CN111808769B - 一种短乳杆菌及其在西柚发酵和化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种短乳杆菌及其在西柚发酵和化妆品中的应用，以自行筛选的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）L‑Z‑5对西柚进行发酵，结合特殊的发酵方法，所得西柚发酵提取液具有良好的抗炎、抗氧化、美白功效，在化妆品中有很好的应用前景。

Description

一种短乳杆菌及其在西柚发酵和化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及一种新型的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5，还涉及该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5在西柚发酵中的应用以及所得的西柚发酵产品在化妆品中的应用，属于生物发酵技术领域。
技术背景
西柚，又称葡萄柚，原产于西印度群岛，属芸香科柑桔属植物，由橙和柚天然杂交而成，果肉分白色、红色、粉红色3种，其主产国为美国、以色列、阿根廷、南非，美国的产量居全世界之首。我国近些年才开始引种，它集柚子和甜橙优点于一身，果实多具特殊香气，果肉柔嫩，味偏酸、带苦味及麻舌味，但口感舒适，具有较高的营养价值和药用价值，深受国内老百姓的喜爱。李时珍在《本草纲目》中记载：“柚，功能消食，解酒毒，去肠胃中恶气，长发滋燥，疗妊妇不思食口淡”。柚中含有多种对人体健康有益的活性物质，如黄酮类化合物、柠檬苦素类化合物和精油等。现代医学研究表明，柚皮提取物具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗衰老、抑酶、降血糖和降血压等多种功能活性。
迄今为止，关于发酵柚子的研究较多，如中国专利CN201611083380.5公开了一种美容养颜的柚子果醋及其在化妆品中的应用，将去皮得到的柚子果浆经过酶解，加入食用酒精，再经过浸提压榨处理后，接入醋酸菌进行二级发酵，得到的滤液即为柚子果醋，可饮用及应用到化妆品中。
中国专利CN201611083386.2公开了一种抗衰老柚子保健果酒及其在化妆品中的应用，将新鲜柚子去皮打成果浆，加入柚苷酶脱苦，再混入双孢蘑菇菌丝粉末，搅拌均匀后加入酵母菌发酵，结束后经过处理、过滤、灭菌，即获得柚子果酒，可作为一种功效添加剂应用在化妆品中，起到营养滋润、美容功能。
中国专利CN201710816592.8公开了一种美容综合酵素饮品及其制备方法，将葡萄柚等水果蔬菜分别单独经过酵母菌、醋酸菌二次发酵后调配制得，一方面促进了水果蔬菜中原有有效成分的析出，另一方面水果蔬菜经微生物发酵转化成其他功能因子。
中国专利CN108852957A公开了一种保湿、美白、消炎、抗痘酵素面膜及其制备方法，采用西柚皮、橘子皮、香蕉皮、金银花、菊花叶、玫瑰花、金盏花、薄荷及马齿苋为原料，酶解后，接入酵母菌和乳酸菌的一种或者几种发酵制成水果皮酵素和花草药物酵素，再与增稠剂、成膜剂及生物防腐剂按一定的比例混合搅拌均匀制得保湿、美白、消炎、抗痘酵素面膜。此发明使用的原料较多，菌种不固定，批次间可能差异性较大，且没有提供有效的功效数据，没有将发酵前后功效进行对比。
上饶师范学院对马家柚果酒进行了研究，确定了最佳发酵工艺，并对比了发酵前后抗氧化活性，马家柚果汁、马家柚果酒及添加马家柚叶芽的果酒对O2 -的清除率最高分别为26.6％、34.5％和43.0％，对H2O2的清除率最高分别为21.7％、29.0％和37.6％。
综上所述，目前市场上的西柚类的发酵产品主要存在以下不足：
1.原料主要来源是去皮的西柚，而有着丰富植物黄酮的皮被直接废弃掉；
2.西柚类发酵原料主要应用于食品领域，化妆品领域涉及到的也多为美容饮品；
3.多数西柚类发酵产品常采用食品领域评价手段仅从外观状态、口感等为导向来评价发酵过程，而忽略了最为重要的以产品的化妆品功效来指导发酵过程，多数西柚类发酵产品缺少产品功效数据，而这些是应用到化妆品领域十分重要因素；
4.已有西柚类发酵专利大都采用多步发酵、混合发酵，中间过程难以控制导致工艺难以放大，产品稳定性难以保证，另一方面，发酵周期普遍较长，效率不高。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明筛选得到了一株性能优异的短乳杆菌，使用这株短乳杆菌制备西柚发酵提取液，生产周期短、产品稳定，且活性物质含量高、安全健康符合化妆品原料的要求。所得西柚发酵提取液具有良好的抗氧化、美白、抗炎效果。
本发明从泡菜中经过自行筛选得到了一株发酵性能优异的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5，已于2020年6月17日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M 2020211。该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5的16s DNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明上述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)命名为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)L-Z-5，可以用于西柚发酵产品的制备，既可以用于发酵西柚皮，也可以用于发酵西柚果肉，发酵得到的西柚产品中有机酸和氨基酸种类和含量多，与现有其他短乳杆菌(Lactobacillus brevis)相比具有更好的抗炎、美白和抗氧化效果，性能突出。
