CN115644423B - 一种具有免疫调节活性的益生菌发酵香菇汁 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有免疫调节活性的益生菌发酵香菇汁。所公开的益生菌发酵香菇汁是以香菇为原料，依次经酶解和发酵制得；所述酶解用酶为果胶酶和纤维素酶的复合酶；所述发酵用发酵菌为发酵乳杆菌CICC 21828。本发明中发酵乳杆菌可以显著提高香菇汁中总可溶性糖、乳酸和总酸的含量，改变香菇汁中呈味物质的组成及含量，且赋予香菇汁更高的整体接受度和感官评分；同时，通过发酵过程可以提高香菇汁及香菇多糖的免疫调节活性。本发明通过益生菌发酵获得了口感优良且兼具免疫调节活性的发酵香菇汁制品，有利于提高香菇产品附加值，促进香菇加工制品多元化发展，也为利用益生菌发酵食用菌产品开发提供了理论依据和参考，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种具有免疫调节活性的益生菌发酵香菇汁。
背景技术
香菇是我国的特色食用菌资源之一，其风味独特、滋味鲜美。以干香菇为例，其含有58-60％的碳水化合物、20-23％的蛋白质、9-10％的纤维、3-4％脂质以及4-5％的灰分。除此之外，香菇中还含有核苷酸、香菇多糖、麦角甾醇等营养物质，这些基本成分和活性物质赋予了香菇降血脂、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等功效。近年来，香菇行业发展迅猛，产量从2010年的431万吨增长到了2020年的1188万吨，2021年国内香菇产量达到1255万吨。较大种植省市主要有河南、河北、湖北、辽宁、浙江、陕西、福建、湖北、宁夏等，其中河南是国内香菇最大的供应省份，其产量占比为全国总量的30.7％。香菇作为一种药食同源的食用菌，具有较高的营养价值，其中香菇多糖是香菇中所含有的最主要的活性物质之一，且已被证实具有多种生物活性。尽管如此，目前对于香菇产业的开发仍处于初级阶段，已开发的香菇类产品主要有香菇饮料、香菇酸奶、香菇脆片等，高附加值的产品开发较少。因此，需要加大研发力度，开发香菇类的精深加工产品，提升产品附加值，延长香菇产业链。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了一种具有免疫调节活性的益生菌发酵香菇汁。
为此，本发明所提供的益生菌发酵香菇汁是以香菇为原料，依次经酶解和发酵制得；所述酶解用酶为果胶酶和纤维素酶的复合酶；所述发酵用发酵菌为发酵乳杆菌CICC21828。
进一步，对所得发酵液进行糖度和酸度调整。
进一步，所述酶解包括：将干香菇粉碎成粉末后加水制成香菇粉溶液，接着对香菇粉溶液进行pH值调整后加入复合酶进行酶解。
优选的，所述干香菇是将鲜香菇于50-70℃烘干至恒重。
优选的，所述香菇粉过60-80目筛。
可选的，调整后的pH值为5.0-6.0。
可选的，所述复合酶配比为果胶酶与纤维素酶的质量比为2:1。
本发明提供一种具有免疫调节活性的益生菌发酵香菇汁，采用发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum(CICC-21828)发酵香菇酶解液，提高香菇汁中总可溶性糖、乳酸和总酸的含量，改变香菇汁中呈味物质的组成及含量，且赋予香菇汁更高的整体接受度和感官评分；同时，通过发酵过程可以提高香菇汁及香菇多糖的免疫调节活性。
附图说明
图1为本发明实施例1不同待测菌株的黏附能力；
图2为本发明实施例1不同待测菌株的发酵性能；
图3为本发明实施例未发酵香菇汁和发酵香菇中各类挥发性物质的相对含量；图中结果表示为均值±标准差(n＝3)，同一指标中不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)；
图4为本发明实施例未发酵香菇汁和发酵香菇汁样品的感官评分雷达图；
