CN107058161B - 具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101、其筛选方法及应用 - Google Patents

具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101、其筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101，它是从我国云南大理传统发酵乳制品中分离筛选出来的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.11772。本发明依次通过样品的采集、富集、分离、纯化、鉴定等实验，最终筛选出高加索酸奶乳杆菌JMCC0101，该菌具有很好的耐酸耐胆盐特性、抗氧化能力、良好的存活性能、弱后酸和发酵风味，该高加索酸奶乳杆菌JMCC0101应用于制备益生菌菌粉或乳酸菌饮料。

Description

具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101、其筛选方法 及应用
技术领域
本发明属于微生物工程领域，涉及一种乳杆菌，具体涉及一种具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101，同时，本发明还涉及该乳杆菌的筛选方法及应用。
背景技术
目前我国规定可用于食品的益生菌仅有双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌。开菲尔发酵乳具有众多的益生功能，开菲尔粒含多种生理性有益菌，黏附定植于肠道中与病原菌竞争黏附位点、营养物质，代谢产物乳酸、醋酸降低肠道pH值；产生的抑菌物质过氧化氢、细菌素等。作为开菲尔发酵乳中的微生物成份，高加索酸奶乳杆菌具有很好的作为益生菌的潜力，由于具有益生功能的开菲尔发酵乳由于其生产步骤繁琐、易导致污染且生产批次间差异较大。因此开发一株具有良好益生特性的菌株有着非常重要的现实意义。研究表明，氧化反应是人体衰老机能衰退的一大诱因，因此开发一款具有能够抗氧化能力的益生菌是具有重要意义的。
发明内容
本发明的目的是提供一株高加索酸奶乳杆菌JMCC0101，该菌株是从我国云南大理传统发酵乳制品中分离筛选而来，是一株具有很好的耐酸耐胆盐特性、抗氧化能力、良好的存活性能、弱后酸和发酵风味的菌株。
本发明的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101，已于2015年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.11772，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的另一个目的是提供高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的筛选方法，依次通过样品的采集、富集、分离、纯化、鉴定、保存等实验，最终筛选出高加索酸奶乳杆菌JMCC0101。
本发明还有一个目的是提供了高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的应用，高加索酸奶乳杆菌JMCC0101应用于制备益生菌菌粉或乳酸菌饮料。
为实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案是：
一种高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)JMCC0101，它是从我国云南大理传统发酵乳制品中分离筛选出来的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.11772。
进一步的，其16SrRNA的基因序列如下：
CCATCTCCTGATCACCTTAGACGGCTGGTCCCCGAAGGTTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCCTGGTAAGGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGATCTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCATTTAAATGCAAGCATCTAAAATCAATAACGGAAACGCGTTCGACTTGCATGTATAGCACGCCGCACAGTCA。
进一步的，其pheS的基因序列如下：
CAAACCTCACCAATGCAGGCTCGTACTTTGGAAAAGCATGATTTCTCAAAGGGACCTTTGAAGATGATCTCACCAGGAATCGTTTACCGTCGTGATACTGATGATCCAACCCATTCACATCAATTCCATCAGGTTGAAGGACTCTTTATTGATGAGCACGTGACAATGGCTGATTTAAAGGGAACTTTGATTACCATGGCTCAAAACATTTTTGGCAATAAATTTGATATTCGTTTACGACCAAGTTATTTCCCATTTACCGAACCTTCTGTTGAAGTGGATGTTACCTGCTTTAACTGTATGGGAAAGGGTTGTGACGTCTGCAAACATACCGGCTGGATTGAAGTCTTAGGTGCCGGCATGGTTCATCCTAATGTGCTCGATATGGCTGGCGTTGATTCAAAGAAGTATGGCG。
本发明的所述的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的筛选方法，按以下步骤顺序进行：
①样品采集
取25mL云南大理传统的发酵乳制品，加入到250mL生理盐水中，充分混匀，得到样品；
