CN113817632A - 一种嗜热链球菌、富含gaba的助睡眠发酵乳基料、乳酸菌饮料及制备方法 - Google Patents
一种嗜热链球菌、富含gaba的助睡眠发酵乳基料、乳酸菌饮料及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及发酵食品技术领域，公开了一种嗜热链球菌、富含GABA的助睡眠发酵乳基料、乳酸菌饮料及制备方法。该发酵乳基料的原料包括直投式发酵剂和奶液；所述直投式发酵剂包括瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881。该乳酸菌饮料包括以下质量百分数的原料：20～60%所述发酵乳基料，4～10%甜味物质，0.01～0.1%稳定剂，0.05～0.5%食用香精和0.05～0.1%酸味物质，余量为水。本发明将瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881复配后，共同发酵制备发酵乳基料和乳酸菌饮料，两个菌株能发挥协同作用，相较于单菌而言具有更高的产γ‑氨基丁酸效率，能使获得的乳酸菌饮料具有较高的GABA含量和较好的助眠效果。
Description
技术领域
本发明涉及发酵食品技术领域，尤其涉及一种嗜热链球菌、富含GABA的助睡眠发酵乳基料、乳酸菌饮料及制备方法。
背景技术
随着当代社会生活节奏的加快以及压力的增加，各类形式的睡眠质量问题在人群中逐渐蔓延。WHO组织的一项全球睡眠流行病学调查研究发现，全球有27％的人有睡眠质量问题，我国也有6亿人存在失眠问题，且失眠群体逐渐年轻化。睡眠质量差是多种疾病的危险因素，与高血压、冠心病、糖尿病等有密切的关系，同时还会影响人的心理健康状况，使人疲劳、焦虑、抑郁，增加消极情感。
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)又称为氨酪酸、伽马氨基丁酸等，是一种广泛存在于动物、植物和微生物体内的非蛋白氨基酸，是哺乳动物神经系统中重要的抑制性神经递质。它参与体内多种代谢活动，具有重要的生理功能，如镇静神经，改善睡眠，美容润肤，降血压，抗癫痫，抗抑郁，延缓脑衰老机能，补充人体抑制性神经递质，促进肾机能改善，抑制脂肪肝及肥胖症等。因为其具备的优良理化特性，目前GABA被广泛应用于食品、医药等领域，一直是国内外研究的热点。但因为GABA价格昂贵，生产成本高，在一定程度上限制了其应用。目前GABA获得的方法主要包括化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。化学制备法在生产工艺中使用了一些腐蚀性较强的溶剂，反应条件剧烈，以及得率较低等原因，使其很难在食品加工生产中得以应用，所得产品也不能被认为是一种天然的食品添加剂，存在一定的安全隐患。植物富集虽然制备工艺简单，但植物富集GABA的含量较低，直接从动植物中提取无法满足生产需求，不适于规模化生产。目前微生物发酵法被认为是安全有效并且快速高效的制备方法。
微生物发酵生产GABA主要是指L-谷氨酸(L-Glu)在谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD)的催化作用下发生脱羧反应。它是利用菌株自身的酶系统来催化GABA的合成，其中GAD是调控GABA合成的主要酶。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是指能利用可发酵碳水化合物产生乳酸、无芽孢的革兰氏阳性菌的总称，被美国FDA认为是“GRAS(generally recognized as safe)”级食品添加剂，广泛地应用于食品、医药保健、农牧业以及禽畜病防治等领域得到了广泛的应用。利用乳酸菌在发酵过程中产生GABA，不仅大大缩减了成本(市售纯天然发酵型的γ-氨基丁酸，纯度98％，价格3500元/kg)，简化了工艺，更能让消费者有不一样的风味体验。
乳酸菌饮料是以乳或乳制品为原料，经乳酸菌发酵制得的乳液中加入水，以及白砂糖和(或)甜味剂、酸味剂、植物提取液等一种或几种调制而成的饮料，近年来在市场上较流行，具有良好的市场前景。然而，目前市面上和现有技术中的含γ-氨基丁酸乳酸菌饮品都是外源添加GABA(如专利CN101467556)，发酵时间长(一般3天以上)，成本高，限制了其应用。富含γ-氨基丁酸的乳酸菌饮料的开发，不仅可以丰富乳酸菌饮料的品种，还能更好地满足人们对保健食品的需求，作为一种新型的保健型乳酸菌饮品，具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种嗜热链球菌、富含GABA的助睡眠发酵乳基料、乳酸菌饮料及制备方法。本发明采用嗜热链球3881和瑞士乳杆菌3878的复合发酵制备发酵乳基料和乳酸菌饮料，两个菌株能协同提高产γ-氨基丁酸效率，缩短发酵时间，提高发酵乳基料和乳酸菌饮料中的γ-氨基丁酸含量以提高助眠效果。
本发明的具体技术方案为：
一株嗜热链球菌，所述嗜热链球菌命名为3881，已在2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No.21811，微生物分类命名为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus。
一种富含GABA的助睡眠发酵乳基料，所述助睡眠发酵乳基料的原料包括直投式发酵剂和奶液；所述直投式发酵剂包括瑞士乳杆菌和所述嗜热链球菌；所述瑞士乳杆菌命名为 3878，已在2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21812，微生物分类命名为瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus。