图5为本发明实施例不同香菇汁对小鼠脾脏中细胞因子水平的影响；a:IL-2含量；b:IL-6含量；图中数据均表示为平均值±标准差(n＝6)。与正常组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与模型组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。
图6为本发明实施例不同香菇汁对血清中免疫球蛋白含量的影响；a:IgG含量；b:IgM含量；图中数据均表示为平均值±标准差(n＝6)。与正常组相比，*表示P<0.05，
**表示P<0.01；与模型组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01；
图7为本发明实施例小鼠的小肠组织学观察；(a)：正常对照组；(b)：模型组；(c)：阳性对照组；(d)：NFL组；(e)：FL1组；(f)：FL组；
图8为本发明实施例不同香菇汁对小肠绒毛长度(a)和肠壁厚度(b)的影响；数据均表示为平均值±标准差(n＝6)。与正常组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与模型组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。
图9为本发明实施例各组小鼠门水平菌群组成；
图10为本发明实施例各组小鼠科水平菌群组成；
图11为本发明实施例益生菌发酵香菇汁成品。
具体实施方式
除非有特殊说明，本文中的科学与技术术语根据相关领域普通技术人员的认识理解。
本发明以香菇为基础原料，制备获得香菇酶解液，并以筛选获得的益生菌菌株为核心对其进行发酵，得到既含有香菇营养成分和风味，又兼具乳酸菌发酵特点的发酵产品，以期实现香菇产品深加工并赋予其更多的营养和功能特性。
本发明所述酶解是以香菇为原料，经果胶酶和纤维素的复合酶酶解所得。具体方案中为提高酶解效率、缩短酶解时间，可将干香菇粉粹后制成香菇粉水溶液，再用复合酶酶解。更优选的是对香菇粉的粒度进行控制。还有些具体方案中，酶解中所用复合酶的配比、复合酶的添加量、PH值、酶解温度及时长可设计优选组合，以获得香菇酶解液。
本发明所述的发酵是以酶解后的香菇为原料进行发酵，具体方案中，可根据实际原料和条件对接种量、发酵温度、发酵时长等发酵工艺参数进行优化。
以下是发明人提供的实施例，以对本发明的技术方案做进一步解释说明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡不背离本发明构思的改变或者同替代技术方案均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1：
该实施例从多株发酵菌中筛选适合用于开发香菇发酵液的菌株：
将9株菌株(如表1是所示)接种于MRS肉汤培养基中活化两代后计算原菌液活菌数，然后取菌液5mL离心后弃上清，菌体用生理盐水洗涤2次后，再加入无菌生理盐水(5mL)混匀得菌悬液；
吸取0.5mL菌悬液，加入到MRS液体培养基中，充分混匀后在37℃恒温培养3h，测定活菌数，比较不同菌株在酸性环境中的耐受性，同时，将已活化的菌株接种到胆盐浓度为0.3g/100mL的MRS液体培养基中，37℃恒温培养3h后测定活菌数，比较其对胆盐的耐受性，另外，通过测定菌株表面疏水性和自聚集性评估其黏附性。该实施例的各测试方法为：
菌株耐酸耐胆盐能力的测试：
9株菌株在MRS肉汤培养基中活化两代后计原菌液活菌数，之后取菌液5mL，离心(3000r/min，10min)后弃上清，菌体用生理盐水洗涤2次后，再加入无菌生理盐水(5mL)混匀得菌悬液。吸取0.5mL菌悬液，加入到4.5mL MRS液体培养基(pH 3.0)中，充分混匀后在37℃恒温培养3h，测定活菌数，计算存活率(％)，比较其在酸性环境中的耐受性。另外，将已活化的菌株接种到胆盐浓度为0.3g/100mL的MRS液体培养基中，接种量为3％(v/v)，37℃恒温培养3h后，测定活菌数，计算存活率(％)，比较其对胆盐的耐受性。
