CN114317348B - 一种植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物乳杆菌及其应用。本发明自行筛选得到了一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4‑3‑A，其对生姜进行发酵能够缩短发酵周期，提高批次间产品的稳定性，所得发酵产物活性物质含量高、安全健康，具有良好的抗炎、抗氧化、抑菌、防脱发功效，符合化妆品原料的要求，在化妆品中有很好的应用前景。通过植物乳杆菌对生姜进行发酵，结合特殊的发酵方法，能够更好的促进生姜有效成分的析出。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A，还涉及该植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A在制备发酵产品尤其是在制备生姜发酵产品中的应用，还涉及一种发酵得到的生姜发酵提取液及其在化妆品中的应用，属于生物发酵技术领域。
技术背景
生姜是姜科姜属植物姜的新鲜根状茎，为多年生草本植物，是世界范围内一种重要的香辛调味料，也是亚洲传统药食两用植物，其性辛、微温。我国生姜栽培历史悠久，资源丰富，地方品种繁多，产量很大。传统医学认为，生姜性热，具有散寒解表，温中止吐，解毒等功效，现代研究表明，生姜具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、防腐抑菌、止呕等多种生物活性。因此，生姜在医药领域被广泛使用，常被用来治疗腹泻、呕吐、消化不良等肠胃功能紊乱症状。
除此之外，生姜在化妆品领域也有较多的应用，首先，生姜作为美容护肤成分由来已久，据悉我国古代中草药著作中记录了数千个美容方剂，其中涉及到生姜的处方数十个。生姜的这一美容护肤作用主要是利用了其生发育发、洁肤的功效。生姜中主要功效成分是姜辣素，也是其辣味成分，姜辣素为多种物质所构成的混合物。姜酚是姜辣素的主要活性成分，主要组成有6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等，其中以6-姜酚的含量最高、生物活性最强。姜辣素可以使头部皮肤血液循环正常化，促进头皮新陈代谢，活化毛囊组织，有效地防止脱发，刺激新发生长，并可抑制头皮痒，强化发根。
生姜中还含有姜精油、姜油树脂、姜多糖。姜精油和姜油树脂是生姜深加工的最主要活性成分，具有抗氧化、抑菌抗炎的作用；姜多糖细胞毒性小，调节免疫能力强，且具有营养和保湿的双重功效，在化妆品中可作为天然保湿剂。
目前对生姜进行深加工的方法之一是对其进行发酵，所得产品称为生姜酵素。生姜酵素可以将生姜中的功效成分大量的释放，且含有大量的微生物、矿物质、氨基酸等成分，有助于恢复和改善血液循环，提高功效。因此研究一种提高生姜酵素有效成分的制备方法是非常有必要的。
迄今为止，关于生姜酵素的研究较多，如中国专利CN106993807公开了“一种生姜酵素的制备方法”，其以生姜和白砂糖为原料按一定质量比混合均匀，姜片浸汁后对姜汁和姜渣进行单独发酵，单独发酵后混合均匀进行混合发酵，此发明利用酵母菌、乳酸菌、曲霉菌、醋酸菌进行混菌多重发酵，发酵周期长，发酵过程不容易监控，且发酵产物批次间不容易稳定。
中国专利CN107668685A公开了“一种生姜酵素的生产工艺”，其以新鲜、无腐烂生姜作为原料，以乳酸菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、酵母菌等为发酵素发酵，加入一定量的低聚异麦芽糖、益生菌，益生菌以低聚异麦芽糖为营养，迅速发酵形成酵素，当酵素达到一定浓度时，即可得到富含酵素的原液，此发明利用多种益生菌进行两次厌氧发酵，整个周期长达600多天，也存在发酵周期长，发酵过程不容易监控，且发酵产物批次间不容易稳定的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明筛选得到了一株性能优异的植物乳杆菌，该植物乳杆菌具有较好的活性，发酵周期短、发酵过程容易控制、发酵产物批次稳定性好。使用该植物乳杆菌对生姜进行发酵，能够在较短时间内得到稳定的产品，且所得发酵产物中生姜的活性物质含量高，性能好。
本发明采用一株发酵性能优异的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），该植物乳杆菌为本实验室自行分离，命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A，已于2021年2月22日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）进行保藏，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2021186。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A的16s DNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步的，本发明提供了一种菌剂，该菌剂中包含上述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A。该菌剂中可以仅含有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A这一种微生物，也可以含有其他的微生物。
进一步的，所述菌剂既可以为固体制剂，也可以为液体制剂。