本发明的瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881分别分离自新疆农家自制酸奶和奶疙瘩，两种菌株均具有较好的产γ-氨基丁酸能力，在乳制品的发酵体系中具有较高的产γ-氨基丁酸效率；同时，这两种菌株还具备良好的耐酸耐胆盐特性，在pH值为2.5以及胆盐含量为 0.3％的条件下均能维持较高的存活率；此外，上述两种菌株都是被囊括于卫生部2010年颁布的《可用于食品的菌种名单》的食品级微生物，安全性高。
本发明采用瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881复合发酵制备发酵乳基料，两种菌株之间能够发挥协同作用，相较于单菌而言具有更高的产γ-氨基丁酸效率。
作为优选，所述直投式发酵剂与奶液的质量体积比为0.001～0.2g:100mL。
作为优选，所述直投式发酵剂中，瑞士乳杆菌与嗜热链球菌的质量比为1:0.1～1000。
作为优选，所述奶液包括以下质量百分数的组分：2～10％乳粉，2～6％膳食纤维，0.5～ 5％葡萄糖和0.1～0.8％谷氨酸钠，余量为水。
作为优选，所述乳粉包括全脂乳粉、脱脂乳粉和浓缩乳清蛋白粉中的一种或几种。
作为优选，所述膳食纤维包括聚葡萄糖、菊粉和抗性糊精中的一种或几种。
一种所述助睡眠发酵乳基料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将奶液的各组分混合均匀后，进行水合，得到奶液；
(2)将奶液加热进行美拉德反应后，冷却，得到冷却料液A；
(3)将直投式发酵剂接种到冷却料液A中，混合均匀后，进行发酵，得到助睡眠发酵乳基料。
作为优选，步骤(2)中的具体过程如下：将奶液加热升温至90～95℃，保温60～120min，冷却至35～45℃，得到冷却料液A。
在上述保温温度和时间下，奶液褐变效果及产品带有的美拉德风味最佳。
作为优选，步骤(3)中，所述发酵的温度为37～45℃，时间为12～24h。
进一步地，步骤(3)中，所述发酵的温度为40℃～45℃，时间为16～20h。
作为优选，步骤(3)中，发酵完成后，进行破乳均质，得到助睡眠发酵乳基料。
进一步地，步骤(3)中，所述均质在25℃～40℃下进行，并采用二级均质的方法，先以3～8MPa的压力均质，优选为5MPa，再以15～30MPa的压力均质，优选为20～25MPa。
一种富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料，包括以下质量百分数的原料：20～60％所述助睡眠发酵乳基料，4～10％甜味物质，0.01～0.1％稳定剂，0.05～0.5％食用香精和0.05～0.1％酸味物质，余量为水。
作为优选，所述助睡眠发酵乳基料的质量百分数为30％～50％。
作为优选，所述甜味物质包括白砂糖、木糖醇、安赛蜜、三氯蔗糖和阿斯巴甜的一种或几种。
作为优选，所述稳定剂包括果胶、黄原胶、瓜尔胶、结冷胶和明胶中的一种或几种。
作为优选，所述食用香精包括食用香水柠檬味香精、食用柚子味香精和食用橙味香精中的一种或几种。
一种所述助睡眠乳酸菌饮料的制备方法，包括以下步骤：
(I)将稳定剂加入水中，混合均匀后，冷却，制得胶液；
(II)将甜味物质溶于水中，杀菌后，冷却，制得甜味物质溶液；
(III)将助睡眠发酵乳基料、胶液、甜味物质溶液和食用香精混合后，加入酸味物质进行调酸，混合均匀后，加水定容，均质后，制得料液；
(IV)对料液进行杀菌后，制得富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料。
本发明的助睡眠乳酸菌饮料以经直投式发酵剂发酵获得的发酵乳基料为原料，具有较高的GABA含量，能发挥较好的助睡眠作用。此外，按本发明的方法制得的助睡眠乳酸菌饮料酸甜可口，口感爽滑，且为非活菌型乳酸菌饮品，常温贮存即可。
作为优选，步骤(III)中，加入酸味物质调酸至酸度为30～40°T，优选为33～36°T。
作为优选，步骤(III)中，所述均质的压力为190～210bar，优选为200bar。
作为优选，步骤(I)中，所述水的温度为50～55℃。
作为优选，步骤(II)中，所述水的温度为65～70℃。
作为优选，步骤(II)中，所述杀菌的温度为90～95℃，时间5～10min。
作为优选，步骤(IV)中，所述杀菌的具体过程如下：将料液灌装至高密度聚乙烯(HDPE)材质包装容器中并封口，通过巴氏杀菌或超高温灭菌技术(UHT)杀菌并冷却；或者，将料液经UHT杀菌后，热灌装或无菌冷灌装至PET材质包装容器中并封口。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明采用瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881复合发酵制备发酵乳基料和乳酸菌饮料，两个菌株均具有较高的产γ-氨基丁酸能力，将两者复配后，能发挥协同作用，进一步提高产γ-氨基丁酸效率，因而能缩短发酵时间，提高发酵乳基料和乳酸菌饮料的助睡眠效果；
(2)瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881均为是被囊括于卫生部2010年颁布的《可用于食品的菌种名单》的食品级微生物，安全性高，且具有优良的耐酸耐胆盐性能，可作为商业发酵剂使用；