菌株的黏附性的测试：
通过测定菌株表面疏水性和自聚集性来评估其黏附性。乳酸杆菌表面疏水性的测定采用微生物黏着碳烃化合物法，即乳酸杆菌于37℃下静置培养18h，菌液在6000×g离心10min，弃上清，收集菌体沉淀。菌体用灭菌的PBS(pH 7.2)溶液洗涤两次，再重新悬浮于灭菌的0.1M KNO3溶液中，使菌体悬液的吸光度(OD600 nm)达到0.5±0.02。取3mL菌悬液与1mL二甲苯混匀后在室温静置10min(此时形成两相体系)。将两相体系涡旋震荡2min后再静置20min，重新形成为两相体系(水相和有机相)。小心吸取水相，在600nm下测定吸光度，计算细胞表面疏水性。此外，对于乳酸杆菌自聚合能力的测定，将新鲜培养的乳酸杆菌在室温下离心(6000×g，10min)，弃上清，收集菌体。菌体用灭菌的PBS(pH 7.2)溶液洗涤两次，并重悬于PBS溶液中，使其在600nm下的吸光度达到0.5±0.02。然后将2mL的细胞悬液涡旋震荡10s，于37℃静置2h。小心吸取1mL静置后的上清，测定其在600nm的吸光度，计算自聚合能力。
表1试验菌株及来源
表2菌株耐酸耐胆盐试验结果
注：结果表示为均值±标准差(n＝3)，同一列中不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。—表示活菌数未达到106CFU/mL
表2所示为9株乳酸菌耐酸耐胆盐的结果。由表2可知，9株乳酸菌的耐酸能力均较好，在pH 3.0的条件下培养3h后存活率均高于80％；两歧双歧杆菌CICC6169和鼠李糖乳杆菌CICC6133对胆盐的耐受性较差，培养3h后活菌数均未达到106CFU/mL。另外，动物双歧杆菌CICC6174对胆盐的耐受性较差，存活率仅为62.72％，显著低于其他菌株(P<0.05)。因此，经试验筛选，共有6株菌具有较好的耐酸性和胆盐耐受性，分别为副干酪乳杆菌CICC20241、动物双歧杆菌CICC6165、青春双歧杆菌CICC21709、植物乳杆菌CICC21805、嗜酸乳杆菌CICC6074以及发酵乳杆菌CICC21828。
进一步，对上述筛选的菌株进行测试，发现6株乳酸菌在疏水性和自聚集能力方面存在差异(图1)。
结合图1所示，动物双歧杆菌CICC6165的疏水性最强，达到87％，其次是青春双歧杆菌CICC21709(71.15％)、植物乳杆菌CICC21805(67.74％)、发酵乳杆菌CICC21828(33.75％)、嗜酸乳杆菌CICC6074(5.91％)和副干酪乳杆菌CICC20241(1.67％)。各菌株的自聚集能力由高到低依次为：植物乳杆菌21805(23.7％)、嗜酸乳杆菌6074(16.9％)、发酵乳杆菌21828(16.38％)、动物双歧杆菌6165(15.14％)、青春双歧杆菌21709(13.23％)、副干酪乳杆菌CICC20241(6.63％)。因此，副干酪乳杆菌的疏水性和自聚集能力最低。综上所述，经试验筛选得到了5株乳酸菌，分别为动物双歧杆菌CICC6165、青春双歧杆菌CICC21709、植物乳杆菌CICC21805、嗜酸乳杆菌CICC6074和发酵乳杆菌CICC21828。
实施例2：
该实施例分别将上述五株均接种至香菇酶解液中制备发酵香菇液，具体步骤如下：
步骤1，酶解
将鲜香菇于60℃±5烘干至恒重，粉碎、70目过筛后得到菌粉；
按1:25料液比将菌粉加入到水中配制成香菇溶液，对其进行超声预处理(500W、15-20min)，然后调节pH值为5.5±0.5；
将制备的香菇溶液于43-48℃恒温水浴中酶解处理1.5h，得到酶解液，其中复合酶的添加量为4.8％(w/w)，其配比为果胶酶：纤维素酶＝2:1(w/w)；
