CN111280355B - 植物乳杆菌p_17及利用该菌制备发酵苹果汁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌P_17及利用该菌制备发酵苹果汁的方法。该方法以苹果汁为原料，以保藏编号为CGMCC NO.19251的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P_17进行发酵制备而成。植物乳杆菌P_17的耐酸、耐糖、耐低温能力突出，具有较强的耐胃蛋白酶和耐酸能力，可抵御人工肠液胁迫环境，有耐受胆盐能力，可耐受较高渗透压的能力。发酵的苹果汁均色泽均匀一致，组织均匀细腻，有发酵特有的香气和苹果香味。本方法制得的发酵的苹果汁比其他菌活菌数高，γ‑氨基丁酸、总酸、抗氧化值比普通苹果汁均明显提高。本方法生产工艺简单，原料丰富易得，对果蔬汁乳酸发酵饮料的工业生产意义深远。
Description
技术领域
本发明涉及果汁发酵技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌P_17，及其利用植物乳杆菌P_17制备发酵苹果汁的方法。
背景技术
苹果，属于蔷薇科苹果属植物，是种植最广、产量最多的果品，其味道酸甜适口，营养丰富。据测定，每百克苹果含果糖6.5-11.2g，葡萄糖2.5-3.5g，蔗糖1.0-5.2g。苹果不仅可以调节肠胃功能、降低胆固醇、降血压、防癌、减肥，还可以增强儿童的记忆力。苹果不但含有多种维生素、脂质、矿物质、糖类等构成大脑所必需的营养成份，而且含有利于儿童生长发育的细纤维和能增强儿童记忆力的锌。
果蔬汁发酵饮料是指以水果、蔬菜为原料，经乳酸菌发酵后调制而成的产品。将益生菌用于发酵食品的生产，可以提高食品的质量、安全性和感官品质。我国的苹果加工业起步相对较晚，苹果深加工技术研究应用相对匮乏、产品技术含量较低、品种单一，无法满足不同消费层次和消费群体的需求。目前对苹果进行发酵的研究相对较少。苹果汁发酵过程主要存在的问题为获得产品酸度偏高或者由于苹果汁本身含有的可直接利用碳源和氮源较少，需要用特定的微生物才能发酵。另外，苹果本身含有抗氧化物质，但是利用特定的乳酸杆菌对苹果汁进行发酵来提高其抗氧化性的技术并没有有效实施及报道过。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌P_17，以及利用植物乳杆菌P_17发酵苹果汁的方法，利用该方法制得的发酵苹果汁中抗氧化物质大大提升，具有独特口感和风味。
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P_17，其保藏编号为CGMCCNO.19251。
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P_17，用于发酵苹果汁，且提高苹果汁中抗氧化物质的含量。
本发明的发酵苹果汁，以苹果汁为原料，利用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P_17发酵制备而成。
本发明发酵苹果汁的制备方法，按照如下步骤进行：
S1.制备苹果汁：
1)将苹果洗净、去皮、去核后放入榨汁机搅打1-2min，过滤后得滤液；
2)在滤液中加入3-5％质量分数的白砂糖、1-3％质量分数的脱脂乳粉、0.1-0.2％质量分数的复配乳化剂、0.1％质量分数的黄原胶、0.2％质量分数的CMC-Na、0.15％质量分数的瓜尔豆胶，过胶体磨8-10min，45Mpa下均质4-6min；
3)在85℃下灭菌10min，得混合后的苹果汁；
S2.培养植物乳杆菌P_17：
1)将液体MRS培养基200mL于500mL的锥形瓶中，115℃、20min灭菌，得植物乳杆菌P_17的培养基；
2)待培养基温度为30-40℃时，用接种针挑取植物乳杆菌P_17接种，混匀，37℃下培养；
3)培养16-18h，当培养基变得浑浊时，得到植物乳杆菌P_17；