本发明还提供了上述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A或者上述菌剂在制备发酵产品中的应用。该应用中，一般是将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A或者上述菌剂加入底物中进行发酵，得到发酵产品。
在现有技术中公开了植物乳杆菌在多种领域的发酵用途，本发明植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A在这些现有公开的领域中均可以使用，用于替换现有的植物乳杆菌得到发酵产物。
优选的，本发明植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A或者上述菌剂用于制备生姜发酵产品。所述生姜发酵产品是由含有生姜的底物发酵得到的产品。
本发明提供了一种生姜发酵提取液的制备方法，该方法包括采用上述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A对含生姜的生姜培养液进行发酵的步骤。
进一步的，所述生姜以浆体的形式加入生姜培养液中。生姜浆体以整个生姜为原料，在打浆之前，可以将生姜进行清洗的预处理，洗净的生姜可以采用常规的榨汁机、料理机、破壁机等设备进行打浆。优选的，生姜浆体先酶解后再加入生姜培养液中，以使生姜中的有效成分充分的溶出。酶解所用的酶可以为纤维素酶和果胶酶中的一种或两种，优选为纤维素酶和果胶酶的混合物。当所用酶为这两种的混合物时，纤维素酶和果胶酶的质量比可以随意选择，优选的，纤维素酶和果胶酶的质量比优选为0.1-10:1。
优选的，纤维素酶的酶活为1-2万U/g，果胶酶的酶活为5-7万U/g。在此酶活下，酶的用量为生姜质量的0.03-0.3wt%。
进一步的，酶解pH为5.0~5.5，酶解温度为45-55℃。一般酶解1-2h左右能够实现生姜有效成分的较好溶出。
进一步的，生姜培养液中除了含有未经酶解或经过酶解的生姜浆体外，还含有氮源、碳源和无机盐。氮源、碳源和无机盐是微生物发酵所必须的成分，其可以从现有技术中进行选择。例如，所述氮源为微生物培养常用氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、大豆肽粉等，所述碳源为微生物常用碳源，如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糊精等，所述无机盐为无水乙酸钠、磷酸氢二钾等。
进一步的，生姜在生姜培养液中的质量百分含量为10-30wt%，氮源在生姜培养液中的质量百分含量为0.1-2.5wt%，碳源在生姜培养液中的质量百分含量为0.1-2wt%，无机盐在生姜培养液中的质量百分含量为0.02-0.8wt%。
进一步的，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A菌种在生姜培养液中的接种量为0.5-2体积%。该植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A在使用时，可以通过培养基进行扩大培养，以得到所需数量的菌种，其最佳培养温度为30℃-37℃。例如，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A菌种可以通过液体的种子培养基进行扩大培养，扩大培养后离心去除上清液，得到植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A菌种。优选的，种子培养基的配方为：碳源1-2wt %、氮源1.5-2.5wt %、无机盐0.2-0.7wt %，水余量。所述碳源为微生物培养常用碳源，如果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糊精等，所述氮源为微生物培养常用氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、黄豆粉等，所述无机盐为磷酸氢二钾、硫酸锰等。
进一步的，上述方法具体包括以下步骤：
（1）将生姜打浆，得到生姜浆体，备用；或者将生姜浆体加入水混合均匀得到混悬液，调节混悬液pH至5.0~5.5，加入酶进行酶解；
（2）将上述未经酶解的生姜浆体或者酶解后的生姜混悬液与氮源、碳源、无机盐和水混合，配成含生姜的生姜培养液；
（3）将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A 加入上述含生姜的生姜培养液中，发酵至pH不再变化，得发酵液；
（4）将发酵液除杂、除菌，得到生姜发酵提取液。
进一步的，步骤（1）中，生姜浆体与水的比例可以随意调控，无特殊要求，以不影响酶解为原则。混悬液的pH可以通过常规的无机酸调整至5.0~5.5。
进一步的，步骤（1）中，酶的添加量为生姜质量的0.03-0.3 wt%。
进一步的，步骤（2）中，未经酶解的生姜浆体或者酶解后的生姜混悬液进一步与氮源、碳源、无机盐等进行混合，配成用于植物乳杆菌发酵的含生姜的生姜培养液。生姜培养液中的生姜浆体或酶解后的生姜混悬液、氮源、碳源、无机盐的混合顺序随意。优选的，将氮源、碳源、无机盐加入生姜浆体或酶解后的生姜混悬液中，混合均匀后灭菌。这样能使酶解过程中加入的酶充分灭活，稳定产品质量。灭菌可以采用现有技术中报道的各种可行的灭菌方式，例如湿热灭菌等。
进一步的，步骤（3）中，发酵在30-37℃下进行，采用普通的摇床发酵即可，发酵至pH不变时停止发酵，转速为120-160rpm。
进一步的，步骤（4）中，发酵所得发酵液通过过滤、离心等方式除杂、除菌。