对上述得到的酶解液100℃条件下处理7min，得到香菇酶解液。
步骤2，接种发酵
香菇酶解液经巴氏杀菌(75℃，20min)后，将上述筛选得到的5株菌株分别以1％(v/v)的接种量接种至灭菌后的香菇酶解液中，37℃培养18h。
发酵完成后测定活菌数和香菇多糖提取率，其中，活菌数测定采用倾注平板法(GB4789.35-2016；多糖提取率的测试参考NY/T 1676-2008方法，具体为按照香菇发酵液：95％乙醇＝1:4(v/v)的比例加入95％乙醇，4℃静置12h以沉淀多糖，4500r/min离心15min后取沉淀，利用苯酚硫酸法测定香菇多糖提取率。结果如图2所示。
结合图2所示，以香菇多糖提取率和活菌数为指标，对5株益生菌的发酵性能进行测定，发现经发酵乳杆菌CICC21828发酵得到的香菇多糖提取率最高，可达到2.79％；香菇液经植物乳杆菌CICC21805、发酵乳杆菌CICC21828和动物双歧杆菌CICC6165发酵后，其活菌数高于108CFU/mL，显著高于其他菌株(P<0.05)；另外，青春双歧杆菌CICC21709发酵过程中产生了令人不愉快的风味，不适合香菇汁的发酵。因此，确定发酵乳杆菌CICC21828为最适宜香菇汁发酵的菌株。
对实施例2制备的发酵乳杆菌CICC21828发酵香菇汁的理化指标进行测定：
对实施例2制备的发酵乳杆菌CICC21828发酵香菇汁的理化指标进行测定，同时，以未发酵的香菇酶解液为对照，评价发酵过程对香菇汁理化指标的影响。理化指标的测定中，总酸含量的测定采用酸碱滴定法(GB/T 12456-2008)；总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法(GB/T 15672-2009)；总可溶性蛋白含量的测定方法为BCA蛋白分析试剂盒；乳酸含量的测定方法为高效液相色谱法；总酚含量的测定为福林酚试剂法；5′-核苷酸的含量测定为高效液相色谱法；游离氨基酸含量的测定采用日立L-8900氨基酸分析仪。
香菇酶解液即未发酵香菇汁(NFL)和发酵香菇汁(FL)中各理化指标的含量如表3所示。香菇汁的总酸和乳酸的含量显著增加(P＜0.05)，总酸含量从2.89g/L增加至6.82g/L，乳酸的含量从0.3mg/mL增加至0.65mg/mL(P＜0.05)。这可能是由于乳酸菌在生长代谢过程中，以苹果酸为碳源，消耗苹果酸以产生乳酸。同时，总糖含量也从2.52g/100mL增加至2.83g/100mL(P＜0.05)；发酵后总蛋白和总酚的含量显著降低(P＜0.05)，这是由于在乳酸菌以香菇汁为底物进行生长代谢的过程中，底物中所含有的蛋白质将作为氮源而被消耗，同时在乳酸菌代谢的过程中，产生了如还原酶等酶类物质，这些酶类物质对多酚类物质具有分解作用，从而使多酚浓度降低。
表3NFL和FL的化学成分含量及抗氧化活性
注：NFL：香菇未发酵液；FL：香菇发酵液。*表示同一列NFL和FL之间存在显著性差异(P<0.05)。
同时，5′-核苷酸是与食用菌的鲜味密切相关的一类物质且在食用菌中含量丰富。对发酵前后样品中各种5′-核苷酸的含量进行了测定(表4)。发现发酵前后5'-CMP的含量在五种所检测的5′-核苷酸中均最高，5′-CMP在NFL中的含量为3.75mg/100mL，在FL中的含量为4.17mg/100mL。发酵后5′-GMP和5'-AMP的含量均显著增加，5′-GMP从0.59mg/100mL增加至0.85mg/100mL，5'-AMP从0.57mg/100mL增加至2.14mg/100mL。同样，总5′-核苷酸的含量也显著增加。此外，游离氨基酸是食用菌中所含有的重要的呈味物质。
表4NFL和FL中5′-核苷酸的含量
注：NFL：香菇未发酵液；FL：香菇发酵液，ND：未检出。*表示同一行NFL和FL之间存在显著性差异，P＜0.05。