S3.发酵：向混合后的苹果汁中接入苹果汁质量2-5％的植物乳杆菌P_17，培养温度为37℃，发酵22-26h，即得发酵苹果汁。
优选地，所述步骤S1中复配乳化剂为单甘酯和蔗糖酯，质量比为6:4。
优选地，所述步骤S1在滤液中加入4％质量分数的白砂糖、2％质量分数的脱脂乳粉、0.1％质量分数的复配乳化剂。
优选地，所述步骤S3中接入苹果汁质量3％的植物乳杆菌P_17。
优选地，所述步骤S3中发酵24h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：植物乳杆菌P_17的耐酸、耐糖、耐低温能力突出，具有较强的耐胃蛋白酶和耐酸能力，可抵御人工肠液胁迫环境，有一定耐受胆盐能力，可耐受较高渗透压的能力。发酵的苹果汁均色泽均匀一致，组织均匀细腻，有发酵特有的香气和苹果香味。本发明制得的发酵的苹果汁比其他菌活菌数高，γ-氨基丁酸、总酸、抗氧化值比普通苹果汁均明显提高。本发明发酵苹果汁的生产方式简单，原料来源丰富易得、经济实惠，具有较高的商业效益，开创了发酵饮品的新种类，满足了当前消费者对于营养健康的需求，具有广阔的开发及应用前景。
本发明的菌种保藏日期为2019年12月27日，保藏编号为CGMCC NO.19251。保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
附图说明
图1为四株高耐受性菌株在苹果汁中培养24h后的pH值图。
图2为四株高耐受性菌株在苹果汁中培养24h后的活菌数图。
图3为四株高耐受性菌株发酵苹果汁的感官品评图。
图4为菌株P_17的菌落形态和菌体形态(放大100倍)图。
图5为菌株P_17的16S rDNA PCR扩增产物凝胶电泳分析图。
图6为菌株P_17基于16S rDNA序列同源性构建的系统发育树图。
图7为温度对植物乳杆菌P_17生长的影响图。
图8为pH值对植物乳杆菌P_17生长的影响图。
图9为植物乳杆菌P_17的生长曲线图。
图10为各稳定剂不同添加量对苹果汁悬浮稳定性的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1筛选优良的乳酸菌
(1)分离乳酸菌
选取后发酵时期酒样，采用直接平板分离法进行菌株分离。对满足革兰氏染色阳性、接触酶试验阴性和脱脂乳凝乳试验的菌株，进行划线纯化。
(2)分离菌株耐受性比较
以活菌数为指标，以多数酒厂用菌Lac450为对照菌株，考察从葡萄酒后发酵时期分离的菌株对pH值、渗透压和温度的耐受能力，从而筛选出综合耐受能力较强的菌株。
分离菌株经活化后，以107CFU/mL分别接种于不同pH值(4.0，3.5，3.0)、不同糖浓度(20，40，60％)的MRS液体培养基中30℃培养24h后测定各处理活菌数，同时做耐受4℃和-20℃试验。
分离菌株对pH值的耐受性试验结果见表1。
表1分离菌株对pH值的耐受性
注：以(A)b形式表示乳酸菌株对各因素的耐受能力，其中：
A表示菌量增长倍数：A≥1，表示菌量呈正增长；A＜1，表示菌量呈负增长；
b表示菌量级别：“+”、“++”、“+++”、“++++”分别表示106、107、108、109CFU/mL。(下同)
由表1可知，低酸环境对乳酸菌菌体生长抑制作用明显，当培养基的pH值每降低0.5个单位，乳酸菌的菌量就下降一个数量级别。当pH值下降到3.0时，分离菌株均呈现出负增长。各菌株之间作比较，P15及P_17的耐酸能力最为突出，其次为P9及P29，在pH值为3.0的环境下仍能维持生长且与包括对照菌株Lac450在内的其他菌株有极显著差异(P<0.01)，对高酸环境耐受能力强，适用于较高酸度果蔬汁的乳酸发酵。
分离菌株对糖浓度的耐受性试验结果见表2。
表2分离菌株对糖浓度的耐受性
由表2可知，糖浓度对分离菌的生长均表现出一定程度的抑制作用，糖浓度越大，抑制作用越强。分离出的部分乳酸菌表现出对糖的耐受能力，其中P15耐糖能力最高，在60％糖浓度环境条件下仍能维持初始菌量，与其他菌株有极显著差异(P<0.01)，P_17次之，但耐糖能力仍优于对照菌株Lac450且有显著差异(P<0.05)