优选的，发酵过程中，除了在生姜培养液中加入植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A菌种进行发酵外，还加入酶进行酶解。在发酵起始就加入酶，酶解和发酵同时进行。植物乳杆菌和酶的加入顺序无特别要求，可以先配成生姜培养液，然后将植物乳杆菌和酶同时或依次加入生姜培养液中，也可以先将植物乳杆菌和酶加入水中，然后再加入其他成分配成生姜培养液，还可以将植物乳杆菌或酶加入水中，然后再加入其他成分配成生姜培养液，最后再向生姜培养液中加入酶或植物乳杆菌。原料全部添加完成后，调整温度和转速进行发酵。
进一步的，发酵过程中加入的酶的作用进一步对生姜细胞壁进行酶解。酶解所用的酶可以为纤维素酶和果胶酶中的一种或两种，优选为纤维素酶和果胶酶的混合物。当所用酶为这两种的混合物时，纤维素酶和果胶酶的质量比可以随意选择，优选的，纤维素酶和果胶酶的质量比优选为0.1-10:1。
优选的，发酵过程加入的纤维素酶的酶活为1-2万U/g，加入的果胶酶的酶活为5-7万U/g。在此酶活下，酶的添加量为加入生姜质量的0.03-0.3 wt%。
进一步的，发酵过程中，加入菌种和酶后，升温至30-37℃，调整转速为120-160rpm进行摇床发酵，在发酵的同时进行酶解，发酵至pH不变时结束。一般发酵时间为30~36h。
进一步的，本发明某一具体实施方式还公开了一种优选的生姜发酵提取液的制备方法，包括以下步骤：
（1）将生姜打浆，得到生姜浆体，备用；或者将生姜浆体加入水混合均匀得到混悬液，调节混悬液pH至5.0~5.5，加入酶进行酶解；
（2）将上述未经酶解的生姜浆体或者酶解后的生姜混悬液与氮源、碳源、无机盐和水混合，配成含生姜的生姜培养液；
（3）将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A、酶和含生姜的生姜培养液混合，发酵至pH不再变化，得发酵液；
（4）将发酵液除杂、除菌，得到生姜发酵提取液。
进一步的，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A和酶同时加入含生姜的生姜培养液中。
本发明按照上述方法得到的生姜发酵提取液比采用现有其他类型的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵得到的产品成分含量高，其中含有丰富的有机酸和姜辣素（以6-姜酚为主要成分）等成分，且这些成分含量较多，具有更好的抑菌、抗炎、抗氧化、防脱发效果，性能突出，在化妆品中有广泛的应用前景。因此，按照该方法得到的生姜发酵提取液及其在化妆品中的应用也在本发明保护范围之内。
进一步的，所述化妆品优选为头皮护理产品，所述生姜发酵提取液作为头皮抗炎、抑菌成分。
本发明具有以下优点：
1、本发明自行筛选得到了一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A，其对生姜进行发酵能够缩短发酵周期，提高批次间产品的稳定性，所得发酵产物活性物质含量高、安全健康，具有良好的抗炎、抗氧化、抑菌、防脱发功效，符合化妆品原料的要求，在化妆品中有很好的应用前景。
2、本发明提供的生姜发酵提取液制备方法基于传统发酵技术进行改进，先通过酶将生姜中不溶性大分子物质转化成了可溶性小分子物质等，再通过本发明特殊的植物乳杆菌进行发酵，可使生姜中姜辣素等有效成分的总量充分释放出来。特别的是，在发酵的过程中可以同时加入酶，使最终发酵产物中的姜辣素等活性成分含量提升。
保藏信息
本发明所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A 已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为 CCTCC NO: M 2021186 ，保藏日期为2021年2月22日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
下述实施例和对比例用到的纤维素酶活力为1.7万U/mL，果胶酶活力为6万U/mL，纤维素酶和果胶酶为市购。
如无特别说明，下述浓度均为质量百分浓度。
实施例1 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A 筛选及鉴定过程
以市售泡菜汁、干酪、酸乳酒和生姜表皮细胞为原料，将市售泡菜汁、酸乳酒用无菌水稀释100倍，将干酪和生姜表皮细胞用100质量倍无菌水分散，用涂布器将各溶液均匀涂布在含0.04%溴甲基酚紫的MRS平板上，于37℃培养箱中静置培养1~2d，挑选菌落周围培养基颜色变为黄色的单菌落，接种于MRS试管斜面上，于37℃培养箱中静置培养1~2d，菌体长好后，于4℃冰箱保藏。此时共得到菌株4-3-A、L-Z-5、11-7、1-1、2-1、3-1、12-1、4-1-1、4-2-1、4-4-A、L-Z-1.39、L-G-1.31。
将上述菌株，分别接种于含有葡萄糖2 wt %、蛋白胨1 wt %、酵母粉1 wt %、磷酸氢二钾0.2 wt %、无水乙酸钠0.5wt%的无菌种子培养液中，37℃下静置培养13h，至对数生长期。
将生姜洗净后，经料理机打成浆状，得到生姜浆体。将水加入生姜浆体中，使生姜重量比例占整个混悬液的15%，然后加入蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾和无水乙酸钠，116℃灭菌20min，配成生姜培养液。其中蛋白胨1wt%，葡萄糖1.5wt%，磷酸氢二钾0.1wt%，无水乙酸钠0.5wt%。