对发酵前后13种游离氨基酸含量变化进行测定(表5)，结果显示，在未发酵液样品中检测到12种游离氨基酸，在发酵液中检测到13种，而脯氨酸即为发酵后新产生的一种游离氨基酸。发酵前后总游离氨基酸的含量分别为2.53g/L和2.74g/L，二者之间无显著性差异(P＞0.05)。结果显示，苏氨酸的含量最高，其次是谷氨酸和赖氨酸。发酵过程使鲜味和甜味氨基酸的含量显著增加(P＜0.05)。未发酵液和发酵液中均含有七种必需氨基酸(EAA)，且含量分别为1.54g/L和1.58g/L。NFL和FL中必需氨基酸和游离氨基酸的比值分别为0.61和0.58，均高于0.4，因此我们可以认为二者均属于优质蛋白质。上述结果表明，发酵乳杆菌21828对香菇液中游离氨基酸的含量和组成有一定影响，但由于所含有的游离氨基酸的种类和含量均有限，其对整体的风味影响较小。
表5NFL和FL中游离氨基酸的含量
注：鲜味氨基酸：谷氨酸+天门冬氨酸；甜味氨基酸：丝氨酸+苏氨酸+丙氨酸+脯氨酸；苦味氨基酸：精氨酸+异亮氨酸+亮氨酸+苯丙氨酸+缬氨酸；无味氨基酸：酪氨酸+赖氨酸；必需氨基酸为：苏氨酸+缬氨酸+异亮氨酸+亮氨酸+苯丙氨酸+赖氨酸
对实施例2制备的发酵乳杆菌CICC21828发酵香菇汁发酵过程中挥发性物质的测定：
对实施例2制备的发酵乳杆菌CICC21828发酵香菇汁发酵过程中挥发性物质的测定，同时，以未发酵的香菇酶解液为对照，采用气相色谱-质谱联用法测定挥发性物质含量，评价发酵过程对香菇汁挥发性物质的影响。NFL和FL分别代表未发酵香菇汁和发酵香菇汁样品。
如图3所示，NFL中含有54种化合物，可分为7大类，分别为：硫化物(8种)、醇类(8种)、烃类(9种)、醛类(14种)、酮类(10种)、酯类(2种)以及其他(3种)，其相对含量分别为40.29％、44.43％、2.17％、6.1％、13.42％、0.8％和1.34％；FL与NFL的挥发性成分差异显著；FL中检出的挥发性成分比NFL缺少5种，其中含量较多的为醇类化合物(8种，53.59％)和硫化物(8种，36.32％)。其次依次为醛类(13种，4.9％)、酮类(8种，2.28％)、其他(3种，1.37％)、酯类(3种，0.85％)和烃类(6种，0.71％)；发酵后醛类、酮类和烃类的含量显著降低，而醇类的含量显著升高(P＜0.05)。
测试发现，发酵后香菇发酵液中1-辛烯-3-醇的含量有所增加；在发酵液中未检测出3-辛酮，这一结果可能表明3-辛酮是未发酵液中所特有的一种挥发性物质。香菇精(1,2,3,5,6-亚硫杂环庚烷)和1,2,4,5-四硫环己烷是香菇所含有的重要香气成分，二者的相对含量在发酵前后未发生明显的变化(P＞0.05)。另外，二甲基二硫醚、二甲基三硫醚和2,4,5-三硫杂己烷也是香菇挥发性成分的主要组成成分，但在发酵后其含量均显著降低(P＜0.05)。综上所述，发酵乳杆菌CICC21828可影响香菇液中挥发性成分的组成及含量。
评价实施例2制备的发酵乳杆菌CICC21828发酵香菇汁中益生菌发酵对感官评定的影响：
评价实施例2制备的发酵乳杆菌CICC21828发酵香菇汁中益生菌发酵对感官评定的影响，同时，以未发酵的香菇酶解液为对照。
具体采用定量描述分析(QDA)对样品的感官特征进行评估，并利用七点法喜好程度标度，分别对香菇发酵液和未发酵液的质地、色泽、香气、酸甜度、口感、鲜味和整体接受度进行评价，按1-7不同等级打分(1：十分不喜欢；2：不喜欢；3：略微不喜欢；4：不喜欢也不讨厌；5：略微喜欢；6：喜欢；7：十分喜欢)。感官评定由10名评价员进行，每位评价员在评价过程中单独记录评分。同时，以未发酵的酶解香菇液为对照；NFL和FL分别代表未发酵香菇汁和发酵香菇汁样品。
如图4所示为香菇未发酵液和发酵液感官评定结果。未发酵液和发酵液均为橙色，质地均匀，无肉眼可见的杂质。二者均具有鲜味以及蘑菇的特征风味，而发酵液比未发酵液具有更加明显的酸甜的滋味。在口感方面，发酵液的口感较为光滑细腻，而未发酵液的口感较涩。对于整体接受度，香菇发酵液的得分较高。因此，乳酸菌发酵使香菇液具有了独特的发酵的香气，改善了香菇液的风味并提高了其接受度。