进一步的，该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5在使用时，可以通过培养基进行扩大培养，以得到所需数量的菌种，其最佳培养温度为30℃-37℃。在本发明某一具体实施方式中，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5菌种通过液体的种子培养基进行扩大培养，扩大培养后离心去除上清液，得到短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5菌种；优选的，种子培养基的配方为：碳源2-5wt％、氮源1.5-3wt％、无机盐0.2-0.7wt％，水余量。所述碳源为微生物培养常用碳源，如果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糊精等，所述氮源为微生物培养常用氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、黄豆粉等，所述无机盐为磷酸氢二钾、硫酸锰等。
本发明提供了一种西柚发酵提取液的制备方法，该方法包括采用上述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5发酵西柚果浆的步骤。
进一步的，上述方法包括以下步骤：
(1)将西柚打浆，所得果浆静置，自然发酵至pH不再变化；
(2)将上述自然发酵后的果浆、氮源、碳源、无机盐和水混合，配成含果浆的培养液；
(3)将短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5和酶加入上述含果浆的培养液中，发酵至pH不再变化，得发酵液；
(4)将发酵液除杂、除菌，得到西柚发酵提取液。
进一步的，步骤(1)中，以整个西柚为原料，在打浆之前，可以将西柚进行清洗的预处理，洗干、晾干的西柚可以采用榨汁机等器械进行打浆，所得果浆利用其内生菌进行自然发酵。静置的温度为15～25℃，自然发酵至pH不再变化时停止自然发酵，所需时间一般为1～3d。
进一步的，自然发酵后的果浆进一步与氮源、碳源、无机盐等进行混合，配成用于短乳杆菌发酵的含果浆的培养液。培养液中的自然发酵后的果浆、氮源、碳源、无机盐、水的混合顺序随意，可以先将自然发酵后的果浆与水混合，再加入氮源、碳源、无机盐，也可以先将氮源、碳源、无机盐加入水中，再加入自然发酵后的果浆，还可以将自然发酵后的果浆、氮源、碳源、无机盐同时加入水中。优选的，先将氮源、碳源、无机盐加入水中，灭菌后再加入自然发酵后的果浆，这样既能保护果浆中的营养成分不受破坏，又能灭除杂菌，降低染菌概率，保证纯种发酵，稳定产品质量。灭菌可以采用现有技术中报道的各种可行的灭菌方式，例如湿热灭菌等。
进一步的，步骤(2)中，在配好的含果浆的培养液中，自然发酵后的果浆的质量百分含量为10-30％，氮源的质量百分含量为0.1-2％，碳源的质量百分含量为0.1-2％，无机盐的质量百分含量为0.02-0.2％。其中，所述氮源为微生物培养常用氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、大豆肽粉等，所述碳源为微生物常用碳源，如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糊精等，所述无机盐为磷酸氢二钾、硫酸锰等。
进一步的，步骤(3)中，短乳杆菌加入含果浆的培养液中用于进一步发酵，酶加入含果浆的培养液中用于对果浆中的果胶和纤维素进行酶解，以充分释放出有效成分。短乳杆菌和酶的加入顺序无特别要求，可以先配好含果浆的培养液，然后再加入短乳杆菌和酶，也可以先加入酶或短乳杆菌，再配成含果浆的培养液，还可以同时加入短乳杆菌和酶然后再配成含果浆的培养液。
进一步的，步骤(3)中，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5菌种的接种量(以短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5细胞计)为含果浆的培养液的0.5-1wt％。短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5菌种可以通过上述扩大培养的方式得到足够量的菌种。
进一步的，步骤(3)中，所述酶为纤维素酶和果胶酶，优选的，纤维素酶的酶活为5-10万U/g，果胶酶的酶活为10-20万U/g。在此酶活下，纤维素酶和果胶酶的添加量均为自然发酵后的果浆质量的0.002-0.2wt％，纤维素酶和果胶酶的添加量比例为1:100-100:1。
进一步的，步骤(3)中，接入菌种后，在30-37℃进行发酵培养，同时进行酶解，发酵至pH不变时结束。一般发酵时间为40～48h。
进一步的，步骤(4)中，发酵所得发酵液通过过滤、离心等方式除杂、除菌。
进一步的，按照本发明方法制得的西柚发酵提取液中无机酸和氨基酸含量高、种类多，与采用其他方法发酵得到的提取液相比抗炎、抗氧化、美白作用更佳，对IL-6、TNF-α、IL-1β三种炎性因子均具有良好的抑制作用。因此，本发明所得的西柚发酵提取液可以用于化妆品中，作为化妆品的抗炎、抗氧化或美白成分。
本发明具有以下优点：