分离菌株对温度的耐受性试验结果见表3。
表3分离菌株对温度的耐受性
由表3可知，低温对分离菌株的生长有明显的抑制作用，P15，P_17，P29具有较高的耐受低温的能力，在4℃下的菌体增量达8倍以上，耐受低温的能力均高于其他菌株，且有显著性差异(P<0.05)，但其三者之间无显著差异(P>0.05)。
通过比较十株分离菌株对pH值、糖浓度及低温的耐受性，从中筛选出四株综合耐受能力较好的乳酸菌，分别为P9，P15，P_17和P29，它们对环境因素的耐受能力均优于对照菌Lac450或与对照菌株耐受能力相当。
(3)四株高耐受性菌株发酵性能比较
活化后的乳酸菌，以107CFU/mL接入苹果汁中，30℃恒温发酵24h，检测发酵后苹果汁的pH值及活菌数变化。
苹果汁接种不同乳酸菌发酵后pH值及活菌数比较，试验结果分别见图1和图2。由图1和图2可知，四株乳酸菌在苹果汁中30℃发酵24h后，pH值均有不同程度的下降，但无显著性差异(P>0.05)。发酵后，菌株P_17的活菌数最高，为1.97×108CFU/mL，并且活菌增加量也最大，菌株P15与P_17两者之间无显著差异(P>0.05)，与其他2株菌相比呈显著性差异(P<0.05)。
(4)四株高耐受性菌株发酵风味比较
活化后的乳酸菌，以107CFU/mL接入苹果汁中，30℃下恒温发酵24h，为使其口感最佳，先于4℃条件下冷藏12h，再进行感官品评。
苹果汁接种不同乳酸菌发酵风味比较见图3。由图3可知，经菌株P_17发酵的苹果汁感官评分最高，与其他3株乳酸菌发酵的苹果汁有极显著差异(P<0.01)。此外，四株乳酸菌发酵的苹果汁均色泽均匀一致，呈现黄色，而只有菌株P_17发酵的苹果汁组织均匀细腻，有发酵特有的香气和苹果香味。综合上述因素考虑，选取乳酸菌P_17为最终的试验菌株。
(5)优良菌株的鉴定
①菌落、菌体特征及生理生化鉴定
观察平板上菌落特征并记录，菌体形态特征在革兰氏染色后，油镜下观察。根据《乳酸菌分类鉴定及实验方法》进行过氧化氢酶试验、精氨酸产氨试验等，根据乳酸菌生化鉴定管说明书进行糖发酵试验，将结果与《伯杰细菌鉴定手册》中相应指标进行比对鉴定。
菌株P_17在MRS固体平板上菌落呈白色，表面光滑，圆形，不透明。显微镜下观察为革兰氏阳性，菌体呈杆状，单个排列，无芽孢。菌落及菌体形态见图4。
优良菌株P_17的生理生化试验结果见表4。
表4菌株P_17的生理生化试验结果
参考《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》和《伯杰细菌鉴定手册》，结合表4中的试验结果，初步判断菌株P_17属于乳杆菌属(Lactobacillus)。
②16S rDNA分子鉴定
采用细菌DNA提取试剂盒提取乳酸菌DNA，并对其进行PCR扩增试验。PCR扩增体系和反应程序分别见表5和表6。
表5 PCR扩增体系
表6 PCR反应程序
PCR产物检测及回收纯化：取PCR产物25μL，采用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，以5000bp的DNA Marker为对照，电泳条件为温度80℃，电压120V，时间30min，检测是否有特异性条带。采用胶回收试剂盒对PCR产物回收纯化，将纯化产物送华大测序。
菌株P_17DNA的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳后观察条带，结果见图5。由图5可知，菌株P_17的扩增产物条带在1000bp～2000bp之间，约为1500bp。
将所获得的菌株P_17序列经Blast比对分析发现，其与植物乳杆菌在16S rDNA序列上相似度达99％。综合生理生化鉴定结果与分子生物学鉴定结果，最终确定菌株P_17为植物乳杆菌。
将植物乳杆菌P_17的16S rDNA序列与相关属种的16S rDNA序列构建系统发育树，结果见图6。
实施例2植物乳杆菌P_17适宜生长条件及生长曲线
(1)适宜生长温度的测定
