CN111329897A - 一种混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
一种混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，包括以下步骤：将植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌4种菌株接种至液体MRS培养基中，复苏活化至每种细菌数量达到106～1010CFU/mL时，按照体积等比混合4种菌液；将桃金娘粉末置于培养瓶中，加入混合菌液搅拌后，加入无菌水使得含水量为30～70％，置于恒温培养箱中密封发酵24～120h；发酵完成后按1:10(m/v)加入95％乙醇于水浴锅中水浴提取，过滤回收提取液，再采用亚硝酸钠‑硝酸铝比色法测定总黄酮的含量。本发明能够利用混合益生菌的降解作用，将桃金娘中的黄酮更好地释放出来；且对设备要求低，反应产物环境污染小，生物利用率高。
Description
技术领域
本发明涉及中药材开发研究领域，具体为一种利用植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌4种混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法。
背景技术
黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核的化合物，分为黄酮、黄酮类、黄酮醇等，这些天然的黄酮类化合物广泛存在于植物的花、叶、果实中，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等药理作用。目前，黄酮类物质的提取方法有化学提取法、物理提取法和生物转化法。生物转化法是利用微生物发酵、酶解等技术手段提高黄酮类化合物的含量，其中微生物发酵技术应用较为广泛。使用微生物发酵炮制中草药能够增加中草药的药效，降低药物的毒副作用，修饰中草药中的活性成分。这种方式对设备要求易于满足，反应产物不会造成环境污染，同时还能够提高生物利用率。微生物发酵中草药有单一菌种发酵和混合菌种发酵，单一菌种发酵中草药存在产酶种类单一，产酶能力较弱等不足，而混合菌发酵的效率更高，发酵产物也更丰富。
而目前对于采用混合菌发酵提取总黄酮的技术公开很少，也未见专门利用混合益生菌发酵桃金娘进而提取总黄酮的方法公开。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：基于植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌4种混合益生菌发酵桃金娘，以发酵完成的桃金娘样品水浴提取总黄酮，建立一种混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：一种利用植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌4种混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)对样品桃金娘中草药进行鉴定。
(2)工艺流程：
桃金娘烘干粉碎后，紫外灭菌。将植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别复苏活化后，接种，发酵。
(3)标准溶液配制：
准确称取5～10mg芦丁对照品，用95％乙醇溶解并定容至10～100mL棕色容量瓶中，制成50～500μg/mL的芦丁标准溶液。
(4)黄酮含量测定：
采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量。标准曲线：分别准确梯度吸取芦丁标准溶液0～60μL于96微孔板中，各微孔补加95％乙醇至60μL，加入10μL 5％NaNO2溶液，摇匀后静置5～10min，加入10％Al(NO3)3溶液10μL，摇匀后静置5～10min，加入1mol/L的NaOH溶液100μL，加95％乙醇定容，混匀后静置5～20min，在490～595nm处测量吸光值。以X轴为质量浓度(μg/mL)，y轴为吸光度值绘制标准曲线。
(5)桃金娘预处理：
将采摘的桃金娘自然晾干后于50～70℃烘箱中烘干，粉碎后过40～60目筛，称取5～20g/份，在紫外灯下照射灭菌15～30min，置于超净台中备用。
(6)混合菌液制备：
将植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌4种菌按照3％～15％的接种量分别接种至5～10mL液体MRS培养基中，置于厌氧罐密封后，在37℃电热恒温培养箱中培养48h活化。连续培养两代后，采用平板计数法检测菌液中细菌的数量，当每种细菌数量达到106～1010CFU/mL时，按照1:1:1:1(v/v)混合4种菌液备用。
(7)接种与发酵：