1、本发明提供的西柚发酵提取液制备方法基于传统发酵技术进行改进，先通过西柚内生菌自然发酵将西柚中不溶性的蛋白等大分子物质转化成了可溶性小分子氨基酸等，再通过本发明特殊的短乳杆菌发酵，可产生γ-氨基丁酸、有机酸等多种活性成分，所得发酵液的抗炎、抗氧化、美白效果更佳；
2、未经发酵的西柚只对炎性因子IL-1β有抑制作用，对炎性因子IL-6、TNF-α无抑制作用，经本发明发酵后，发酵液对IL-6、TNF-α、IL-1β炎性因子均有良好的抑制作用，且对IL-1β抑制作用大大提高；
3、本发明将整个西柚进行液体发酵，以发酵提取液作为最终产品，可将西柚原料及西柚发酵液全部充分利用，工艺简单，操作简便，成本低，能实现大规模生产。
保藏信息
本发明所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020211，保藏日期为2020年6月17日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
称取1-5万U/g的纤维素酶和10-20万U/g的果胶酶分别配制成纤维素酶液和果胶酶酶液，酶液中纤维素酶活力为5万U/mL，果胶酶活力为10万U/mL，供实施例与对比例中使用，纤维素酶和果胶酶为市购。
实施例1短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5筛选及鉴定过程
以市售泡菜汁、干酪、酸乳酒和牛奶为原料，将市售泡菜汁、酸乳酒和牛奶用无菌水稀释100倍，将干酪用100质量倍无菌水分散，用涂布器将各溶液均匀涂布在含0.04％溴甲基酚紫的MRS平板上，于37℃培养箱中静置培养1～2d，挑选菌落周围培养基颜色变为黄色的单菌落，接种于MRS试管斜面上，于37℃培养箱中静置培养1～2d，菌体长好后，于4℃冰箱保藏。其中，泡菜汁筛选得到的菌种命名为L-Z-5，干酪筛选得到的菌种命名为L-Z-101，酸乳酒筛选得到的菌种命名为L-Z-1.3，牛奶筛选得到的菌种命名为L-Z-1.1。
将筛选得到的四株菌种送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因组测序鉴定，结果显示这四株菌种均为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，其中短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5的16s rDNA基因序列测定结果如SEQ ID NO：1所示。
实施例2菌种的扩大培养
对上述自行筛选得到的短乳杆菌L-Z-5、L-Z-101、L-Z-1.3以及L-Z-1.1进行扩大培养，以用于后续实验。方法如下：
从试管挑取短乳杆菌L-Z-5、L-Z-101、L-Z-1.3和L-Z-1.1，分别接种于500mL含有葡萄糖2wt％、蛋白胨1wt％、酵母粉1wt％、磷酸氢二钾0.2wt％、硫酸锰0.02wt％的无菌种子培养液中，37℃下静置培养13h，至对数生长期，再次接种扩培到5L无菌种子培养液中，二次培养10h后至对数期，以8000rpm离心30min后弃掉上清液，获得上述四种短乳杆菌鲜细胞。
实施例3
将整个西柚洗净、晾干后，经粉碎机打成浆状，得到西柚果浆。将西柚果浆20℃下静置2d，利用其内生菌自然发酵，pH不再变化后，取20kg果浆加入到100L灭菌冷却至室温的培养液中混匀，培养液中含1wt％蛋白胨，1wt％蔗糖，0.1wt％磷酸氢二钾。将实施例2中的短乳杆菌L-Z-5菌体接入，接种量为1wt％，同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质量的0.1wt％)和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.1wt％)，32℃发酵44h，pH不再变化后，发酵结束，获得发酵液。发酵液以3000rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤，得西柚发酵提取液S1。
实施例4
将整个西柚洗净，晾干后，经粉碎机打成浆状，得到西柚果浆。将西柚果浆15℃下静置3d，利用其内生菌自然发酵，pH不再变化后，取20kg果浆加入到100L灭菌冷却至室温的培养液中混匀，培养液中含2wt％大豆肽粉，0.1wt％葡萄糖，0.2wt％磷酸氢二钾。将实施例2中的短乳杆菌L-Z-5菌体接入，接种量为0.5wt％，同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质量的0.2wt％)和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.002wt％)，37℃发酵42h，pH不再变化后，发酵结束，获得发酵液。发酵液以3000rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤，得西柚发酵提取液S2。
实施例5
将整个西柚洗净，晾干后，经粉碎机打成浆状，得到西柚果浆。将西柚果浆25℃下静置1d，利用其内生菌自然发酵，pH不再变化后，取10kg果浆加入到100L灭菌冷却至室温的培养液中混匀，培养液中含0.1wt％酵母粉，2wt％果糖，0.02wt％硫酸锰。将实施例2中的短乳杆菌L-Z-5菌体接入，接种量为0.8wt％，同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质量的0.002wt％)和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.2wt％)，30℃发酵48h，pH不再变化后，发酵结束，获得发酵液。发酵液以3000rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤，得西柚发酵提取液S3。