评价实施例2制备的发酵乳杆菌CICC21828发酵香菇汁中益生菌发酵香菇液的体内免疫调节作用：
评价实施例2制备的发酵乳杆菌CICC21828发酵香菇汁中益生菌发酵香菇液的体内免疫调节作用，同时，以未发酵的香菇酶解液为对照；NFL和FL分别代表未发酵香菇汁和发酵香菇汁样品，评价益生菌发酵香菇液的体内免疫调节作用。
具体的，通过腹腔注射环磷酰胺构建免疫抑制小鼠模型：
小鼠饲养过程中确保饮食自由，12h昼夜交替。适应性饲养7d后，把小鼠随机分为6组(n＝6)，为正常组(Normal)、模型组(Model)、阳性对照组(Positive)、未发酵液组(NFL)、活菌型发酵液组(FL)、灭菌型发酵液组(FL1；灭菌条件为：75℃处理15min)；正常组腹腔注射生理盐水，其他组均腹腔注射CTX(80mg/kg体重·天)，连续4d；
模型建立成功后，从第5天开始灌胃，按照小鼠/人代谢比推算小鼠每日灌胃量为0.1mL/10g，正常组和模型组灌胃生理盐水，阳性对照组为给免疫抑制小鼠模型灌胃盐酸左旋咪唑(20mg/kg体重·天)，香菇液组分别给免疫抑制小鼠模型灌胃NFL、FL、FL1，连续灌胃8天，评价益生菌发酵对免疫抑制小鼠的保护作用；
样品制备过程中，小鼠最后一次灌胃24h后，采集小鼠粪便，于-80℃冷冻保存；然后禁食不禁水，24h后记录小鼠体重(g)，眼球取血并将血清保存于-80℃；使用颈椎脱臼法把取血后的小鼠处死，解剖后取其肝脏、胸腺、脾脏和小肠的空肠段组织，将空肠组织固定于4％多聚甲醛溶液中常温保存，其他组织于-80℃冷冻保存。
小鼠免疫器官指数的测定：用预冷的生理盐水漂洗胸腺和脾脏，在滤纸上把水分吸干后，称重；计算：脏器指数＝器官重量(mg)/小鼠体重(g)。
小鼠肝脏抗氧化能力的测定：取肝脏组织，将0.9％生理盐水按照肝脏重量(mg)：体积(μL)＝1:9的比例加入其中，匀浆过程在冰水浴中进行，得10％的肝脏组织匀浆液，3000r/min离心10min后取上清液待测。使用相应的试剂盒测定肝脏中SOD、CAT的活性及MDA的含量。
小鼠脾脏中细胞因子含量的测定：制备脾脏匀浆液，离心取上清液待测；利用ELISA试剂盒测定IL-2、IL-6的含量；
小鼠血清中免疫球蛋白含量测定：采用ELISA试剂盒法测定血清中IgG和IgM的水平。
小鼠肠道菌群测定：以小鼠粪便为样本，提取DNA并进行高通量测序，试验中所采用的引物为338F-806R。
此外，对采集的小鼠小肠组织进行切片、脱水、包埋及HE染色，利用显微镜镜检，采集图像并对其进行分析。
测定结果如下：
(1)不同香菇汁处理样品对小鼠免疫器官指数的影响
表6为不同香菇汁处理样品对小鼠免疫器官指数的影响，结果显示各组的胸腺指数无显著差异，但模型组小鼠的脾脏指数相较于正常组明显降低(P<0.05)，表明免疫抑制模型已成功构建。在灌胃了不同的香菇汁后发现脾脏指数均有所回升，其中FL1组和FL组的脾脏指数极显著增加(P<0.01)，且活菌型香菇汁的作用强于灭菌型香菇汁。这可能是因为发酵香菇汁中含有大量的乳酸菌活菌体，有利于刺激脾脏的发育，改善免疫抑制小鼠的免疫功能。
表6不同香菇汁对小鼠免疫器官指数的影响
注：数据均表示为平均值±标准差(n＝6)。与正常组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与模型组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。
(2)不同香菇汁对小鼠肝脏抗氧化能力的影响
丙二醛是一种过氧化产物，可间接反映氧自由基的作用使细胞受损的程度。小鼠肝脏中CAT、SOD的活性水平及MDA的含量测定结果如表7所示。