(3)本发明的助睡眠乳酸菌饮料口感爽滑，酸甜适中，无分层，无沉淀，无异味，具有乳酸菌饮料特有的滋味和气味，并富含功能物质GABA，具有较高的助睡眠效果。
附图说明
图1为本发明瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881的电子显微镜照片；其中，图(A)为瑞士乳杆菌3878的电子显微镜照片，图(B)为嗜热链球菌3881的电子显微镜照片；
图2为本发明对产GABA菌株进行初筛的薄层层析图；其中，泳道1、2、3、4、5分别为5个菌株；
图3为本发明实施例6发酵基料产酸曲线图；
图4为本发明实施例6所得乳酸菌饮料的γ-氨基丁酸高效液相色谱图；
图5为本发明实施例6、对比例1和对比例2发酵过程中GABA含量的变化曲线；
图6为本发明实施例6所得乳酸菌饮料对人体睡眠质量的改善效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：高产γ-氨基丁酸菌株的筛选与鉴定
1高产γ-氨基丁酸菌株的筛选
(1)培养基的配制
MRS液体培养基：葡萄糖20g，酵母膏5g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，七水硫酸镁0.58g，一水硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水1000mL，115℃灭菌20min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基基础上添加15g/L琼脂。
MRS发酵培养基：在MRS液体培养基基础上添加10g/L的诱导物(谷氨酸钠)。
(2)乳酸菌的筛选
取新疆采样的酸奶和奶疙瘩等奶制品1mL加入装有9mL的无菌生理盐水中，制成10-1浓度的样品液，震荡混匀后逐级稀释到适宜浓度，静置备用。取上述各稀释度的菌液100μL涂布于MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养48h后，挑取平板上生长良好的单个菌株于MRS固体平板上反复三区划线，直至整个平板上的菌落形态一致，单菌落接种到MRS液体培养基于37℃培养24h，选取革兰氏染色阳性、接触酶试验阴性的菌株在含有50％甘油的 MRS液体培养基中于～80℃冷冻保存。
将上述步骤得到菌株按1％接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，37℃培养24h进行活化，活化后的菌株接种于含10mL全脂牛乳培养基试管中，37℃静置培养至牛乳凝固，按1％接种量接种于含100mL全脂牛乳三角瓶中，37℃静置培养至牛乳凝固，进行感官评价，包括口感，气味和滋味，组织状态等。从中挑选凝乳快、质地粘稠并且风味优良的菌株，所得菌株在含有50％甘油的MRS液体培养基中于～80℃冷冻保存。
(3)产γ-氨基丁酸菌株的初筛
上述菌株经两次MRS液体培养基37℃培养24h后，接种到含10g/L谷氨酸钠的MRS发酵培养基中，37℃静置培养24h，4 000r/min离心10min，上清液4℃保存备用。
菌株初筛采用薄层层析法进行定性分析，判断所筛选的菌株是否为产γ-氨基丁酸的菌株。展开相采用95％乙醇:25％氨水(3:1)，内含0.4wt％的显色剂茚三酮，以GABA标准品做参比，待测样品(上述上清液)点样5μL。采用新华一号层析纸展开结束后于85℃烘干显色10min，将显色结果与标样比较。采用95％乙醇:25％氨水(3:1)的展开相可成功将GABA和谷氨酸分离，从而得到可产GABA菌株。显色结果如图2所示。
(4)产γ-氨基丁酸菌株的复筛
菌株复筛采用高效液相色谱法(邻苯二甲醛衍生法)进行定量分析。GABA与衍生剂邻苯二甲醛能够反应生成具有较强紫外活性化合物，该衍生物可以溶于流动相溶液中，C18反向高效液相色谱柱能够对其实现有效分离，同时采用紫外检测器检测，根据保留时间对其定性分析，利用峰面积和标准曲线法对其间接定量。具体步骤如下：
1)试剂配制
①0.4mol/L硼酸缓冲液(pH＝10)：取1.2366g硼酸，用NaOH碱液调节溶液pH 10，用水定容至50.00mL容量瓶中。
②0.1mol/L NaHCO3(pH＝9.5)溶液：取8.4g NaHCO3，用水定容至1000mL容量瓶中，并用NaOH碱液调节溶液pH9.5。
③邻苯二甲醛衍生试剂：取20mg邻苯二甲醛溶解于0.5mL甲醇中，加入9.0mL硼酸缓冲液，超声溶解，再加0.5mLβ-巯基乙醇，过0.22um滤膜，4℃避光放置。
④0.1mol/L醋酸钾溶液(pH＝5.9)：取9.814g醋酸钾，用醋酸调节溶液pH 5.9，用水定容至1000mL容量瓶中。
2)样品衍生衍生条件：处理好的上清液500uL，加入衍生溶液100uL，记录下加入时的时间，将溶液摇匀，衍生反应计时2min时准时进样。标品衍生条件一致。
标准曲线的配置：将γ-氨基丁酸标准品用双蒸水分别配置成浓度为50mg/L、100mg/L、 200mg/L、400mg/L、600mg/L、1000mg/L的6种标准工作液，分别衍生进样后，以γ-氨基丁酸的色谱峰面积为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。
3)常规液相色谱条件色谱条件：色谱柱：安捷伦MMSBC-18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：醋酸钾缓冲盐缓冲液(0.1mol/mL，PH＝5.90)∶甲醇；流速：0.96mL/min；柱温：35℃；检测波长：340 nm；进样量：20μL。