将紫外灭菌的桃金娘粉末置于培养瓶中，按照3％～15％的接种量加入菌种混合液，搅拌后，加入适量无菌水，使得最终含水量30％～70％，并搅拌。将接种混合益生菌的桃金娘密封置于37℃恒温培养箱中，发酵24～120h。发酵完毕，取出烘干后装入自封袋中，标记备用。
(8)桃金娘总黄酮提取：
将发酵完成的桃金娘样品按1:5～1:10(m/v)加入95％乙醇于50～70℃水浴锅中水浴提取0.5～2.5h，过滤，回收提取液。
(9)样品检测：
吸取发酵水浴提取液，过0.22～0.45μm滤膜后采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮的含量。
本发明利用植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌4种混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，具有以下优点和积极效果：
(1)本发明能够利用混合益生菌的降解作用，将桃金娘中的黄酮更好地释放出来。
(2)本发明对设备要求低、反应产物环境污染小、生物利用率高。
(3)本发明可用于发酵桃金娘产黄酮，能够为桃金娘抗氧化活性成分的筛选和进一步开发提供理论依据。
附图说明
图1为本发明实施例芦丁对照品标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方法和附图对本发明的技术方案做进一步说明。
以下所述3个实施例所采用的桃金娘产地为广西灵山，经广西兽医研究所高级兽医师鉴定为桃金娘。
实施例1
(1)对样品桃金娘中草药进行鉴定。
(2)工艺流程：
桃金娘烘干粉碎后，紫外灭菌。将植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别复苏活化后，接种，发酵。
(3)标准溶液配制：
准确称取10mg芦丁对照品，用95％乙醇溶解并定容至50mL棕色容量瓶中，制成200μg/mL的芦丁标准溶液。
(4)黄酮含量测定：
采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量。标准曲线：分别准确吸取芦丁标准溶液0、10、20、30、40、50、60μL于96微孔板中，补加95％乙醇至60μL，加入10μL 5％NaNO2溶液，摇匀后静置6min，加入10％Al(NO3)3溶液10μL，摇匀后静置6min，加入1mol/L的NaOH溶液100μL，加95％乙醇定容，混匀后静置15min，在515nm处测量吸光值。以x轴为质量浓度(μg/mL)，y轴为吸光度值绘制标准曲线。得标准曲线方程为y＝0.0003x+0.0202(R2＝0.9923)，见图1。
(5)桃金娘预处理：
将采摘的桃金娘自然晾干后于65℃烘箱中烘干，粉碎后过40目筛，称取10g/份，在紫外灯下照射灭菌30min，置于超净台中备用。
(6)菌液制备：
将植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌4种菌按照5％的接种量分别接种至5mL液体MRS培养基中，置于厌氧罐密封后，在37℃电热恒温培养箱中培养48h活化。连续培养两代后，采用平板计数法检测菌液中细菌的数量，当每种细菌数量达到109CFU/mL时，按照1:1:1:1(v/v)混合4种菌液备用。
(7)接种与发酵：
将紫外灭菌的桃金娘粉末置于培养瓶中，按照5％的接种量加入菌种混合液，搅拌后，加入适量无菌水，使得最终含水量40％，并搅拌。将接种混合益生菌的桃金娘密封置于37℃恒温培养箱中，发酵48h。发酵完毕，取出烘干后装入自封袋中，标记备用。
(8)桃金娘总黄酮提取：
将发酵完成的桃金娘样品按1:10(m/v)加入95％乙醇于60℃水浴锅中水浴提取1h，过滤，回收提取液。
(9)样品检测：
吸取发酵水浴提取液，过0.22μm滤膜后采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法在515nm处测定样品吸光度值，根据芦丁对照品标准曲线方程计算得到总黄酮含量为310.0μg/mL。
实施例2
(1)样品桃金娘中草药同实施例1。
(2)工艺流程同实施例1。
(3)标准溶液配制同实施例1。
(4)黄酮含量测定同实施例1。
(5)桃金娘预处理：
将采摘的桃金娘自然晾干后于65℃烘箱中烘干，粉碎后过40目筛，称取10g/份，在紫外灯下照射灭菌30min，置于超净台中备用。
(6)菌液制备：
将植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌4种菌按照7％的接种量分别接种至10mL液体MRS培养基中，置于厌氧罐密封后，在37℃电热恒温培养箱中培养48h活化。连续培养两代后，采用平板计数法检测菌液中细菌的数量，当每种细菌数量达到109CFU/mL时，按照1:1:1:1(v/v)混合4种菌液备用。
(7)接种与发酵：
将紫外灭菌的桃金娘粉末置于培养瓶中，按照7％的接种量加入菌种混合液，搅拌后，加入适量无菌水，使得最终含水量40％，并搅拌。将接种混合益生菌的桃金娘密封置于37℃恒温培养箱中，发酵72h。发酵完毕，取出烘干后装入自封袋中，标记备用。