分别将上述培养得到的菌株按照2体积%的接种量接入生姜培养液中，升温至30-37℃，调整转速为150rpm进行摇床发酵，发酵至pH不变时结束，获得生姜发酵液。发酵液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得生姜发酵提取液。
采用牛津杯法对生姜发酵提取液的马拉色菌抑制效果进行检测，具体实施方式如下：
指示菌平板制备：从马拉色菌斜面上刮取2环菌体，溶于15mL无菌水中，混合均匀后，吸取150μL混悬液，均匀的滴加在马拉色菌固体培养基上，均匀涂布，置30℃恒温培养箱中培养1d。
牛津杯法检测抑菌活性：灭菌后的牛津杯放置于上述指示菌平板上，每个平板放置2个牛津杯，分别加入200μL上述发酵得到的灭活后的生姜发酵提取液，每组制备两个平行。30℃恒温培养箱中继续培养1d。观察抑菌结果，测量并记录抑菌圈直径，取平均值，结果如表1所示。
通过以上数据可以看出，菌株4-3-A、11-7和L-Z-5发酵得到的生姜发酵提取液中的有效成分抑菌效果最佳。将筛选得到的三株菌种送至上海生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因组测序鉴定，结果显示：菌种11-7为鼠李糖乳杆菌，菌种L-Z-5为短乳杆菌（Lactobacillus brevis），菌株4-3-A为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
实施例2
将生姜洗净后，经料理机打成浆状，得到生姜浆体。将水加入生姜浆体中，使生姜重量比例占整个混悬液的15%，用柠檬酸调节pH至5.0~5.5，同时添加果胶酶（果胶酶为生姜混悬液中生姜质量的0.03wt%），55℃酶解1h，酶解后冷却至室温，向其中加入蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾和无水乙酸钠，116℃灭菌20min，配成生姜培养液。其中，蛋白胨1wt%，葡萄糖1.5wt%，磷酸氢二钾0.1wt%，无水乙酸钠0.5wt%。
将植物乳杆菌4-3-A菌体接入生姜培养液中，接种量为1体积%，35℃，150rpm发酵36h后pH不再变化，发酵结束，获得发酵液。
发酵液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得生姜发酵提取液S1。
实施例3-7
按照实施例2中的方法制备生姜发酵提取液，不同的是：发酵前所用的酶及其含量如表2所示。
实施例8
将生姜洗净后，经料理机打成浆状，得到生姜浆体。将水加入生姜浆体中，使生姜重量比例占整个混悬液的15%，用柠檬酸调节pH至5.0~5.5，同时添加果胶酶（果胶酶为生姜混悬液中生姜质量的0.03wt%）和纤维素酶（纤维素酶为生姜混悬液中生姜质量的0.27wt%），55℃酶解1h，酶解后冷却至室温，向其中加入蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾和无水乙酸钠，116℃灭菌20min，配成生姜培养液。其中，蛋白胨1wt%，葡萄糖1.5wt%，磷酸氢二钾0.1wt%，无水乙酸钠0.5wt%。
将植物乳杆菌4-3-A菌体接入生姜培养液中，接种量为1体积%，同时加入果胶酶（果胶酶为生姜混悬液中生姜质量的0.03wt%），35℃、150rpm摇床发酵36h后pH不再变化，获得发酵液。
发酵液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得生姜发酵提取液S7。
实施例9-13
按照实施例8中的方法制备生姜发酵提取液，不同的是：发酵过程中加入的酶及其含量如表3所示。
实施例14
将生姜洗净后，经料理机打成浆状，得到生姜浆体。将水加入生姜浆体中，使生姜重量比例占整个混悬液的30%，用柠檬酸调节pH至5.0~5.5，同时添加果胶酶（果胶酶为生姜混悬液中生姜质量的0.03wt%）和纤维素酶（纤维素酶为生姜混悬液中生姜质量的0.27wt%），45℃酶解1h，酶解后冷却至室温，向其中加入蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾和无水乙酸钠，116℃灭菌20min，配成生姜培养液。其中，蛋白胨0.1wt%，葡萄糖0.1wt%，磷酸氢二钾0.01wt%，无水乙酸钠0.01wt%。
将植物乳杆菌4-3-A菌体接入生姜培养液中，接种量为1体积%，同时加入果胶酶（果胶酶为生姜混悬液中生姜质量的0.03wt%），35℃、150rpm摇床发酵36h后pH不再变化，获得发酵液。
发酵液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得生姜发酵提取液S13。
实施例15
将生姜洗净后，经料理机打成浆状，得到生姜浆体。将水加入生姜浆体中，使生姜重量比例占整个混悬液的10%，用柠檬酸调节pH至5.0~5.5，同时添加果胶酶（果胶酶为生姜混悬液中生姜质量的0.03wt%）和纤维素酶（纤维素酶为生姜混悬液中生姜质量的0.27wt%），55℃酶解1h，酶解后冷却至室温，向其中加入蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾和无水乙酸钠，116℃灭菌20min，配成生姜培养液。其中，蛋白胨2.5wt%，葡萄糖2wt%，磷酸氢二钾0.2wt%，无水乙酸钠0.6wt%。
将植物乳杆菌4-3-A菌体接入生姜培养液中，接种量为0.5体积%，同时加入果胶酶（果胶酶为生姜混悬液中生姜质量的0.03wt%），35℃、150rpm摇床发酵36h后pH不再变化，获得发酵液。