②样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株的分离、纯化；
a、菌株分离
取培养液1mL，用0.9％(重量与体积的百分比)无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取MRS琼脂培养基，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h(H2：CO2：N2＝5：10：85)，观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
b、菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
④菌株的鉴定
将上述菌株进行革兰氏染色、显微镜下观察为革兰氏阳性、杆状菌株，然后通过DNA提取、PCR扩增，16SrRNA基因序列，pheS基因序列等实验数据综合分析，鉴定结果为高加索酸奶乳杆菌；
⑤菌株的保存
将菌落培养物置于无菌的20％甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
进一步的，步骤②中LC液体培养基由以下成分组成：
蛋白胨：10g，酵母膏：1g，牛肉膏：4g，K2HPO4：2g，乙酸钠：3g，柠檬酸铵：1g，MgSO4·7H2O：0.2g，MnSO4·7H2O：0.05g，干酪素酸性水解物：1g，吐温-80：1g，蒸馏水：1000mL；
该培养基调节pH6.0±0.1。
进一步的，步骤③中MRS琼脂培养基由以下成分组成：
酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸钠：5g；柠檬酸二胺：2g；吐温-80：1g；K2HPO4：2g；MgSO4·7H2O：0.2g；MnSO4·7H2O：0.05g；琼脂：15g；蒸馏水：1000mL；
该培养基调节pH6.8±0.1。
本发明采用的菌株具有很好的抗氧化作用，因此具有很好的抗衰老的作用。
所述高加索酸奶乳杆菌JMCC0101应用于制备益生菌菌粉或乳酸菌饮料。
进一步的，上述的益生菌菌粉由以下重量百分含量的原料制成：
高加索酸奶乳杆菌JMCC0101 2％-4％，植物乳杆菌2％-4％、嗜酸乳杆菌0.5％-1.5％、乳双歧杆菌0.5％-1.5％、干酪乳杆菌1％-2％，低聚果糖70％-90％、草莓提取物9％-11％。
进一步的，上述的乳酸菌饮料由以下重量份数的原料制成：
纯牛奶40-60份，水20-40份，蔗糖3-6份，105-107cfu/ml的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101，105-107cfu/ml cfu/ml的副干酪乳杆菌，105-107cfu/ml cfu/ml的嗜热链球菌。
具体实施方式
实施例1高加索酸奶乳杆菌JMCC0101及其筛选方法
一种高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)JMCC0101，它是从我国云南大理传统发酵乳制品中分离筛选出来的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.11772。
所述的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的筛选方法，按以下步骤顺序进行：
①样品采集
取25mL云南大理传统的发酵乳制品，加入到250mL生理盐水中，充分混匀，得到样品；
②样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株的分离、纯化；
a、菌株分离
取培养液1mL，用0.9％(重量与体积的百分比)无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取MRS琼脂培养基，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；
置35℃环境下厌氧培养72h(H2：CO2：N2＝5：10：85)，观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
b、菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
④菌株的鉴定
将上述菌株进行革兰氏染色、显微镜下观察为革兰氏阳性、杆状菌株，然后通过DNA提取、PCR扩增，16SrRNA基因序列，pheS基因序列等实验数据综合分析，鉴定结果为高加索酸奶乳杆菌；
其16SrRNA的基因序列如下：
CCATCTCCTGATCACCTTAGACGGCTGGTCCCCGAAGGTTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCCTGGTAAGGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGATCTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCATTTAAATGCAAGCATCTAAAATCAATAACGGAAACGCGTTCGACTTGCATGTATAGCACGCCGCACAGTCA。
其pheS的基因序列如下：
CAAACCTCACCAATGCAGGCTCGTACTTTGGAAAAGCATGATTTCTCAAAGGGACCTTTGAAGATGATCTCACCAGGAATCGTTTACCGTCGTGATACTGATGATCCAACCCATTCACATCAATTCCATCAGGTTGAAGGACTCTTTATTGATGAGCACGTGACAATGGCTGATTTAAAGGGAACTTTGATTACCATGGCTCAAAACATTTTTGGCAATAAATTTGATATTCGTTTACGACCAAGTTATTTCCCATTTACCGAACCTTCTGTTGAAGTGGATGTTACCTGCTTTAACTGTATGGGAAAGGGTTGTGACGTCTGCAAACATACCGGCTGGATTGAAGTCTTAGGTGCCGGCATGGTTCATCCTAATGTGCTCGATATGGCTGGCGTTGATTCAAAGAAGTATGGCG。