表7不同香菇汁对小鼠肝脏抗氧化能力的影响
注：数据均表示为平均值±标准差(n＝6)。与正常组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与模型组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。
模型组小鼠的CAT、SOD活性与正常组相比显著降低(P<0.05)，MDA含量变高，说明CTX损害了小鼠的氧化还原系统。灌胃三种香菇汁后，CAT和SOD活性均提高，MDA的含量虽然有所下降，但各组小鼠之间MDA含量无显著性差异(P>0.05)。对于CAT和SOD活性，活菌型和灭菌型香菇汁均显著提高了CAT和SOD的活性(P<0.01)，这说明活菌型和灭菌型香菇汁均对免疫损伤小鼠的氧化还原系统具有改善作用。
(3)不同香菇液对脾脏中细胞因子含量的影响
如图5所示为三种香菇汁对免疫抑制小鼠脾脏中IL-2和IL-6水平的影响，模型组小鼠脾脏中IL-2和IL-6的含量均降低(P<0.01)，说明CTX导致小鼠免疫功能障碍，模型建立成功；经灌胃8天后，灭菌型香菇汁和活菌型香菇汁均显著提高了IL-2的含量(P<0.05)；对于IL-6含量，未发酵香菇汁组和活菌型香菇汁组小鼠的IL-6含量显著增加(P<0.05)，灭菌型香菇汁组小鼠脾脏中IL-6的含量与与模型组相比无显著性差异(P>0.05)。可见，活菌型香菇汁在增加免疫抑制小鼠的细胞因子水平方面具有更好的效果。
(4)不同香菇液对血清中免疫球蛋白含量的影响
如图6所示为不同香菇汁对血清中免疫球蛋白含量的影响；模型组小鼠血清中IgG和IgM的含量均最低，而三种香菇汁均显著提高了小鼠血清中IgG(P<0.01)和IgM(P<0.05)的水平，且FL组小鼠的IgG和IgM的含量最高。说明活菌型香菇汁对免疫抑制小鼠具有更好的改善效果。
(5)不同香菇液对小肠组织病理结构的影响
小鼠处死后取其空肠段组织，经HE染色后，其病理结构形态如图7所示，由图可知，正常组小鼠的小肠绒毛完整，且排列整齐，而模型组小鼠的小肠绒毛明显萎缩；与模型组相比，阳性对照组小鼠的小肠绒毛变长，且排列整齐，三种香菇汁对小鼠的小肠组织也有不同程度的改善作用；另外，小肠组织的完整性可通过绒毛长度、肠壁厚度来表征。
利用CaseViewer 2.3软件对绒毛长度、肠壁厚度进行定量测定，结果如图8所示，相较于正常组，模型组的绒毛长度(P<0.05)和肠壁厚度(P<0.01)均显著降低；未发酵香菇汁(NFL)对小肠绒毛长度没有明显的改善作用，而灌胃了灭菌型香菇汁(FL1)和活菌型香菇汁(FL)的小鼠，其绒毛长度与模型组相比明显增加，且FL的改善作用强于FL1。
另外，相较于模型组，三种香菇汁均显著增加了肠壁厚度(P<0.01)，其中改善作用最好的是活菌型香菇汁(FL)。
上述结果表明益生菌发酵有利于提高香菇汁对免疫抑制小鼠肠道健康的改善作用，且含活菌型的香菇汁其作用效果更强。
(6)对肠道菌群多样性的影响
在肠道菌群的分析中，常利用Alpha多样性指数对物种的多样性进行分析。各组小鼠肠道菌群的Alpha多样性指数见表8。
表8各组小鼠肠道菌群的丰度系数
注：与正常组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与模型组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。
注射CTX使模型组Ace、Chao指数及Shannon指数降低，且具有显著性，同时Simpson指数升高，说明注射CTX使小鼠的肠道菌群失衡，使其多样性和丰富度降低。灌胃三种不同的香菇汁后，小鼠肠道菌群的失衡有所缓解；三组小鼠菌群丰富度较模型组均显著增加(P<0.05)，但FL1和FL组的群落丰富度低于NFL组。同样的，NFL组显著提高了小鼠菌群的多样性(P<0.05)，而FL1和FL组小鼠菌群的多样性则低于NFL组。这一结果说明香菇汁具有调节肠道菌群的作用，且经发酵后的香菇汁会降低小鼠肠道菌群的多样性及丰富度，提高优势菌的集中度。
