提取分离工艺,其特征在于:所述蒲桃提取物:将干燥粉碎的蒲桃新鲜叶用提取剂浸提10~24h,然后在20~60℃条件下在20~50KHz频率超声波下提取0.5~1h,制得蒲桃提取物;其中,所述蒲桃新鲜叶与提取剂的质量体积比为1g:5~15mL;所述提取剂为85~90wt%乙醇溶液。
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