⑤菌株的保存
将菌落培养物置于无菌的20％甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
所述的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的筛选方法，步骤②中LC液体培养基由以下成分组成：
蛋白胨：10g，酵母膏：1g，牛肉膏：4g，K2HPO4：2g，乙酸钠：3g，柠檬酸铵：1g，MgSO4·7H2O：0.2g，MnSO4·7H2O：0.05g，干酪素酸性水解物：1g，吐温-80：1g，蒸馏水：1000mL；
该培养基调节pH6.0±0.1。
所述的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的筛选方法，步骤③中MRS琼脂培养基由以下成分组成：
酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸钠：5g；柠檬酸二胺：2g；吐温-80：1g；K2HPO4：2g；MgSO4·7H2O：0.2g；MnSO4·7H2O：0.05g；琼脂：15g；蒸馏水：1000mL；
该培养基调节pH6.8±0.1。
本发明高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的生物学特性如下：
1、细胞形态和理化实验结果
高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的细胞形态和理化实验结果如下表1所示：
表1 JMCC0101的细胞形态和理化实验结果
Figure GDA0001257416130000101
Figure GDA0001257416130000111
由表1可知，高加索酸奶乳杆菌JMCC0101为革兰氏染色阳性、杆状、接触酶和氧化酶实验阴性的菌株。碳水化合物产酸特性中，“+”表示发酵利用，“－”表示不发酵利用。
2、抗生素敏感实验结果
表2 JMCC0101的抗生素敏感实验结果
Figure GDA0001257416130000112
测定了高加索酸奶乳杆菌JMCC0101对30种抗生素的敏感性，由表2可知，该菌种对测试的27种抗生素敏感。
3、耐酸耐胆盐特性实验
将高加索酸奶乳杆菌JMCC0101和本实验室保存的其他乳杆菌(KD18，KD33，KL01，KU15，KL07，KL24，KL22，KL03)分别挑取1接种环纯化菌株接种到MRS培养基中，37℃培养48h，取出计数；同时，各取1mL该培养基，分别加入到pH为2.5的磷酸盐缓冲液和3‰含牛胆盐的MRS培养溶液中37℃孵育，于0h、3h进行菌数的测定，并计算其存活率。
表3耐酸耐胆盐特性实验数据
Figure GDA0001257416130000121
4、活菌数测试和后酸测试
将高加索酸奶乳杆菌JMCC0101、KU15、KL22三株菌在MRS液体培养基活化后3％接种量至脱脂奶中放置于37℃，每周测试活菌数、酸度。最终，在四周的测试中，JMCC0101和KU15活菌数始终保持在1×107CFU/mL以上同时酸度均在60T°以内。
表4活菌数数据
Figure GDA0001257416130000122
Figure GDA0001257416130000131
表5酸度数据
Figure GDA0001257416130000132
5、发酵风味实验
A)使用10％脱脂奶，不加糖的情况下，JMCC0101、KU15、KL22三株菌以2％的接种量分别与基础发酵剂1213(丹尼斯克公司提供，添加量为0.07g/kg)混合发酵5小时，同时设置只有基础菌的对照组，pH达到4.4左右停止发酵搅拌后4℃放置，24小时后选则专业的感官评鉴人员品尝进行排序和描述。结果口味由好到坏依次为JMCC0101＝KL22＞KU15＞空白。
B)纯牛奶加如7％的糖为基料进行重复A试验，为使3株乳杆菌风味散发采用长时间发酵的基础发酵剂1209(丹尼斯克公司提供，添加量0.07g/Kg)，发酵20小时后，搅拌放于4℃，24小时后品评。结果口味由好到坏依次为JMCC0101>KU15>KL22>空白。
6、抗氧化能力实验
活化菌株，在MRS液体培养基，37℃培养传代3次后，接种于MRS液体培养基中，37℃培养16h，收集菌液于4000rpm，4℃离心10min，收集菌体，生理盐水洗涤1次。用生理盐水将细胞浓度调整至1×108CFU/mL，备用；
A)羟自由基清除能力检测(Fenton法)
在10mL试管中依次加入1mL 5mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1mL 5mmol/L硫酸亚铁，1mL 3mmol/L过氧化氢和不同菌液混合均匀。用双蒸水补足10mL，37℃水浴15min，于4℃、6000rpm离心10min，取上清液在510nm处测定吸光度(以双蒸水为参比)。
HO·清除率(％)＝[(Ao-As)/Ao]×100％
Ao为无样品的OD值；As为有样品的OD值。
B)超氧阴离子清除能力检测(邻苯酚自氧化法)
在不同菌液样品中加入4.5mLTris-HCl(pH 8.2 150mmol/L)，25℃水浴20min，加入0.4mL 1.2mmol/L邻苯三酚，25℃水浴5min，立即加入2滴8mol/LHCl终止反应。取上清液在325nm处测定吸光度(以双蒸水为参比)。
O2 —清除率(％)＝[1-(Ao/As)]×100％
Ao为无样品的OD值；As为有样品的OD值。