植物乳杆菌P_17在不同温度条件下培养24h后的活菌量变化见图7。由图7可知，低温对植物乳杆菌P_17的生长有抑制作用，17～37℃之间，随温度的升高，菌体密度迅速增加，在37℃时，其菌量达到最大值，温度继续升高，菌量出现下降趋势，试验表明，37℃是植物乳杆菌P_17的适宜生长温度。
(2)适宜生长pH值的测定
植物乳杆菌P_17在不同pH值条件下培养24h后的活菌量变化见图8。由图8可知，较低的pH值对植物乳杆菌P_17的生长具有明显的抑制作用，在3.0～6.0之间，随pH值升高菌体密度迅速增加，pH值为6.0时其菌量达到有最大值，pH值继续增大其菌量开始下降。试验表明，植物乳杆菌P_17的适宜生长pH值为6.0。
(3)生长曲线的测定
植物乳杆菌P_17在适宜生长条件下48h内的活菌量变化见图9。由图9知，0～2h菌株适应新环境生长速度较慢，2～16h菌量迅速增长，从107CFU/mL上升至109CFU/mL，16～36h菌体处于生长与代谢速率基本相等的动态平衡中，活菌数稳定。36h后菌体的死亡速率加快，菌体数呈下降趋势，但48h后活菌数仍有108CFU/mL。试验表明，植物乳杆菌P_17的适宜收获期为在适宜生长条件下培养16～18h。
实施例3植物乳杆菌P_17体外模拟人工胃肠道消化研究
(1)对人工胃液的耐受性研究
益生菌必须要通过恶劣的胃部环境到达肠道才能发挥作用。食物在人体胃液环境停留1～3h，人体胃液的pH值平均在3.0左右。因此益生菌要有耐胃液的能力，才能在人体内发挥其功能。乳酸菌在pH值3.0的人工胃液中作用3h后，活菌数变化及存活率见表7。
表7乳酸菌对人工胃液的耐受性试验结果
由表7可知，植物乳杆菌P_17在pH值为3.0的人工胃液中作用3h后，活菌数为(1.61±0.35)×108CFU/mL，菌株存活率在90％以上，与菌株LGG的存活率间无显著性差异(P>0.05)，证明植物乳杆菌P_17具有较强的耐胃蛋白酶和耐酸能力。
(2)对人工肠液的耐受性研究
乳酸菌经胃液消化后会进到肠道中，食物在肠液里通常停留1～4h。人体肠液内pH值大小约8.0，属于碱性，其中胰蛋白酶会影响肠道中的益生菌存活率。因此益生菌须要耐受各种恶劣环境并且以较高活菌数到达小肠才能发挥作用。乳酸菌在人工肠液作用不同时间后，测得的菌株存活率见表8。
表8乳酸菌对人工肠液的耐受性试验结果
由表8可知，植物乳杆菌P_17在人工肠液中作用4h后存活率仍在60％以上，作用8h后存活率有所下降，但仍保持较高水平。在人工肠液作用过程中，菌株LGG的存活率均高于植物乳杆菌P_17，但无显著性差异(P>0.05)，证明植物乳杆菌P_17可抵御人工肠液胁迫环境。
(3)对胆盐的耐受性研究
对胆盐的耐受性是益生菌必备的生理特征，人体小肠中的胆盐浓度为0.03～0.3g/100mL，食物消化时间约为1～4h[82]。乳酸菌对胆盐耐受性试验结果见表9。
表9乳酸菌对胆盐耐受性试验结果
注：“-”表示菌株活菌数<106CFU/mL。
从表9可知，胆盐对乳酸菌活菌数影响明显，未加胆盐时活菌数可达109CFU/mL；胆盐浓度达0.3％时，植物乳杆菌P_17仍可维持初始菌量，而菌株LGG的活菌浓度降到106CFU/mL以下，说明高胆盐胁迫环境对菌体有一定的损伤。一般而言，益生菌在肠道内的菌浓度要达到106～109CFU/mL才能发挥功效，植物乳杆菌P_17菌浓度可以达到该要求。
(4)对氯化钠的耐受性研究
微生物在等渗溶液中能够正常生长代谢，高渗和低渗溶液均不利于菌体生长。因此，益生菌的耐高渗胁迫能力也是评价菌种优良的一个重要指标。人体胃肠道中的盐浓度一般维持在1.0～4.0％的范围内。乳酸菌对氯化钠耐受性试验结果见表10。
表10乳酸菌对氯化钠耐受性试验结果
由表10可知，不含盐的对照组，菌株活菌数均达到了109CFU/mL，之后随渗透压升高，活菌数下降，在盐浓度为8％的环境中培养24h后，活菌数仍高于108CFU/mL。综上可知，植物乳杆菌P_17具备耐受较高渗透压的能力。实施例4植物乳杆菌P_17的降酸稳定性研究
植物乳杆菌P_17各代菌株的降酸结果见表11。
表11植物乳杆菌P_17的降酸遗传稳定性