流动相梯度洗脱浓度如表1所示。
表1
经过产γ-氨基丁酸菌株的筛选，最终得到两株高产GABA的菌株，编号为3878和3881，并且两株菌协同发酵产GABA效果较单菌有显著提高：在含有10g/L谷氨酸钠的MRS发酵培养基37℃培养24h，菌株3878和3881单独发酵分别可产生115mg/L和465mg/L GABA，两者协同发酵可产生3000mg/L GABA。
2高产γ-氨基丁酸菌株的鉴定
(1)形态学鉴定
将菌株在MRS琼脂培养基培养48h后，观察记录菌株在平板上的单菌落特征。经过革兰氏染色后用显微镜观察细胞形态，3878菌株和3881菌落的电子显微镜照片分别如图1(A)和图1(B)所示。
3878菌株在MRS琼脂培养基中生长形态为浅白色菌落，微透明、圆形、表面粗糙、边缘不整齐。革兰氏染色阳性，显微镜下观察细胞呈长杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动。
3881菌落为圆形，边缘整齐，略突起，正反面颜色一致，中央与边缘颜色一致。革兰氏染色呈阳性，不生芽，球形，成对或成链状。
(2)16S rDNA序列分析
①细菌基因组DNA的提取
吸取100μL 3878菌株和3881菌株菌悬液于灭菌后的M17液体培养基中，于40℃培养24h。按细菌基因组DNA抽提试剂盒操作步骤提取菌株基因组DNA。
②PCR扩增
PCR引物为：
上游引物8F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’
下游引物1492R：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反应条件为：95℃预热3min，95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，循环30次，72℃保持5min，4℃保温。
③琼脂糖凝胶电泳
用移液枪先吸取2μL loading buffer，再吸取5μL PCR扩增产物，反复抽吸混匀，混合液加到样品槽中。待测样品加样完毕后，在电泳槽一端加入5μL DNA marker。在120V恒电压、80 A恒电流下进行电泳，当loading buffer指示剂移动到凝胶底部时，取出凝胶用凝胶成像仪在 UV下成像，扩增片段长度为1.5kb左右。
④16S rDNA测序及序列比对
阳性PCR产物送样至金唯智生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI数据库中应用BLAST 工具与GenBank数据库已有序列进行比对分析，分析待测菌株与已知菌株相应序列的同源性，确定筛选出来的产糖菌株种属。
根据其生理生化特性及16S rRNA序列分析的结果，确定筛选的乳酸菌3878为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，乳酸菌3881为嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。
实施例2：菌株耐酸耐胆盐能力
菌株耐酸能力
3878和3881菌株经过连续两次传代后，取对数生长末期菌液，4000r/min离心10min，去掉上清，获得菌泥。加入与培养液相同体积pH 2.5的MRS或M17溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育1h、2h、3h后菌数的变化，设置三个平行。测得的不同时间下的活菌数见表2。
表2
耐酸性实验结果显示：pH2.5在2h对两株菌的存活性没有显著的影响，3h时，3878菌株的活菌数降低0.7个数量级，3881菌株的活菌数降低0.81个数量级。正常人体胃液的pH值在 1.5～4.5之间波动变化，菌株可在pH值为2.5的条件维持较高的存活率，表明3878菌株和 3881两菌株均具有优良的耐酸性。
菌株耐胆盐能力
3878和3881菌株经过连续两次传代后，取对数生长末期菌液，4000r/min离心10min，去掉上清，获得菌泥。加入与培养液相同体积的含0.3％胆盐的MRS或M17溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育4h、8h后菌数的变化，设置三个平行。测得的不同时间下的活菌数见表3。
表3
耐胆盐性实验结果显示：菌株在胆盐含量为0.3％的条件下仍然能够维持一定水平的存活率，间接说明3878菌株和3881两菌株具有较高的胆盐耐受能力。
实施例3：直投式发酵剂的制备
1 3878和3881菌株冻干菌粉的制备
将甘油管保存的瑞士乳杆菌3878菌株按1％的接种量接种于其优化培养基中，37℃培养箱中培养24h，活化3代后，接种于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃培养15h，得到发酵液。8000r/min、4℃离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0) 漂洗菌体1次，得到3878菌株的菌泥。
将甘油管保存的嗜热链球菌3881菌株按1％的接种量接种于其优化培养基中，43℃培养箱中培养24h，活化3代后，接种于10L发酵罐中进行高密度厌氧培养，于43℃培养12h，得到发酵液。8000r/min、4℃离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗菌体1次，得到3881菌株的菌泥。