C)DPPH清除能力检测
在不同菌液样品中加入1mL 0.2mmol/L DPPH·无水乙醇溶液，混匀后在室温下避光反应30min，并在6000rpm离心10min，取上清液在517nm处测定吸光度(以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液为参比)。空白组以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液。
清除率＝[1-(As-Aj)/Ao]×100％
Ao为对照品的OD值；As为有样品的OD值；Aj为空白组的OD值。
表6抗氧化性能测试数据
Figure GDA0001257416130000151
实施例2含高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的益生菌菌粉的制备
原料组成：高加索酸奶乳杆菌JMCC0101 3％，植物乳杆菌3％、嗜酸乳杆菌1％、乳双歧杆菌1％、干酪乳杆菌2％，低聚果糖80％、草莓提取物10％；该益生菌菌粉制备工艺为：按配方比例称取菌粉、低聚果糖、草莓提取物进行混合，在真空分装机上进行分装，2g/袋，贴标入库，冷藏保存。
制备得到的益生菌粉具有抗氧化功能且产品中活性乳酸菌总数≥4×1010cfu/袋。
实施例3含高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的乳酸菌饮料的制备
将纯牛奶50份，水30份，蔗糖5份混合均匀于110℃下灭菌15min制备培养基液；
将106cfu/ml的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101、106cfu/ml的副干酪乳杆菌和106cfu/ml的嗜热链球菌接入培养基液中混匀，37℃发酵至pH至4.2-4.6，终止发酵，冷却灌装，冷藏保存。
制备得到的含高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的乳酸菌饮料具有抗氧化功能。
SEQUENCE LISTING
<110> 石家庄君乐宝乳液有限公司
<120> 具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101、其筛选方法及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1487
<212> DNA
<213> 高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的16SrRNA基因序列
<400> 1
ccatctcctg atcaccttag acggctggtc cccgaaggtt acctcaccgg ctttgggtgt 60
tacaaactct catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgtgg 120
catgctgatc cacgattact agcgattcca acttcatgca ggcgagttgc agcctgcaat 180
ccgaactgag aacggcttta agagattagc ttgacctcgc ggtttcgcga ctcgttgtac 240
cgtccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc 300
ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc ttgctagagt gcccaactga atgctggcaa 360
ctaacaataa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420
cgacaaccat gcaccacctg tcattctgtc cccgaaggga acgcctaatc tcttaggttg 480
gcagaagatg tcaagaccct ggtaagggtt cttcgcgtag catcgaatta aaccacatgc 540
tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt caaccttgcg gtcgatctcc 600
ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactgaagg gcggaaaccc tccaacactt 660
agcactcatc gtttacggca tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tacccatgct 720
ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat 780
atatctacgc atttcaccgc tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagtct 840
cctggtttcc gatgcacttc tccggttaag ccgaaggctt tcacatcaga cctaagaaac 900
cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg 960
cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttgga taccgtcaag atgtcaacag 1020
ttactctgac acctgttctt ctccaacaac agagttttac gagccgaaac ccttcatcac 1080
tcacgcggcg ttgctccatc agactttcgt ccattgtggg aagattccct actgctgcct 1140