由表11可知，在连续培养10代的情况下，植物乳杆菌P_17对苹果酸的降解能力基本保持不变(P>0.05)，具有较好的降酸稳定性。
实施例5发酵苹果汁的调配
(1)蔗糖添加量的确定
蔗糖的加入可以赋予发酵苹果汁产品甜味，使该产品酸甜可口，满足大众的口感。植物乳杆菌P_17活化后，按3％分别接入蔗糖添加量为0，2，4，6，8％这5种苹果汁发酵基质中，37℃恒温发酵24h，通过测定其pH值、滴定酸度以及活菌数的变化等指标并进行感官品评确定适宜蔗糖添加量，试验结果见表12，感官评价见表13。
表12不同蔗糖添加量对发酵苹果汁的影响
表13发酵苹果汁的感官评价表
由表12以及表13可知，植物乳杆菌P_17发酵不同蔗糖添加量的苹果汁，其pH值、滴定酸度以及活菌数均存在极显著差异(P<0.01)，在蔗糖添加量为4％时pH值为3.68，活菌数为2.75×108CFU/mL，滴定酸度达到最高值为9.45g/L，酸甜可口，感官评价最好。蔗糖添加量在8％时活菌数最高达2.80×108CFU/mL，与蔗糖添加量4％时无显著性差异(P>0.01)但生产成本增加。综合上述因素考虑，选取蔗糖添加量为4％来进行后续试验。
(2)脱脂乳粉添加量的确定
脱脂乳粉的加入不仅可以改善发酵苹果汁产品的口感与营养价值，还可以为微生物提供营养物质。植物乳杆菌P_17活化后，按3％分别接入脱脂乳粉添加量为0，1，2，3，4％这5种苹果汁发酵基质中，37℃恒温发酵24h，通过测定其pH值、滴定酸度以及活菌数的变化等指标并进行感官品评来确定适宜脱脂乳粉添加量，试验结果见表14感官评价见表15。
表14不同脱脂乳添加量对发酵苹果汁的影响
表15发酵苹果汁的感官评价表
由表14及表15可知，植物乳杆菌P_17发酵不同脱脂乳粉添加量的苹果汁，其pH值、滴定酸度以及活菌数均存在极显著差异(P<0.01)，随着脱脂乳粉添加量的增加，发酵苹果汁的pH值、滴定酸度及活菌数均呈现上升趋势。pH值上升可能是由于脱脂乳粉加入引起的pH值升高值大于乳酸菌发酵引起的降低值。脱脂乳粉添加量在2％时活菌数达到最高值，为3.30×108CFU/mL，其pH值为3,74，与脱脂乳粉添加量0％时的pH值3.72之间有显著性差异(P<0.01)，但添加2％脱脂乳粉的感官评价高于未添加脱脂乳粉的感官评价。脱脂乳粉添加量在4％时，滴定酸度达到最大值为10.41g/L，但发酵产品已失去苹果汁的颜色且口感过酸。综合上述因素考虑，选取脱脂乳粉添加量2％进行后续试验。
(3)乳化剂与稳定剂添加量及复配比的确定
为提高苹果汁发酵基质的稳定性，通过添加乳化剂以及稳定剂来改善其稳定性。乳化剂能起到防止脂肪层上浮以及改善风味、口感的作用。稳定剂可以使其组织状态更加均一稳定，也可以改善其风味、口感以及延长产品货架期。
①乳化剂复配比例的确定
不同复配比的乳化剂对苹果汁发酵基质稳定性的影响，试验结果见表16。
表16单甘酯与蔗糖酯不同配比对苹果汁稳定性的影响
由表16可知，单甘酯:蔗糖酯＝6:4时，苹果汁发酵基质的稳定性最高为94.98％，与其他复配比间存在极显著差异(P<0.01)。因此，将单甘酯与蔗糖酯的复配比确定为6:4，添加量0.1％进行后续试验。
②稳定剂添加量的确定
称取不同质量的黄原胶，与4％蔗糖混匀，加入30mL已经制备好的苹果汁发酵基质中，充分混匀后，分别移入50mL离心管中，85℃灭菌10min后冷却至室温，静置观察并测定其悬浮稳定性。对其余4种稳定剂的操作同黄原胶，试验结果见图10。
从图10中可以看出，β-环状糊精和PGA对苹果汁发酵基质的悬浮稳定性影响较小，因此选取黄原胶、CMC-Na、瓜尔豆胶进行后续试验。
在单因素试验的基础上，选取L9(34)正交设计表，以黄原胶、CMC-Na和瓜尔豆胶的添加量为试验因素，悬浮稳定性为评价指标，确定各稳定剂的适宜添加量。正交试验因素水平及试验结果分别见表17及表18。
表17稳定剂正交试验设计因素水平表
表18稳定剂正交试验设计及实验结果