将制得的两种菌泥分别以1:5的质量比与保护剂溶液(含乳粉、蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠和甘油)充分搅拌混匀。混合液于～80℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上。放入真空冷冻干燥箱干燥20h后，得瑞士乳杆菌3878冻干菌粉和嗜热链球菌3881冻干菌粉。平板计数得瑞士乳杆菌3878冻干菌粉中活菌数为1.1×1011CFU/g，嗜热链球菌3881冻干菌粉中活菌数为1.6×1011CFU/g。
2高产GABA的直投式发酵剂的制备
将上述得到的瑞士乳杆菌3878冻干菌粉和嗜热链球菌3881冻干菌粉在洁净恒温恒湿操作间按质量比1:1进行充分混匀后进行包装，制备成高产GABA直投式菌粉发酵剂，于～20℃密封保存备用。
实施例4：直投式发酵剂的制备
本实施例与实施例3的区别仅在于，直投式发酵剂中，瑞士乳杆菌3878冻干菌粉和嗜热链球菌3881冻干菌粉的质量比为1:0.1。
实施例5：直投式发酵剂的制备
本实施例与实施例3的区别仅在于，直投式发酵剂中，瑞士乳杆菌3878冻干菌粉和嗜热链球菌3881冻干菌粉的质量比为1:1000。
实施例6：富含GABA的乳酸菌饮料的制备
一种富含GABA的助睡眠发酵乳基料，其原料包括质量体积比为0.02g:100mL的直投式发酵剂(由实施例3制得)和奶液。所述奶液包括以下质量百分数的组分：4％全脂乳粉，0.8％浓缩乳清蛋白粉，3.2％聚葡萄糖，1％葡萄糖和0.3％谷氨酸钠，余量为水。
一种上述助睡眠发酵乳基料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将水加热至50℃后，按配比加入全脂乳粉、浓缩乳清蛋白粉、聚葡萄糖、葡萄糖和谷氨酸钠，3000rpm剪切30min后，静置水合15min，得到奶液；
(2)将奶液加热升温至95℃，保温90min，冷却至43℃，得到冷却料液A；
(3)将直投式发酵剂接种到冷却料液A中，搅拌混匀后，在43℃下静置恒温发酵18h，破乳均质，所述均质的温度为30℃，采用二级均质的方法，先以5MPa的压力均质，再以20MPa 的压力均质，得到助睡眠发酵乳基料。在上述发酵过程中，pH随时间的变化如图3所示。
一种富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料，包括以下质量百分数的原料：50％睡眠发酵乳基料，5.5％白砂糖，0.01％安赛蜜，0.01％阿斯巴甜，0.02％果胶，0.08％食用香精和0.1％柠檬酸，余量为水。
一种所述助睡眠乳酸菌饮料的制备方法，包括以下步骤：
(I)将水加热至55℃后，加入果胶，所述果胶与水的质量比为0.4:100，3000rpm剪切20min 后，冷却至30℃，制得胶液；
(II)将水加热至70℃后，加入白砂糖、安赛蜜和阿斯巴甜，所述白砂糖与水的质量比为 50:100，充分溶解后，在95℃下杀菌5min，冷却至30℃，制得甜味物质溶液；
(III)将助睡眠发酵乳基料、胶液、甜味物质溶液和食用香精在30℃下混合30min后，加入柠檬酸调酸至酸度为36°T，混合均匀后，超纯水定容，以200bar的压力均质后，制得料液； (IV)将料液灌装至HDPE材质包装容器中并封口，通过UHT杀菌并冷却，制得富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料。
实施例7：富含GABA的乳酸菌饮料的制备
一种富含GABA的助睡眠发酵乳基料，其原料包括质量体积比为0.02g:100mL的直投式发酵剂(由实施例3制得)和奶液。所述奶液包括以下质量百分数的组分：2.9％脱脂乳粉，0.75％浓缩乳清蛋白粉，3.2％菊粉，1％葡萄糖和0.3％谷氨酸钠，余量为水。
一种上述助睡眠发酵乳基料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将水加热至50℃后，按配比加入脱脂乳粉、浓缩乳清蛋白粉、菊粉、葡萄糖和谷氨酸钠，中速剪切30min后，静置水合15min，得到奶液；
(2)将奶液加热升温至95℃，保温100min，冷却至43℃，得到冷却料液A；
(3)将直投式发酵剂接种到冷却料液A中，搅拌混匀后，在43℃下静置恒温发酵18h，破乳均质，所述均质的温度为30℃，采用二级均质的方法，先以5MPa的压力均质，再以20MPa 的压力均质，得到助睡眠发酵乳基料。
一种富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料，包括以下质量百分数的原料：45％睡眠发酵乳基料，6.0％白砂糖，0.005％安赛蜜，0.01％阿斯巴甜，0.025％果胶和0.1％食用香精和0.1％柠檬酸，余量为水。
一种所述助睡眠乳酸菌饮料的制备方法，包括以下步骤：
(I)将水加热至55℃后，加入果胶，所述果胶与水的质量比为0.4:100，3000rpm剪切20min 后，冷却至30℃，制得胶液；
(II)将水加热至70℃后，加入白砂糖、安赛蜜和阿斯巴甜，所述白砂糖与水的质量比为 50:100，充分溶解后，在95℃下杀菌5min，冷却至30℃，制得甜味物质溶液；
(III)将助睡眠发酵乳基料、胶液、甜味物质溶液和食用香精在30℃下混合30min后，加入柠檬酸调酸至酸度为34°T，混合均匀后，超纯水定容，以190bar的压力均质后，制得料液； (IV)将料液灌装至HDPE材质包装容器中并封口，通过UHT杀菌并冷却，制得富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料。
实施例8：富含GABA的乳酸菌饮料的制备