实施例6
将整个西柚洗净，晾干后，经粉碎机打成浆状，得到西柚果浆。将西柚果浆20℃下静置2d，利用其内生菌自然发酵，pH不再变化后，取30kg果浆加入到100L灭菌冷却至室温的培养液中混匀，培养液中含1wt％牛肉膏，1.5wt％麦芽糊精，0.05wt％硫酸锰。将实施例2中的短乳杆菌L-Z-5菌体接入，接种量为1wt％，同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质量的0.15wt％)和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.1wt％)，35℃发酵40h，pH不再变化后，发酵结束，获得发酵液。发酵液以3000rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤，得西柚发酵提取液S4。
对比例1
将整个西柚洗净，晾干后，经粉碎机打成浆状，得到西柚果浆。取2kg果浆，加入到10L灭菌冷却至室温的无菌水中混匀，同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质量的0.1wt％)和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.1wt％)，32℃反应44h，获得酶解液。酶解液以3000rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤，得西柚提取液C1。
对比例2
将实施例2中的短乳杆菌L-Z-5菌体接入含1wt％蛋白胨，1wt％蔗糖，0.1wt％磷酸氢二钾的无菌培养基中，32℃发酵44h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液。发酵液以3000rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤，得L-Z-5菌种发酵提取液C2。
对比例3
按照实施例3的方法制备西柚发酵提取液，不同的是：将短乳杆菌L-Z-5菌体替换为短乳杆菌L-Z-101菌体，所得西柚发酵提取液命名为西柚发酵提取液C3。
对比例4
按照实施例3的方法制备西柚发酵提取液，不同的是：将短乳杆菌L-Z-5菌体替换为短乳杆菌L-Z-1.3菌体，所得西柚发酵提取液命名为西柚发酵提取液C4。
对比例5
按照实施例3的方法制备西柚发酵提取液，不同的是：将短乳杆菌L-Z-5菌体替换为短乳杆菌L-Z-1.1菌体，所得西柚发酵提取液命名为西柚发酵提取液C5。
试验例1有机酸含量检测
以采用GB/T 12456中方法测定上述实施例和对比例所得样品的总酸含量，结果如表1所示。
表1不同样品中总酸含量对比
发酵提取液 酸度(％)
C1 0.21
C2 0.89
C3 0.92
C4 0.95
C5 0.88
S1 1.19
S2 1.15
S3 1.21
S4 1.12
从表中可以看出，本发明制备的西柚发酵提取液中的有机酸含量明显高于传统提取法获得的样品，本发明菌种发酵所得的有机酸含量明显高于其他同类型菌种，有机酸在化妆品中具有美白、焕肤、祛角质等作用，而且有机酸产量越多，证明菌种对西柚发酵越充分。
试验例2氨基酸含量检测
以实施例3中的样品S1与对比例中的样品C1为实验样品，采用HPLC柱前衍生化法测定样品中游离氨基酸含量，结果如表2所示。
表2不同样品中氨基酸含量对比
氨基酸 C1(mg/mL) S1(mg/mL)
天冬氨酸 0.045 0.009
谷氨酸 0.025 0.085
丝氨酸 0.019 0.042
组氨酸 - 0.048
甘氨酸 0.001 0.018
苏氨酸 0.001 0.010
精氨酸 0.033 -
丙氨酸 0.011 0.019
酪氨酸 - 0.041
胱氨酸 - -
缬氨酸 - 0.016
甲硫氨酸 0.004 0.135
甲苯氨酸 - 0.077
异亮氨酸 - 0.164
亮氨酸 0.001 -
赖氨酸 0.001 -
脯氨酸 0.037 0.072
从上表结果来看，经本发明菌种发酵后的西柚发酵提取液与传统提取法所得西柚提取液相比，绝大多数游离氨基酸含量都增加，且游离氨基酸种类增加。
试验例3抗炎、抗氧化、美白效果评价
本试验旨在对上述实施例及对比例制得的样品进行抗炎、抗氧化、美白效果评价。
1.抗炎活性
采用小鼠巨噬细胞模型，用LPS刺激其产生炎性因子，考察样品是否能抑制炎性因子的分泌。
样品溶液的配制：以(sigma，025M4040V，1万单位/mL)LPS作为稀释液，分别将实施例中的样品S1～S4及对比例中的样品C1～C5配制成体积浓度为3％的溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
空白对照组：将Raw264.7细胞以1×105个/mL接种于24孔板，在37℃、5％CO2条件下培养24h，加入无血清培养基，继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。