发酵液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得生姜发酵提取液S14。
对比例1
步骤同实施例13，不同在于：将植物乳杆菌4-3-A替换为植物乳杆菌CGMCC 1.3921（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC））。所得生姜发酵提取液记为C1。
对比例2
将生姜洗净后，经料理机打成浆状，得到生姜浆。将水加入生姜浆中，使生姜重量比例占整个混悬液的15%，用柠檬酸调节pH至5.0~5.5，同时添加果胶酶（果胶酶为生姜混悬液中生姜质量的0.03wt%）和纤维素酶（纤维素酶为生姜混悬液中生姜质量的0.27wt%），55℃酶解1h，酶解后冷却至室温，35℃反应36h，获得酶解液。酶解液以9000 rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm滤膜过滤，得生姜提取液C2。
对比例3
步骤同实施例13，不同在于，发酵时添加纤维素酶（纤维素酶为生姜混悬液中生姜质量的0.01wt%）和果胶酶酶液（果胶酶为生姜混悬液质量的0.01wt%），得生姜发酵提取液C3。
对比例4
步骤同实施例13，不同在于，发酵时不添加酶，发酵结束后添加纤维素酶（纤维素酶为生姜混悬液质量的0.03wt%）和果胶酶酶液（果胶酶为生姜混悬液质量的0.27wt%），得生姜发酵提取液C4。
试验例1 姜辣素、总酚含量测定
1. 姜辣素总含量的测定
（1）香草醛标准曲线的制作
以香草醛作为对照品，测定姜辣素含量。精密配制20μg/mL的香草醛标准液，准确吸取香草醛标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于10 mL 容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，得到2、4、6、8、10μg/mL的系列标准溶液，以无水乙醇作空白，在280nm波长处测定吸光值并记录结果，绘制出标准曲线，以吸光值为横坐标，香草醛标准液浓度为纵坐标，得出回归方程。
（2）生姜发酵液中姜辣素总量的测定
准确吸取生姜发酵提取液样品2mL，用蒸馏水稀释3倍后，准确吸取4mL稀释液于25mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，在280nm波长下测定相应的吸光度，每组测定重复3次。根据上述的回归方程以及样品的稀释倍数，得出发酵液中姜辣素的含量，计算公式如下：
式中：W-发酵液稀释倍数；
2.003-香草醛换算成姜辣素的系数；
A-样品的吸光值；
ρ-生姜发酵提取液的密度。
（3）姜辣素总含量如下表4所示：
2. 总酚的测定
（1）没食子酸标准曲线的制作
以没食子酸（GAE）为对照品，测定总酚含量。精密配制0.1mg/mL的没食子酸标准溶液，避光保存。准确吸取没食子酸标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL的容量瓶中，分别加入2.5 mL的0.1mol/L福林-酚试剂，摇匀后，在1~8min内加入2mL的15%碳酸钠溶液，蒸馏水定容至刻度，室温下避光反应2h后，760nm波长下测定相应的吸光度。以没食子酸浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，绘制出标准曲线，并计算出相应的回归方程。
（2）生姜发酵液中总酚的测定
分别取生姜发酵提取液100μL于10 mL容量瓶内，按照上述方法（从分别加入2.5mL的0.1mol/L福林-酚试剂往后一致）测定样品吸光值，每组重复3次。根据上述的回归方程以及样品的稀释倍数，得出发酵液中总酚的含量，公式如下：
每克发酵液含总酚当量（mg/g）=（88.021A－3.6412）×W×10-3/ρ
式中：A-样品的吸光值；
W-生姜发酵提取液稀释倍数；
ρ-发酵液密度（1.003g/mL）。
（3）总酚含量如下表5所示：
由表中数据可知，样品C1、C2的总酚含量很低，而样品C3~C4，S1~S14的总酚含量与C2相比均提高了3~4倍，可见菌种4-3-A发酵后使生姜提取液中的总酚含量提高了很多。
试验例2 氨基酸含量检测
以实施例13中的样品S12与对比例中的样品C2为实验样品，采用HPLC柱前衍生化法测定样品中游离氨基酸含量，结果如表6所示。
从上表结果来看，经本发明菌种发酵后的生姜发酵提取液与传统提取法所得生姜提取液相比，绝大多数游离氨基酸含量都增加。
试验例3 抗炎、抗氧化、防脱发效果评价
本试验旨在对上述实施例及对比例制得的样品进行抗炎、抗氧化、防脱发效果评价。
抗炎活性
1)采用小鼠巨噬细胞模型，用LPS刺激其产生炎性因子，考察样品是否能抑制炎性因子的分泌。
样品溶液的配制：以（sigma，025M4040V，1万单位/mL）LPS作为稀释液，分别将实施例中的样品S12及对比例中的样品C2配制成体积浓度为0.2%的溶液，0.22µm滤膜过滤除菌。
空白对照组：将Raw264.7细胞以1×105个/mL接种于24孔板，在 37℃、5% CO2条件下培养24h，加入无血清培养基，继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。
模型组：将Raw264.7细胞以1×105个/mL接种于24孔板，在 37℃、5% CO2条件下培养24h，加入与空白对照组无血清培养基等体积的LPS（sigma，025M4040V，1万单位/mL），继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。