分别从门水平和科水平两个层面分析三种香菇汁对免疫抑制小鼠肠道菌群组成的影响。如图9所示，在门水平下，小鼠肠道菌群主要包括6种：厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、变形菌门(Proteobacteria)、髌骨细菌门(Patescibacteria)、Campilobacterota和放线菌门(Actinobacteriota)。占比最大的是厚壁菌门和拟杆菌门，二者所占比例之和可达90％。腹腔注射CTX之后，模型组小鼠的肠道菌群中拟杆菌门明显增加(从28.69％增加至62.80％)，厚壁菌门所占比例明显降低(从60.53％降至34.51％)，变形菌门几乎消失，这说明小鼠的肠道菌群多样性遭到破坏，肠道菌群的结构发生紊乱。在灌胃三种不同的香菇汁后，发现小鼠肠道菌群的紊乱有所恢复，菌群的多样性增加。FL、FL1和FL组小鼠肠道菌群的F/B的值分别为1.08、1.90、2.66，即灭菌型香菇汁(FL1)组最接近正常组水平，活菌型香菇汁(FL)组则超过了正常水平。但NFL和FL1组中变形菌门几乎消失，仅FL组小鼠肠道中变形菌门的含量有所增加，为8.97％，说明活菌型香菇汁的摄入能够提高变形菌门的组成比例，对恢复肠道菌群紊乱具有更好的调节作用。
在科水平层面，各组小鼠的菌群组成如图10所示。小鼠肠道菌群中相对丰度大于1％的菌群主要包括乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、Muribaculaceae、理研菌科(Rikenellaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)等23种。相较于正常组，模型组小鼠中乳酸杆菌科、毛螺菌科和索状芽孢杆菌科的含量显著降低，Muribaculaceae、理研菌科、芽孢杆菌科和拟杆菌科的含量明显增加，其他菌群的组成比例也有差异，甚至消失，这也说明模型组小鼠的肠道菌群失衡，模型建立成功。灌胃三种不同的香菇汁后，结果显示，三组小鼠之间各菌群的组成比例存在差异。乳酸杆菌科在未发酵香菇汁组(NFL)小鼠体内的含量显著降低，在灭菌型香菇汁组(FL1)和活菌型香菇汁组(FL)中的含量增加，且在FL1小鼠中的含量最高，该结果表明摄入发酵香菇汁可以增加小鼠体内乳酸杆菌的占比，促进小鼠肠道健康，并且无菌的香菇汁在体内也具有益生作用。
实施例3：
该实施例进一步在实施例2制备的发酵乳杆菌CICC21828发酵香菇汁中益生菌发酵香菇液中加入质量百分比为9％的蔗糖和质量比分比为0.1％食品级柠檬酸酸，调配即得口味俱佳的益生菌发酵香菇汁，成品如图11所示。
Claims (2)
1.一种具有免疫调节活性的益生菌发酵香菇汁，其特征在于，所述益生菌发酵香菇汁是以香菇为原料，依次经酶解和发酵制得；所述酶解用酶为果胶酶和纤维素酶的复合酶；所述发酵用发酵菌为发酵乳杆菌CICC 21828，发酵菌的接种体积百分比为1％；
所述酶解包括：将干香菇粉碎成粉末后加水制成香菇粉溶液，接着对香菇粉溶液进行pH值调整后加入复合酶进行酶解，所述复合酶的添加质量百分比为4.8％；所述干香菇是将鲜香菇于50-70℃烘干至恒重；其中干香菇粉碎成粉末后过60-80目筛；调整后的pH值为5.0-6.0；所述复合酶配比为果胶酶与纤维素酶的质量比为2:1。
2.根据权利要求1所述的具有免疫调节活性的益生菌发酵香菇汁，其特征在于，对所得发酵液进行糖度和酸度调整。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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