一种富含GABA的助睡眠发酵乳基料，其原料包括质量体积比为0.03g:100mL的直投式发酵剂(由实施例3制得)和奶液。所述奶液包括以下质量百分数的组分：6％全脂乳粉，1.2％浓缩乳清蛋白粉，4.8％聚葡萄糖，1.5％葡萄糖和0.45％谷氨酸钠，余量为水。
一种上述助睡眠发酵乳基料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将水加热至50℃后，按配比加入全脂乳粉、浓缩乳清蛋白粉、聚葡萄糖、葡萄糖和谷氨酸钠，中速剪切30min后，静置水合15min，得到奶液；
(2)将奶液加热升温至95℃，保温100min，冷却至43℃，得到冷却料液A；
(3)将直投式发酵剂接种到冷却料液A中，搅拌混匀后，在43℃下静置恒温发酵16h，破乳均质，所述均质的温度为30℃，采用二级均质的方法，先以5MPa的压力均质，再以20MPa 的压力均质，得到助睡眠发酵乳基料。
一种富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料，包括以下质量百分数的原料：35％睡眠发酵乳基料，6.5％白砂糖，0.01％安赛蜜，0.01％阿斯巴甜，0.022％果胶，0.12％食用香精和0.1％柠檬酸，余量为水。
一种所述助睡眠乳酸菌饮料的制备方法，包括以下步骤：
(I)将水加热至55℃后，加入果胶，所述果胶与水的质量比为0.3:100，3000rpm剪切20min 后，冷却至30℃，制得胶液；
(II)将水加热至70℃后，加入白砂糖、安赛蜜和阿斯巴甜，所述白砂糖与水的质量比为 55:100，充分溶解后，在95℃下杀菌5min，冷却至30℃，制得甜味物质溶液；
(III)将助睡眠发酵乳基料、胶液、甜味物质溶液和食用香精在30℃下混合30min后，加入柠檬酸调酸至酸度为36°T，混合均匀后，超纯水定容，以200bar的压力均质后，制得料液； (IV)将料液灌装至HDPE材质包装容器中并封口，通过UHT杀菌并冷却，制得富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料。
实施例9：富含GABA的乳酸菌饮料的制备
一种富含GABA的助睡眠发酵乳基料，其原料包括质量体积比为0.03g:100mL的直投式发酵剂(由实施例3制得)和奶液。所述奶液包括以下质量百分数的组分：4.35％脱脂乳粉，1.125％浓缩乳清蛋白粉，4.8％菊粉，1.5％葡萄糖和0.45％谷氨酸钠，余量为水。
一种上述助睡眠发酵乳基料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将水加热至50℃后，按配比加入脱脂乳粉、浓缩乳清蛋白粉、菊粉、葡萄糖和谷氨酸钠，中速剪切30min后，静置水合15min，得到奶液；
(2)将奶液加热升温至95℃，保温90min，冷却至43℃，得到冷却料液A；
(3)将直投式发酵剂接种到冷却料液A中，搅拌混匀后，在43℃下静置恒温发酵16h，破乳均质，所述均质的温度为30℃，采用二级均质的方法，先以5MPa的压力均质，再以20MPa 的压力均质，得到助睡眠发酵乳基料。
一种富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料，包括以下质量百分数的原料：33％睡眠发酵乳基料，7.0％白砂糖，0.01％安赛蜜，0.005％阿斯巴甜，0.028％果胶，0.15％食用香精和0.08％柠檬酸，余量为水。
一种所述助睡眠乳酸菌饮料的制备方法，包括以下步骤：
(I)将水加热至55℃后，加入果胶，所述果胶与水的质量比为0.3:100，3000rpm剪切20min 后，冷却至30℃，制得胶液；
(II)将水加热至70℃后，加入白砂糖、安赛蜜和阿斯巴甜，所述白砂糖与水的质量比为 55:100，充分溶解后，在95℃下杀菌5min，冷却至30℃，制得甜味物质溶液；
(III)将助睡眠发酵乳基料、胶液、甜味物质溶液和食用香精在30℃下混合30min后，加入柠檬酸调酸至酸度为33°T，混合均匀后，超纯水定容，以200bar的压力均质后，制得料液； (IV)将料液灌装至HDPE材质包装容器中并封口，通过UHT杀菌并冷却，制得富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料。
实施例10：富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料的制备
一种富含GABA的助睡眠发酵乳基料，其原料包括质量体积比为0.001g:100mL的直投式发酵剂(由实施例4制得)和奶液。所述奶液包括以下质量百分数的组分：1.7％脱脂乳粉，0.2％浓缩乳清蛋白粉，2％菊粉，0.5％葡萄糖和0.1％谷氨酸钠，余量为水。
一种上述助睡眠发酵乳基料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将水加热至50℃后，按配比加入脱脂乳粉、浓缩乳清蛋白粉、菊粉、葡萄糖和谷氨酸钠，中速剪切30min后，静置水合15min，得到奶液；
(2)将奶液加热升温至95℃，保温60min，冷却至45℃，得到冷却料液A；
(3)将直投式发酵剂接种到冷却料液A中，搅拌混匀后，在45℃下静置恒温发酵24h，破乳均质，所述均质的温度为25℃，采用二级均质的方法，先以8MPa的压力均质，再以30MPa 的压力均质，得到助睡眠发酵乳基料。
一种富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料，包括以下质量百分数的原料：60％睡眠发酵乳基料，9.9％白砂糖，0.05％安赛蜜，0.05％阿斯巴甜，0.1％果胶，0.5％食用香精和0.1％柠檬酸，余量为水。