实验组：将Raw264.7细胞以1×105个/mL接种于24孔板，在 37℃、5% CO2条件下培养24h，加入与空白对照组无血清培养基等体积的样品溶液，继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。
计算各样品对炎性因子的抑制率，计算方法如下：
试验结果如下表7和8所示：
从上述结果来看，在LPS的刺激下，小鼠巨噬细胞的IL-6、IL-1β这两种促炎性因子的分泌量有所增加，经过各样品处理之后，与未经生姜样品处理的LPS模型组相比，IL-6、IL-1β的分泌量有不同程度的变化，说明样品对IL-6、IL-1β具有抑制作用。
而经过本发明植物乳杆菌4-3-A发酵的生姜提取液对IL-6、IL-1β的分泌有明显的抑制作用，而未经植物乳杆菌4-3-A发酵的对比例C2，对上述两种炎症因子均没有抑制作用。由此可以看出，通过植物乳杆菌4-3-A发酵后，可以使得生姜发酵提取物对上述两种炎症因子具有抑制作用。
2)采用毛乳头细胞模型，用H2O2刺激其产生炎性因子，考察样品是否能抑制炎性因子的分泌。
按合适的接种密度接种毛乳头细胞至6孔板中，37℃，CO2培养箱孵育过夜。
配液：按如下试验设计配置不同浓度的受试物。
H2O2刺激：根据试验设计，待6孔板中细胞铺板率达到60%左右时，对有H2O2刺激条件的组别进行H2O2刺激1h。
给药：刺激结束后，根据试验设计进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。37℃、5%的CO2培养箱中孵育培养23h。孵育结束后，根据ELISA试剂盒的操作说明书进行检测分析。
结果分析：应用GraphPad Prism Program软件作图，用t-test方法进行统计分析，*P＜0.05表示差异显著，**P＜0.01表示差异极显著。
结果显示，与 BC 组相比， NC 组的 IL-1β含量显著上升， 说明本次试验刺激条件有效。与 NC 组相比， PC（地塞米松） 组的 IL-1β含量显著下降， 说明本次阳性对照检测有效。与 NC 组相比， 样品S12的 IL-1β含量显著下降，样品S12对IL-1β的抑制率为64.30%，说明样品S12具有良好的抗炎作用，而样品C2对IL-1β的抑制率为22.72%。
抗氧化活性
2.1 清除DPPH自由基试验
0.1mM DPPH溶液配制：精密称取4.0mg DPPH置100mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶解并定容。
不同浓度样品溶液配制：以纯化水作为稀释液，分别将实施例中的样品S12及对比例中的样品C2配制成体积浓度为1~5％的溶液。
分别精密量取0.1mM DPPH溶液5.0mL和不同浓度样品溶液5.0mL置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95%乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟，于523nm处分别测定溶液吸光度值。另设一组分别精密量取DPPH溶液5.0mL和纯化水5.0mL混合，操作同上。DPPH清除率计算方法如下：
结果如表10所示。
由表中数据可知，在添加1%-5%的浓度梯度下，经植物乳杆菌发酵后，具有了较高的对DPPH自由基清除的能力，而不经发酵的生姜提取液，没有DPPH自由基清除能力，经菌种发酵后，DPPH自由基的清除能力有了大幅度的提高。
清除羟自由基试验
溶液的配制：
不同浓度样品溶液配制：以纯化水作为稀释液，分别将实施例中的样品S12及对比例中的样品C2配制成体积浓度为1~5％的溶液。
8.8mM的过氧化氢溶液：精确称取0.0997g 30%过氧化氢，用纯化水定容到100mL棕色容量瓶。
9mM的硫酸亚铁溶液：精确称取0.2502g硫酸亚铁，用纯化水定容到100mL棕色容量瓶。
9mM的水杨酸-乙醇溶液：精确称取0.1243g水杨酸，用无水乙醇定容到100mL棕色容量瓶
取试管若干只，加入9mM的硫酸亚铁溶液0.2mL，9mM的水杨酸-乙醇溶液0.2mL，样品溶液3mL，最后加入8.8mM的过氧化氢溶液0.25mL启动反应，37℃反应30min，以纯化水作为参比，在510nm处测定吸光值，考虑到样品本身的吸光值，以硫酸亚铁溶液、水杨酸-乙醇溶液、样品溶液和纯化水作为样品的本底吸收值。
按下式计算羟自由基清除率：
羟自由基清除率=1-（Ax-Ax0）/A0
其中，Ax为样品的吸光值。
Ax0为不加显色剂H2O2的吸光值。
A0为空白对照的吸光值。
结果如表11所示。
由表中数据可知，在添加1%-5%的浓度梯度下，样品S12和C2对羟自由基清除能力都很强，但经植物乳杆菌4-3-A发酵后的样品S12对羟自由基清除率有所提高。
对VEGF的作用
VEGF为血管内皮生长因子，主要作用是促进毛细血管的生成，VEGF含量增加，可以营养毛囊进一步达到固发的作用，样品促进VEGF含量增加可以达到一定的防脱发作用。
采用毛乳头细胞模型，用DHT刺激其生长因子VEGF的降低，考察样品是否能促进VEGF含量增加。
按合适的接种密度接种毛乳头细胞至6孔板中，37℃，CO2培养箱孵育过夜。
配液：按如下（表12）试验设计配置不同浓度的受试物。
DHT刺激：根据试验设计，待6孔板中细胞铺板率达到60%左右时，对有DHT刺激条件的组别进行DHT刺激1h。