(8)桃金娘总黄酮提取：
将发酵完成的桃金娘样品按1:10(m/v)加入95％乙醇于60℃水浴锅中水浴提取1.5h，过滤，回收提取液。
(9)样品检测：
吸取发酵水浴提取液，过0.45μm滤膜后采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法在515nm处测定样品吸光度值，根据芦丁对照品标准曲线方程计算得到总黄酮含量为452.3μg/mL。
实施例3
(1)样品桃金娘中草药同实施例1。
(2)工艺流程：
桃金娘烘干粉碎后，紫外灭菌。将嗜酸乳杆菌复苏活化后，接种，发酵。
(3)标准溶液配制同实施例1。
(4)黄酮含量测定同实施例1。
(5)桃金娘预处理：
将采摘的桃金娘自然晾干后于65℃烘箱中烘干，粉碎后过40目筛，称取10g/份，在紫外灯下照射灭菌30min，置于超净台中备用。
(6)菌液制备：
将嗜酸乳杆菌按照7％的接种量接种至10mL液体MRS培养基中，置于厌氧罐密封后，在37℃电热恒温培养箱中培养48h活化。连续培养两代后，采用平板计数法检测菌液中细菌的数量，当细菌数量达到109CFU/mL时用于后续试验。
(7)接种与发酵：
将紫外灭菌的桃金娘粉末置于培养瓶中，按照7％的接种量加入嗜酸乳杆菌菌液，搅拌后，加入适量无菌水，使得最终含水量40％，并搅拌。将接种嗜酸乳杆菌的桃金娘密封置于37℃恒温培养箱中，发酵72h。发酵完毕，取出烘干后装入自封袋中，标记备用。
(8)桃金娘总黄酮提取：
将发酵完成的桃金娘样品按1:10(m/v)加入95％乙醇于60℃水浴锅中水浴提取1.5h，过滤，回收提取液。
(9)样品检测：
吸取发酵水浴提取液，过0.45μm滤膜后采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法在515nm处测定样品吸光度值，根据芦丁对照品标准曲线方程计算得到总黄酮含量为62.8μg/mL。
Claims (7)
1.一种混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：将植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌4种菌株按照3％～15％的接种量分别接种至液体MRS培养基中，复苏活化至每种细菌数量达到106～1010CFU/mL时，按照体积等比混合4种菌液；将桃金娘粉末置于培养瓶中，按照3％～15％的接种量加入混合菌液搅拌后，加入无菌水使得含水量为30～70％，置于恒温培养箱中密封发酵24～120h；发酵完成后按质量体积比1:5～1:10加入95％乙醇于50～70℃水浴锅中水浴提取，过滤回收提取液，再采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮的含量。
2.根据权利要求1所述的混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，其特征在于，所述的复苏活化的具体步骤为：将所述4种菌株分别接种至5～10mL液体MRS培养基中，置于厌氧罐密封后，在37℃电热恒温培养箱中培养48h活化。
3.根据权利要求1所述的混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，其特征在于，所述密封发酵时恒温培养箱的温度为37℃。
4.根据权利要求1所述的混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，其特征在于，所述水浴提取的时间为0.5～2.5h。
5.根据权利要求1所述的混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，其特征在于，所述过滤采用0.22～0.45μm滤膜进行。
6.根据权利要求1所述的混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，其特征在于，所述桃金娘粉末经过预处理，预处理的步骤为：将采摘的桃金娘自然晾干后于50～70℃烘箱中烘干，粉碎后过40～60目筛，称取5～20g/份，在紫外灯下照射灭菌15～30min，置于超净台中备用。
7.根据权利要求1所述的混合益生菌发酵桃金娘产黄酮的方法，其特征在于，所述亚硝酸钠-硝酸铝比色法中，芦丁标准曲线的制作方法为：分别准确梯度吸取芦丁标准溶液0～60μL于96微孔板中，各微孔补加95％乙醇至60μL，加入10μL 5％NaNO2溶液，摇匀后静置5～10min，加入10％Al(NO3)3溶液10μL，摇匀后静置5～10min，加入1mol/L的NaOH溶液100μL，加95％乙醇定容，混匀后静置5～20min，在490～595nm处测量吸光值；以X轴为质量浓度(μg/mL)，y轴为吸光度值绘制标准曲线。
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