一种所述助睡眠乳酸菌饮料的制备方法，包括以下步骤：
(I)将水加热至50℃后，加入果胶，所述果胶与水的质量比为0.4:100，3000rpm剪切20min 后，冷却至30℃，制得胶液；
(II)将水加热至65℃后，加入白砂糖、安赛蜜和阿斯巴甜，所述白砂糖与水的质量比为 50:100，充分溶解后，在95℃下杀菌8min，冷却至30℃，制得甜味物质溶液；
(III)将助睡眠发酵乳基料、胶液、甜味物质溶液和食用香精在30℃下混合30min后，加入柠檬酸调酸至酸度为30°T，混合均匀后，超纯水定容，以200bar的压力均质后，制得料液； (IV)将料液经UHT杀菌后，热灌装至PET材质包装容器中并封口，制得富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料。
实施例11：富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料的制备
一种富含GABA的助睡眠发酵乳基料，其原料包括质量体积比为0.2g:100mL的直投式发酵剂(由实施例5制得)和奶液。所述奶液包括以下质量百分数的组分：8％全脂乳粉，2％浓缩乳清蛋白粉，6％聚葡萄糖，5％葡萄糖和0.8％谷氨酸钠，余量为水。
一种上述助睡眠发酵乳基料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将水加热至50℃后，按配比加入全脂乳粉、浓缩乳清蛋白粉、聚葡萄糖、葡萄糖和谷氨酸钠，中速剪切30min后，静置水合15min，得到奶液；
(2)将奶液加热升温至90℃，保温120min，冷却至37℃，得到冷却料液A；
(3)将直投式发酵剂接种到冷却料液A中，搅拌混匀后，在37℃下静置恒温发酵12h，破乳均质，所述均质的温度为40℃，采用二级均质的方法，先以3MPa的压力均质，再以15MPa 的压力均质，得到助睡眠发酵乳基料。
一种富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料，包括以下质量百分数的原料：20％睡眠发酵乳基料，3.99％白砂糖，0.005％安赛蜜，0.005％阿斯巴甜，0.01％果胶，0.05％食用香精和0.08％柠檬酸，余量为水。
一种所述助睡眠乳酸菌饮料的制备方法，包括以下步骤：
(I)将水加热至55℃后，加入果胶，所述果胶与水的质量比为0.4:100，3000rpm剪切20min 后，冷却至30℃，制得胶液；
(II)将水加热至70℃后，加入白砂糖、安赛蜜和阿斯巴甜，所述白砂糖与水的质量比为 50:100，充分溶解后，在90℃下杀菌10min，冷却至30℃，制得甜味物质溶液；
(III)将助睡眠发酵乳基料、胶液、甜味物质溶液和食用香精在30℃下混合30min后，加入柠檬酸调酸至酸度为40°T，混合均匀后，超纯水定容，以210bar的压力均质后，制得料液； (IV)将料液经UHT杀菌后，无菌冷灌装至PET材质包装容器中并封口，制得富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料。
对比例1：乳酸菌饮料的制备
本对比例与实施例6的区别仅在于，在发酵乳基料中，将由实施例3制得的直投式发酵剂换成等质量的实施例5中制得的瑞士乳杆菌3878冻干菌粉。
对比例2：乳酸菌饮料的制备
本对比例与实施例6的区别仅在于，在发酵乳基料中，将由实施例3制得的直投式发酵剂换成等质量的实施例5中制得的嗜热链球菌3881冻干菌粉。
测试例1：感官测试
对实施例6～11和对比例1～2制得的乳酸菌饮料进行感官评定，需要评定的感官指标如表3 所示，满分为10分，评定结果见表4。
表3
| 项目 | 指标 |
| 色泽 | 均匀乳白色、乳黄色或者加入相应原辅料的颜色 |
| 滋味与气味 | 口感爽滑、酸甜适中，具有该饮料特有的滋味与气味、无异味 |
| 形状 | 均匀一致的乳浊液，无分层现象，允许有少量的沉淀 |
| 杂质 | 无肉眼可见杂质 |
表4
测试例2：γ-氨基丁酸含量的测定
采用高效液相色谱法，对实施例6～11和对比例1～2制得的发酵乳基料和乳酸菌饮料中的γ- 氨基丁酸含量进行测定，具体步骤如下：
(1)试剂配制：
①0.4mol/L硼酸缓冲液(pH＝10)：取1.2366g硼酸，用NaOH碱液调节溶液pH 10，用水定容至50.00mL容量瓶中。
②0.1mol/L NaHCO3(pH＝9.5)溶液：取8.4g NaHCO3，用水定容至1000mL容量瓶中，并用NaOH碱液调节溶液pH9.5。
③邻苯二甲醛衍生试剂：取20mg邻苯二甲醛溶解于0.5mL甲醇中，加入9.0mL硼酸缓冲液，超声溶解，再加0.5mLβ-巯基乙醇，过0.22μm滤膜，4℃避光放置。
④0.1mol/L醋酸钾溶液(pH＝5.9)：取9.814g醋酸钾，用醋酸调节溶液pH 5.9，用水定容至1000mL容量瓶中。
(2)样品衍生衍生条件：处理好的上清液500uL，加入衍生溶液100uL，记录下加入时的时间，将溶液摇匀，衍生反应计时2min时准时进样。标品衍生条件一致。
标准曲线的配置：将γ-氨基丁酸标准品用双蒸水分别配置成浓度为50mg/L、100mg/L、 200mg/L、400mg/L、600mg/L、1000mg/L的6种标准工作液，分别衍生进样后，以γ-氨基丁酸的色谱峰面积为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。