模型组：将Raw264.7细胞以1×105个/mL接种于24孔板，在37℃、5％CO2条件下培养24h，加入与空白对照组无血清培养基等体积的LPS(sigma，025M4040V，1万单位/mL)，继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。
实验组：将Raw264.7细胞以1×105个/mL接种于24孔板，在37℃、5％CO2条件下培养24h，加入与空白对照组无血清培养基等体积的样品溶液，继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。
计算各样品对炎性因子的抑制率，计算方法如下：
Figure BDA0002573324890000091
试验结果如下：
表3各样品对IL-6分泌的抑制作用
IL-6浓度(pg/mL) 抑制率(％)
C1 142.86 -56.83
C2 101.21 -1.07
C3 115.33 -19.97
C4 172.54 -96.56
C5 122.18 -29.14
S1 55.71 59.84
S2 56.97 58.15
S3 60.02 54.07
S4 61.38 52.25
空白对照组 25.71 --
模型组 100.41 --
表4各样品对TNF-α分泌的抑制作用
Figure BDA0002573324890000092
Figure BDA0002573324890000101
表5各样品对IL-1β分泌的抑制作用
IL-1β浓度(pg/mL) 抑制率(％)
C1 18.02 29.25
C2 22.01 -2.90
C3 16.21 43.84
C4 18.35 26.60
C5 13.97 61.89
S1 13.58 65.03
S2 13.69 64.14
S3 13.71 63.98
S4 13.71 63.98
空白对照组 9.24 --
模型组 21.65 --
从上述结果来看，在LPS的刺激下，小鼠巨噬细胞的IL-6、TNF-α、IL-1β这三种促炎性因子的分泌量有所增加，经过各样品处理之后，与未经西柚样品处理的LPS模型组相比，IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌量有不同程度的变化，说明样品对IL-6、TNF-α、IL-1β具有抑制作用。
其中，未经过发酵的西柚提取液C1只对IL-1β的分泌有抑制作用，且抑制率仅为29.25％，经过L-Z-5发酵但是没有西柚做底物的L-Z-5发酵液C2对三种促炎性因子的分泌均无抑制作用，采用其他不同短乳杆菌发酵得到的西柚提取液C3-C5也只对IL-1β的分泌有明显的抑制作用。而经过本发明短乳杆菌L-Z-5发酵的西柚提取液S1-S4不仅对IL-1β的分泌有明显的抑制作用，对IL-6、TNF-α的分泌也产生明显的抑制作用。由此可以看出，不同的处理方法、不同的菌株对这三种炎性因子的抑制作用不同，不是所有的菌株发酵西柚后都能对这三种炎性因子都有良好的抑制作用。
2.抗氧化活性
2.1清除DPPH自由基试验
0.1mM DPPH溶液配制：精密称取4.0mg DPPH置100mL棕色容量瓶中，用95％乙醇溶解并定容。
不同浓度样品溶液配制：以纯化水作为稀释液，分别将实施例中的样品S1～S4及对比例中的样品C1～C5配制成体积浓度为1～5％的溶液。
分别精密量取0.1mM DPPH溶液5.0mL和不同浓度样品溶液5.0mL置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95％乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟，于523nm处分别测定溶液吸光度值。另设一组分别精密量取DPPH溶液5.0mL和纯化水5.0mL混合，操作同上。计算方法如下：
Figure BDA0002573324890000111
结果如表6所示。
表6各样品清除DPPH自由基活性
Figure BDA0002573324890000112
由表中数据可知，在添加1％-5％的浓度梯度下，各样品均具有较高的清除DPPH自由基的能力，除了C2和C3外，其他样品在5％浓度时的DPPH自由基清除能力相当，但在较低的浓度时，S1-S4的样品表现出更好的DPPH自由基清除能力。
2.2活性氧自由基清除试验
样品溶液的配制：以无血清DMEM培养液作为稀释液，分别将实施例中的样品S1～S4和对比例中的样品C1～C5配制成体积浓度为1％～5％的溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针溶液的配制：按0.375uL DCFH-DA:1mL PBS比例稀释。
取处于对数生长期的HaCaT细胞，以5×104个/mL密度接种于12孔培养板，每孔2mL细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养24h。照射组弃去1mL培养液，盖保鲜膜，UVA用2000μW/cm2的强度照射2-3h，UVB用700μW/cm2的强度照射7min，对照组常规培养。照射后弃去旧培养液，实验组加入样品溶液，对照组加入无血清培养液，每孔均为2mL，继续培养16h后，弃去全部培养液，用PBS洗两遍。每孔加入1.5mL DCFH-DA溶液，放入细胞培养箱中继续孵育30min，每隔5min混匀一次使探针充分结合。弃去探针，用预热的无血清培养基洗两遍，每孔加入1ml无血清培养基37℃孵育10min。PBS洗一遍后，胰酶消化细胞，PBS洗两遍，300μL PBS重悬，用流式细胞仪双通道检测(上机前细胞需要过滤)，FL1-H通道，每个样品收集10000个细胞。