给药：刺激结束后，根据试验设计进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。37℃、5%的CO2培养箱中孵育培养23h。孵育结束后，根据ELISA试剂盒的操作说明书进行检测分析。
结果分析：应用GraphPad Prism Program软件作图。
结果显示，与BC组相比，NC组的VEGF含量显著下降，说明本次试验刺激条件有效。与NC组相比，PC（米诺地尔）组的VEGF含量显著上升， 说明本次阳性对照检测有效。与NC组相比，样品S12在浓度为5%时对DHT刺激引起的VEGF分泌提升率为63.14%，VEGF含量显著上升，说明样品S12可以促进生长因子VEGF的增加，具有防脱发的作用，与NC组相比，样品C2在浓度为5%时对DHT刺激引起的VEGF分泌具有明显的提升作用，提升率为57.54%。
对基因DKK1表达量的作用
Dickkopf 1（DKK-1）为Wnt通路的一种负调控因子，通过抑制Wnt通路而达到抑制细胞增殖的作用，因此DKK1表达量减少，可以抑制脱发的发生。
按合适的接种密度接种毛乳头细胞至6孔板中，37℃，CO2培养箱孵育过夜。
配液：按如下（表13）试验设计配置不同浓度的受试物。
DHT刺激：根据试验设计，待6孔板中细胞铺板率达到60%左右时，对有DHT刺激条件的组别进行DHT刺激1h。
给药：刺激结束后，根据试验设计进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。37℃、5%的CO2培养箱中孵育培养24h。孵育结束后，收集细胞上清液，用1mL/孔 PBS 清洗两次，每孔加入 1mL RNAiso Plus，吹打 裂解细胞后，收样，提取 RNA，反转录至 cDNA 后，进行荧光定量 PCR 检测，采用 2 -△△CT方法进行结果计算。
Dickkopf 1（DKK-1）为Wnt通路的一种负调控因子，通过抑制Wnt通路而达到抑制细胞增殖的作用，因此DKK1表达量减少，可以抑制脱发的发生。
结果显示，与阴性对照组相比，样品C2在浓度为5%时对基因DKK1的表达量有明显的抑制作用，下调率为60.11%，而样品S12在浓度为5%时对基因DKK1的表达量有明显的抑制作用，下调率为72%。
对基因β-catenin表达量的作用
β-连环蛋白（β-catenin）是钙粘蛋白复合体的亚基，在Wnt信号途径中起细胞内信号转导的作用，其靶基因主要是调节细胞周期相关的一些蛋白如CyclinD1，从而促进细胞的增殖，因此β-catenin含量升高，会促进毛乳头细胞的增殖。
按合适的接种密度接种毛乳头细胞至6孔板中，37℃，CO2培养箱孵育过夜。
配液：按如下（表14）试验设计配置不同浓度的受试物。
DHT刺激：根据试验设计，待6孔板中细胞铺板率达到60%左右时，对有DHT刺激条件的组别进行DHT刺激1h。
给药：刺激结束后，根据试验设计进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。37℃、5%的CO2培养箱中孵育培养24h。孵育结束后，收集细胞上清液，用1mL/孔 PBS 清洗两次，每孔加入 1mL RNAiso Plus，吹打 裂解细胞后，收样，提取 RNA，反转录至 cDNA 后，进行荧光定量 PCR 检测，采用 2 -△△CT方法进行结果计算。
结果显示，样品C2在浓度为5%时基因β-catenin的表达量有明显的提升作用，上调率为 42.11%，样品S12在浓度为5%时基因β-catenin的表达量有明显的提升作用，上调率为70.42%。
序列表
<110> 华熙生物科技股份有限公司、华熙生物科技(天津)有限公司
<120> 一种植物乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1514
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum4-3-A CCTCC NO: M 2021186)
<400> 1
gtttgattct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgaacgaa 60
ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga tttacatttg agtgagtggc gaactggtga 120
gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg gggataacac ctggaaacag atgctaatac 180
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gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt ggggtaacgg ctcaccatgg caatgatacg 300
tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg 360
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agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa gaagaacata tctgagagta 480
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gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc 600
ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg 660
gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata 720
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aagtatgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc 840
taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa cgcattaagc attccgcctg 900
gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 960
agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atactatgca 1020
aatctaagag attagacgtt cccttcgggg acatggatac aggtggtgca tggttgtcgt 1080
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ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1380
cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa 1440
cacccaaagt cggtggggta accttttagg aaccagccgc ctaaggtggg acagatgatt 1500
agggtgaagt cgta 1514
Claims (17)
1.一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A，其特征是：保藏号为CCTCC NO:M 2021186。
2.一种菌剂，其特征是：包含权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A或权利要求2所述的菌剂在制备生姜发酵产品中的应用。
4.一种生姜发酵提取液的制备方法，其特征是：包括采用权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A对含生姜的生姜培养液进行发酵的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：所述生姜经打浆、酶解后加入生姜培养液中。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是：酶解所用的酶为纤维素酶和果胶酶中的一种或两种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：纤维素酶和果胶酶的质量比为0.1-10:1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：纤维素酶的酶活为1-2万U/g，果胶酶的酶活为5-7万U/g。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：酶解pH为5.0~5.5，酶解温度为45-55℃；酶的用量为生姜质量的0.03-0.3wt%。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A在生姜培养液中的接种量为0.5-2体积%，发酵温度为30-37℃，摇床转速为120-160rpm，发酵至pH不变时停止发酵。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的制备方法，其特征是：生姜培养液中除了生姜浆外，还含有氮源、碳源和无机盐。
12.根据权利要求4-10中任一项所述的制备方法，其特征是：生姜在生姜培养液中的质量百分含量为10-30wt%，氮源在生姜培养液中的质量百分含量为0.1-2.5wt%，碳源在生姜培养液中的质量百分含量为0.1-2wt%，无机盐在生姜培养液中的质量百分含量为0.02-0.8wt%。
13.根据权利要求4-10中任一项所述的制备方法，其特征是：在发酵的同时加入酶进行酶解，所述酶为果胶酶和纤维素酶中的一种或两种，纤维素酶和果胶酶的质量比为0.1-10:1，纤维素酶的酶活为1-2万U/g，果胶酶的酶活为5-7万U/g。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征是：发酵时酶的添加量为加入生姜质量的0.03-0.3 wt%。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将生姜打浆，所得生姜浆与水混合，得到混悬液，调节混悬液pH，加入酶进行酶解；
（2）将酶解后的混悬液、氮源、碳源、无机盐和水混合，配成含生姜的生姜培养液；
（3）将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）4-3-A、酶和含生姜的生姜培养液混合，发酵至pH不再变化，得发酵液；
（4）将发酵液除杂、除菌，得到生姜发酵提取液。
16.按照权利要求4-15中任一项所述的生姜发酵提取液的制备方法制得的生姜发酵提取液。
17.权利要求16所述的生姜发酵提取液在制备化妆品中的应用。
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