(3)常规液相色谱条件色谱条件：色谱柱：安捷伦MMSBC-18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：醋酸钾缓冲盐缓冲液(0.1mol/mL，PH＝5.90)∶甲醇；流速：0.96mL/min；柱温：30℃；检测波长：340 nm；进样量：20μL；流动相梯度洗脱浓度如表5所示。
表5
(4)检测结果
实施例6制得的乳酸菌饮料的γ-氨基丁酸高效液相色谱图如图4所示。各实施例和对比例的γ-氨基丁酸含量测定结果见表6。实施例6、对比例1和对比例2在制备发酵乳基料的发酵过程中，发酵不同时间时GABA的含量如图5所示。
表6
从表6和图5可知：实施例6～11最终制得的乳酸菌饮料中，GABA含量均大于1000mg/L，说明采用本发明的方法，能获得富含GABA的乳酸菌饮料。并且，相较于对比例1和对比例 2而言，实施例6制得的发酵乳基料和乳酸菌饮料中GABA含量明显较高，说明瑞士乳杆菌 3878和嗜热链球菌3881之间能发挥协同作用，提高产γ-氨基丁酸的效率。
测试例3：乳酸菌饮料对睡眠质量的改善作用
匹斯堡睡眠质量指数(PSQI)适用于一般人睡眠质量的评估。其根据人体睡眠质量、入睡时间、睡眠时间、睡眠效率、睡眠障碍、催眠药物、日间功能障碍等指标计算出一个人PSQI 总分。PSQI总分的评分等级包括：0-5分表示睡眠质量很好；6-10分表示睡眠质量还行；11-15 分表示睡眠质量一般；16-21分表示睡眠质量很差。
综合考虑感官评分以及GABA含量，采用本发明实施例6得到的乳酸菌饮料对人体进行睡眠质量的改善实验。随机抽取公司内部60名志愿者员工，每人每天摄入350mg实施例6得到的乳酸菌饮料，睡前半小时至一小时服用，为期1个月。采用匹斯堡睡眠质量指数对人体睡眠质量做衡量。
匹斯堡睡眠质量指数调查问卷结果如图6所示。由图可知，志愿者服用1周PSQI总分较服用前下降了20％，服用2周PSQI总分较服用前下降了33％，服用3周PSQI总分较服用前下降了60％，服用4周PSQI总分较服用前下降了67％。由此可以得到，服用乳酸菌饮品第二周后，人体睡眠质量有明显改善，可恢复到睡眠质量还行水平，服用一个月后可达到睡眠质量很好水平。因此，本发明制得的乳酸菌饮料具有改善人体睡眠质量的功能。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一株嗜热链球菌，其特征在于，所述嗜热链球菌命名为3881，已在2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21811，微生物分类命名为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus。
2.一种富含GABA的助睡眠发酵乳基料，其特征在于，所述助睡眠发酵乳基料的原料包括直投式发酵剂和奶液；所述直投式发酵剂包括瑞士乳杆菌和如权利要求1所述嗜热链球菌；所述瑞士乳杆菌命名为3878，已在2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21812，微生物分类命名为瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus。
3.如权利要求2所述的助睡眠发酵乳基料，其特征在于，所述直投式发酵剂与奶液的质量体积比为0.001～0.2 g:100 mL。
4.如权利要求2所述的助睡眠发酵乳基料，其特征在于，所述直投式发酵剂中，瑞士乳杆菌与嗜热链球菌的质量比为1:0.1～1000。
5.如权利要求2或3所述的助睡眠发酵乳基料，其特征在于，所述奶液包括以下质量百分数的组分：2～10%乳粉，2～6%膳食纤维，0.5～5%葡萄糖和0.1～0.8%谷氨酸钠，余量为水。
6.一种如权利要求2～5之一所述助睡眠发酵乳基料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将奶液的各组分混合均匀后，进行水合，得到奶液；
（2）将奶液加热进行美拉德反应后，冷却，得到冷却料液A；
（3）将直投式发酵剂接种到冷却料液A中，混合均匀后，进行发酵，得到助睡眠发酵乳基料。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述发酵的温度为37～45℃，时间为12～24 h。
8.一种富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料，其特征在于，包括以下质量百分数的原料：20～60%如权利要求2～5之一所述助睡眠发酵乳基料，4～10%甜味物质，0.01～0.1%稳定剂，0.05～0.5%食用香精和0.05～0.1%酸味物质，余量为水。
9.一种如权利要求8所述助睡眠乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（I）将稳定剂加入水中，混合均匀后，冷却，制得胶液；
（II）将甜味物质溶于水中，杀菌后，冷却，制得甜味物质溶液；
（III）将助睡眠发酵乳基料、胶液、甜味物质溶液和食用香精混合后，加入酸味物质进行调酸，混合均匀后，加水定容，均质后，制得料液；
（IV）对料液进行杀菌后，制得富含GABA的助睡眠乳酸菌饮料。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（III）中，加入酸味物质调酸至酸度为30～40°T。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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