cccgtaggag tttgggccgt gtctcagtcc caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc 1200
tacgtatcat tgccttggta ggccattacc ttaccaacaa gctaatacgc cgcgggtcca 1260
tcctaaagtg atagccgaag ccatctttta aaccaaaacc atgtggtttt ggttgttata 1320
cggtattagc acctgtttcc aagtgttatc ccctacttca agggcaggtt acccacgtgt 1380
tactcaccag ttcgccactc gtttcgtgtt aaatcattta aatgcaagca tctaaaatca 1440
ataacggaaa cgcgttcgac ttgcatgtat agcacgccgc acagtca 1487
<210> 2
<211> 415
<212> DNA
<213> 高加索酸奶乳杆菌JMCC0101的pheS基因序列
<400> 2
caaacctcac caatgcaggc tcgtactttg gaaaagcatg atttctcaaa gggacctttg 60
aagatgatct caccaggaat cgtttaccgt cgtgatactg atgatccaac ccattcacat 120
caattccatc aggttgaagg actctttatt gatgagcacg tgacaatggc tgatttaaag 180
ggaactttga ttaccatggc tcaaaacatt tttggcaata aatttgatat tcgtttacga 240
ccaagttatt tcccatttac cgaaccttct gttgaagtgg atgttacctg ctttaactgt 300
atgggaaagg gttgtgacgt ctgcaaacat accggctgga ttgaagtctt aggtgccggc 360
atggttcatc ctaatgtgct cgatatggct ggcgttgatt caaagaagta tggcg 415

Claims (4)

1.一种高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri)JMCC0101，其特征在于 ,它是从我国云南大理传统发酵乳制品中分离筛选出来的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.11772；
所述高加索酸奶乳杆菌 JMCC0101的16SrRNA 的基因序列如下：
CCATCTCCTGATCACCTTAGACGGCTGGTCCCCGAAGGTTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCCTGGTAAGGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGATCTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCATTTAAATGCAAGCATCTAAAATCAATAACGGAAACGCGTTCGACTTGCATGTATAGCACGCCGCACAGTCA；
所述高加索酸奶乳杆菌 JMCC0101的 pheS的基因序列如下：
CAAACCTCACCAATGCAGGCTCGTACTTTGGAAAAGCATGATTTCTCAAAGGGACCTTTGAAGATGATCTCACCAGGAATCGTTTACCGTCGTGATACTGATGATCCAACCCATTCACATCAATTCCATCAGGTTGAAGGACTCTTTATTGATGAGCACGTGACAATGGCTGATTTAAAGGGAACTTTGATTACCATGGCTCAAAACATTTTTGGCAATAAATTTGATATTCGTTTACGACCAAGTTATTTCCCATTTACCGAACCTTCTGTTGAAGTGGATGTTACCTGCTTTAACTGTATGGGAAAGGGTTGTGACGTCTGCAAACATACCGGCTGGATTGAAGTCTTAGGTGCCGGCATGGTTCATCCTAATGTGCTCGATATGGCTGGCGTTGATTCAAAGAAGTATGGCG。
2.一种如权利要求 1所述的高加索酸奶乳杆菌 JMCC0101 的应用，其特征在于，所述高加索酸奶乳杆菌 JMCC0101 应用于制备益生菌菌粉或乳酸菌饮料。
3.根据权利要求 2 所述的高加索酸奶乳杆菌 JMCC0101 的应用，其特征在于：所述高加索酸奶乳杆菌 JMCC0101 用于制备益生菌菌粉，所述益生菌菌粉由以下重量百分含量的原料制成：高加索酸奶乳杆菌 JMCC0101 2％-4％，植物乳杆菌2％-4％、嗜酸乳杆菌 0.5％-1 .5％、乳双歧杆菌 0.5％-1 .5％、干酪乳杆菌1％-2％，低聚果糖 70％-90％、草莓提取物 9％-11％。
4.根据权利要求 2 所述的高加索酸奶乳杆菌 JMCC0101 的应用，其特征在于：所述高加索酸奶乳杆菌 JMCC0101 用于制备乳酸菌饮料，所述乳酸菌饮料由以下重量份数的原料制成：纯牛奶 40-60 份，水 20-40 份，蔗糖 3-6 份，105-107cfu/ml的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101，105-107cfu/ml 的副干酪乳杆菌，105-107cfu/ml的嗜热链球菌。
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