由表18可知，各稳定剂对苹果汁悬浮稳定性影响的主次顺序为：A>B>C。各稳定剂适宜添加量分别为黄原胶0.10％，CMC-Na 0.20％，瓜尔豆胶0.15％。在适宜添加量下进行验证试验，得到苹果汁发酵基质的悬浮稳定性为91.37％，高于任何一个试验组的结果。
实施例6制备发酵苹果汁
以苹果汁为原料，利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P_17发酵制备。制备方法按照如下步骤进行：
S1.制备苹果汁：
1)挑选新鲜苹果，将苹果洗净、去皮、去核后放入榨汁机搅打1min，过滤后得滤液；
2)在滤液中加入4％质量分数的白砂糖、2％质量分数的脱脂乳粉、0.1％质量分数的复配乳化剂(复配比为单甘脂:蔗糖酯＝6:4)、0.1％质量分数的黄原胶、0.2％质量分数的CMC-Na、0.15％质量分数的瓜尔豆胶，过胶体磨10min，45Mpa下均质5min；
3)在85℃下灭菌10min，得混合后的苹果汁；
S2.培养植物乳杆菌P_17：
1)将液体MRS培养基200mL于500mL的锥形瓶中，115℃、20min灭菌，得植物乳杆菌P_17的培养基；
2)；待培养基温度为35℃时，用接种针挑取植物乳杆菌P_17接种，混匀，37℃下培养；
3)培养17h，当培养基变得浑浊时，得到植物乳杆菌P_17；
S3.发酵：向混合后的苹果汁中接入苹果汁质量3％的植物乳杆菌P_17，培养温度为37℃，发酵24h，即得发酵苹果汁。
实施例7本发明发酵苹果汁与普通苹果汁的比较
(1)感官评定
本发明的发酵苹果汁与普通苹果汁的感官评定的对照表如表19所示，
表19本发明的发酵苹果汁与普通苹果汁的感官评定
| 类别 | 口感 | 色泽 |
| 本发明发酵苹果汁 | 清香爽口 | 淡黄色 |
| 普通苹果汁 | 淡淡的清香，甜腻 | 黄色 |
从表19可以看出，从本发明的发酵苹果汁与普通苹果汁的感官评定结果看，本发明的发酵苹果汁的口感及色泽均好于普通苹果汁。
(2)各指标检测
①清除DPPH自由基能力的测定
取1.0mL样品加入到1.0mL 0.2mmol/L乙醇DPPH自由基溶液中，将反应溶液摇匀后，置于室温下遮光反应30min，在6000r/min离心10分钟后，取上清液在517nm处测量溶液的吸光度。对照组为等体积的蒸馏水代替样品溶液。空白组包括等量的乙醇代替DPPH自由基溶液。清除率按如下公式计算：
清除率％＝(1－(A样品－A空白)/A对照)×100
②总酸含量测定
取20.00-50.00mL试液，使之含0.035-0.070g酸，置于150mL烧杯中，加40-60mL水。将酸度计电源接通，待指针稳定后，用pH 8.0的缓冲溶液校正酸度计。将盛有试液的烧杯放到电磁搅拌器上。再将玻璃电极及甘汞电极浸入试液的适当位置。按下PH读数开关，开动搅拌器，迅速用0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液(如样品酸度太低，可用0.01mol/L或0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液)滴定，并随时观察溶液pH的变化。接近终点时，应放慢滴定速度。一次滴加半滴(最多一滴)，直至溶液的pH达到指定终点。记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。
③γ-氨基丁酸含量测定
准确称取1.0000g左右粉碎试样,置于100m L容量瓶中,加入0.02mol/L的盐酸溶液定容至刻度线,于240W超声20min。取上清液10m L于离心管中,10000r/m离心10min，过0.45μm水系滤膜备用。采用离子交换色谱-茚三酮柱后衍生法用氨基酸自动分析仪测定样品中γ-氨基丁酸。色谱条件:LCA K06钠离子型色谱柱(4.6mm×150.0mm,7μm)；反应柱温度:58.0℃,反应器温度:130℃,检测波长570nm和440nm,洗脱泵流速0.45m L/min,衍生泵流速0.25m L/min,自动进样50μL。梯度洗脱程序为:0～1min,30％A，70％B；1～9min,100％B；9～12min,100％D；12～14min,100％A,每次完成检测后平衡色谱柱10min。A、B分别为不同浓度及p H值的钠离子洗脱液,D为2％的Na OH再生液。