根据1通道(FL1-H)获取的信号数据，用平均荧光强度(GMEAN)计算ROS清除率，方法如下：
Figure BDA0002573324890000121
统计学分析采用SPSS 19.0软件，进行配对t检验。结果如表7所示。
表7各样品对活性氧自由基(ROS)的清除率
Figure BDA0002573324890000122
由表中数据可知，在添加1％-5％的浓度梯度下，样品S1～S4和C1、C3～C5均对活性氧自由基具有清除能力，但本发明样品清除率明显高于其他样品。
3.美白
样品溶液的配制：以含血清完全培养液作为稀释液，分别将实施例中的样品S1～S4及对比例中的样品C1～C5配制成体积浓度为2％的溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
取对数生长期B16小鼠黑色素瘤细胞，以2×104个/mL密度接种于6孔培养板，每孔3mL，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养24h，弃去旧培养液，正常对照组和模型组加入3mL含血清培养液，实验组加入3mL样品溶液，模型组和实验组每孔再加入60μL毛喉素溶液(2mM)，以刺激黑色素的产生，继续培养72h。
细胞内黑色素含量的测定方法如下：胰酶消化，离心去上清，加入1mol/L(含10％DMSO)的NaOH溶液500uL裂解细胞，80℃加热30min后，3000rpm离心10min，取上清加入96孔板，100uL/孔，测定450nm吸光度。
黑色素总含量抑制率计算方法如下。
Figure BDA0002573324890000131
表8各样品对黑色素含量的影响
样品 黑色素总含量抑制率/％
C1 5.34
C2 1.32
C3 10.09
C4 11.54
C5 9.15
S1 27.35
S2 25.94
S3 27.98
S4 25.49
从表中结果可以看出，本发明的样品对黑色素总含量抑制率大大提高，美白效果明显，而其他样品的黑色素抑制率不明显。
序列表
<110> 华熙生物科技股份有限公司、山东华熙海御生物医药有限公司
<120> 一种短乳杆菌及其在西柚发酵和化妆品中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 短乳杆菌(Lactobacillus brevisL-Z-5)
<400> 1
tcaggacgaa cgctggcggc atgcctaata catgcaagtc gaacgagctt ccgttgaatg 60
acgtgcttgc actgatttca acaatgaagc gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga 120
aatctgccca gaagcagggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt ataacaacaa 180
aatccgcatg gattttgttt gaaaggtggc ttcggctatc acttctggat gatcccgcgg 240
cgtattagtt agttggtgag gtaaaggccc accaagacga tgatacgtag ccgacctgag 300
agggtaatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta 360
gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaatg ccgcgtgagt gaagaagggt 420
ttcggctcgt aaaactctgt tgttaaagaa gaacaccttt gagagtaact gttcaagggt 480
tgacggtatt taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540
ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc 600
tgatgtgaaa gccttcggct taaccggaga agtgcatcgg aaactgggag acttgagtgc 660
agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac 720
cagtggcgaa ggcggctgtc tagtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc 780
gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttggagg 840
gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg 900
caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960
attcgaagct acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ttctgccaat cttagagata 1020
agacgttccc ttcggggaca gaatgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080
gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tatcagttgc cagcattcag 1140
ttgggcactc tggtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1200
catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac aacgagtcgc 1260
gaagtcgtga ggctaagcta atctcttaaa gccgttctca gttcggattg taggctgcaa 1320
ctcgcctaca tgaagttgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac ccaaagccgg 1440
tgagataacc ttcgggagtc agccgtctaa ggtgggacag atgattaggg tgaagtcgta 1500

Claims (15)

1.一种短乳杆菌（Lactobacillus brevis）L-Z-5，其特征是：保藏号为CCTCC NO: M2020211。
2.一种权利要求1所述的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）L-Z-5 CCTCC NO: M2020211在制备西柚发酵产品中的应用。
3.一种西柚发酵提取液的制备方法，其特征是：包括采用权利要求1所述的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）L-Z-5 CCTCC NO: M 2020211发酵西柚果浆的步骤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将西柚打浆，所得果浆静置，自然发酵至pH不再变化；
（2）将上述自然发酵后的果浆、氮源、碳源、无机盐和水混合，配成含果浆的培养液；
（3）将短乳杆菌（Lactobacillus brevis）L-Z-5 CCTCC NO: M 2020211和酶加入上述含果浆的培养液中，发酵至pH不再变化，得发酵液；
（4）将发酵液除杂、除菌，得到西柚发酵提取液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，发酵温度为15~25℃；步骤（3）中，发酵温度为30-37℃。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，自然发酵后的果浆在含果浆的培养液中的质量百分含量为10-30wt%，氮源在含果浆的培养液中的质量百分含量为0.1-2wt%，碳源在含果浆的培养液中的质量百分含量为0.1-2wt%，无机盐在含果浆的培养液中的质量百分含量为0.02-0.2wt%。
7.根据权利要求4或6所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，所述氮源为微生物培养常用氮源，所述碳源为微生物培养常用碳源，所述无机盐为磷酸氢二钾或硫酸锰；步骤（3）中，所述酶为纤维素酶和果胶酶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，所述氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母粉或大豆肽粉，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糊精或果糖。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，纤维素酶的酶活为5-10万U/g，果胶酶的酶活为10-20万U/g。
10.根据权利要求7或9所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，纤维素酶和果胶酶的添加量均为自然发酵后的果浆质量的0.002-0.2%；短乳杆菌（Lactobacillus brevis）L-Z-5菌种的接种量为含果浆的培养液的0.5-1 wt %。
11.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：短乳杆菌（Lactobacillus brevis）L-Z-5菌种通过液体的种子培养基进行扩大培养，扩大培养后离心去除上清液，得到短乳杆菌（Lactobacillus brevis）L-Z-5菌种。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征是：种子培养基的配方为：碳源2-5 wt %、氮源1.5-3 wt %、无机盐0.2-0.7 wt %，水余量。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征是：所述碳源为果糖、蔗糖、麦芽糊精或葡萄糖，所述氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母粉或黄豆粉，所述无机盐为磷酸氢二钾或硫酸锰。
14.按照权利要求3-13中任一项所述的西柚发酵提取液的制备方法制得的西柚发酵提取液。
15.权利要求14所述的西柚发酵提取液在制备化妆品中的应用，其特征是：所述西柚发酵提取液为化妆品的抗炎、抗氧化或美白成分。
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