发酵苹果汁与普通苹果汁DPPH自由基清除能力、总酸含量、γ-氨基丁酸含量的结果如表20所示。
表20本发明发酵苹果汁与普通苹果汁的各指标比较
DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若提取物能将其清除，则提示提取物具有降低羟自由基、烷自由基或氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH自由基相对于其他方法，被广泛地运用于评价短时间内的抗氧化活性。由表20可以看出，测定的数值远远大于普通苹果汁，说明利用植物乳杆菌P_17发酵明显提高了苹果汁的抗氧化性。
γ-氨基丁酸是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物神经组织中重要的抑制性神经递质，人体对γ-氨基丁酸具有自我调节的功能，当外界摄取缺乏会产生抑郁、焦躁、疲劳和失眠的症状。γ-氨基丁酸的含量越高，说明发酵产品具有的降躁助眠作用越强。从表20中可以看出γ-氨基丁酸的含量发酵后的苹果汁明显高于未发酵的苹果汁。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P_17，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.19251。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P_17，其特征在于，其用于发酵苹果汁，并且提高苹果汁中抗氧化物质的含量。
3.一种发酵苹果汁，其特征在于，以苹果汁为原料，利用权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P_17发酵制备而成。
4.权利要求3所述发酵苹果汁的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
S1.制备苹果汁：
1)将苹果洗净、去皮、去核后放入榨汁机搅打1-2min，过滤后得滤液；
2)在滤液中加入3-5％质量分数的白砂糖、1-3％质量分数的脱脂乳粉、0.1-0.2％质量分数的复配乳化剂、0.1％质量分数的黄原胶、0.2％质量分数的CMC-Na、0.15％质量分数的瓜尔豆胶，过胶体磨8-10min，45Mpa下均质4-6min；
3)在85℃下灭菌10min，得混合后的苹果汁；
S2.培养植物乳杆菌P_17：
1)将液体MRS培养基200mL于500mL的锥形瓶中，115℃、20min灭菌，得植物乳杆菌P_17的培养基；
2)待培养基温度为30-40℃时，用接种针挑取植物乳杆菌P_17接种，混匀，37℃下培养；
3)培养16-18h，当培养基变得浑浊时，得到植物乳杆菌P_17；
S3.发酵：向混合后的苹果汁中接入苹果汁质量2-5％的植物乳杆菌P_17，培养温度为37℃，发酵22-26h，即得发酵苹果汁。
5.根据权利要求4所述发酵苹果汁的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中复配乳化剂为单甘酯和蔗糖酯，质量比为6:4。
6.根据权利要求4所述发酵苹果汁的制备方法，其特征在于，所述步骤S1在滤液中加入4％质量分数的白砂糖、2％质量分数的脱脂乳粉、0.1％质量分数的复配乳化剂。
7.根据权利要求4所述发酵苹果汁的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中接入苹果汁质量3％的植物乳杆菌P_17。
8.根据权利要求4所述发酵苹果汁的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中发酵24h。
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