CN107118975B - 一株室温下长货架期存活的罗伊氏乳杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株室温下长货架期存活的罗伊氏乳杆菌，命名为：罗伊氏乳杆菌WHH1689，该菌株已于2016年11月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏，其保藏编号为CGMCC No.13122。本发明能在20‑37℃环境温度下、在发酵乳制品中存活3‑7个月，且活菌数能维持104CFU/ml以上，该罗伊氏乳杆菌在室温下即可长时间存活，且能维持较高的活菌数，拓宽了活性乳酸菌产品的覆盖面。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株室温下长货架期存活的罗伊氏乳杆菌。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类能够分解糖类以产生乳酸为主要代谢产物的细菌的通称。人类引用发酵乳品有非常悠久的历史，所以乳酸菌被认为是非常安全的菌种，能增进肠内菌群质量，提升人类健康，是益生菌中最重要的一类。随着益生菌的保健作用越来越来被消费者理解和接受，益生菌市场在迅速膨胀。益生菌主要以冻干菌粉或液态发酵制剂的形式在食品、保健品、膳食补充剂和药品中应用，其在食品中的产品形式主要有：益生菌乳制品-添加双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等活菌的酸奶，含干酪乳杆菌、植物乳杆菌等的活性乳酸菌饮料；益生菌非乳制品-益生菌发酵大豆饮料、益生菌果汁饮料、益生菌燕麦饮料等；益生菌谷物食品-益生菌麦片及其他谷物食品；益生菌蛋白粉；益生菌巧克力；益生菌冰淇淋等。
目前市场上含活性乳酸菌饮料或酸奶都需要在4-10℃保藏，且保质期一般在20-30天左右，保藏条件要求高，且保质期短。产品受冷链运输、低温储藏等因素的制约，目前销售市场主要集中于一、二线城市，很难覆盖到三四线城市或偏僻的农村地区。然而，随着越来越多消费者对健康产品的需求升级，地级市及以下城市地区消费者对益生菌产品的增长贡献连年增加，显示出强劲的增长潜力。一方面是由冷链系统不完善而导致的活性益生菌饮料制品无法全程低温保存的现实困境，另一方面是消费者对健康饮品的巨大需求所形成的巨大市场潜力，使得能够适应常温运输、储存的活性乳酸菌更具有市场前景。此类产品将打破市场分布的局限性，让偏远地区的消费者也能饮用健康的益生菌发酵产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一株室温下长货架期存活的罗伊氏乳杆菌，能在20-37℃环境温度下、在发酵乳制品中存活3-7个月，且活菌数能维持104CFU/ml以上，该罗伊氏乳杆菌在室温下既可长时间存活，且能维持较高的活菌数，拓宽了活性乳酸菌产品的销售范围。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一株室温下长货架期存活的罗伊氏乳杆菌，命名为：罗伊氏乳杆菌Lactobacillusreuteri，该菌株已于2016年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏，其保藏编号为CGMCC No.13122。
目前，乳酸菌发酵制品为保证在货架期内的有效活菌数，必须有相应的冷链系统配套支持，这样不仅限制了乳酸菌发酵制品中的市场发展，同时也大大增加了产品的生产及运营成本。因此，开发能够室温(20-37℃环境温度)且长时间保存(简称室温长保)的乳酸菌发酵制品成为乳酸菌产业发展的必然趋势和新的增长点。
室温长保乳酸菌关键技术研究及产业化方面，国内外的研发投入及产品开发等方面都明显不足，主要理论困惑及技术瓶颈有以下三个方面：首先，具有活性的乳酸菌在室温条件下，代谢活动将持续进行，改变发酵产品原有的pH值、组织状态、风味等性状；其次，随着时间推移，乳酸菌发酵产酸降低产品pH值，较强的酸性环境导致菌体逐渐死亡失活；再次，如何保证室温长保性乳酸菌发酵制品的稳定性及益生功能。
本发明所提供的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri可在相关食品饮料产品中解决以上3个问题，即(1)该株菌株添加到目前市售常温酸奶(或灭活酸奶)中，菌株进入休眠状态，代谢活动处于停滞状态，原有产品pH值、组织状态、风味等性状不发生改变；(2)随着时间推移，该株乳酸菌不进行发酵产酸，不会使产品中出现较强的酸性环境，不会因为酸度过强而造成的菌体逐渐死亡失活；(3)所生产的乳酸菌发酵制品其稳定性及益生功能不改变。除上述3点外，该株菌能够在20-37℃环境温度下，3-7个月长时间货架期内维持104CFU/ml以上的活菌数。目前，在此相关领域内的乳酸菌菌株及产品应用还处于空白。
本发明所提供的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri应用领域包括但不限于食品、饮料(液体、固体)、饼干、水、药品等产品范畴内，优选应用范围：牛乳制品、发酵牛乳制品(含其他活性乳酸菌或灭活乳酸菌的制品)、植物蛋白制品、发酵植物蛋白制品、果汁制品(包括复原果汁制品、原汁果汁制品)、茶饮料、水等。
作为优选，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri具有在20-37℃环境温度下、在发酵乳制品中存活3-7个月，且活菌数能维持104CFU/ml以上。作为优选，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri具有在25-32℃环境温度下、在发酵乳制品中存活3-7个月，且活菌数能维持104CFU/ml以上。
作为优选，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri的16S rDNA序列见SEQ IDNo.1所示。
所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri的用途，应用于发酵乳制品、含果汁饮料、茶饮料、固体饮料中。
本发明的有益效果，能在20-37℃环境温度下、在发酵乳制品中存活3-7个月，且活菌数能维持104CFU/ml以上，该罗伊氏乳杆菌在室温下即可长时间存活，且能维持较高的活菌数，拓宽了活性乳酸菌产品的销售范围。
附图说明
图1是本发明罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri电镜照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一、菌株筛选
10％(w/w)复原脱脂乳配置为将脱脂奶粉100g与900g水混匀后，灭菌，冷却。
发明人拟从传统食品中获得所需菌株，将从中国西藏、新疆、青海、云南等地采集到的传统发酵制品，包括酸奶，酥油茶，青稞酒，马奶酒，泡菜等样品，无菌生理盐水梯度稀释至10-2，各稀释梯度依次涂MRS平板，37℃培养48h。接种针挑取菌落形态各异的菌落至MRS平板三区交叉划线直至出现单菌落大小均一、形态一致。选择革蓝氏染色为紫色(阳性)的菌株，进行10％(w/w)复原脱脂乳凝乳实验，得到5株具有下述(1)所规定发酵性的菌株。将5株菌添加到中性乳体系和酸性乳体系中，得到1株具有下述(2)和(3)所规定室温活性的菌株，命名为WHH1689(来源自西藏地区的青稞酒)。
筛选标准如下：
(1)涉及发酵性。在10％(w/w)复原脱脂乳中，在20～37℃的温度范围内培养3个月，如果具有发酵性的菌株，则会发生凝乳。为了实现室温添加活性乳酸菌不改变产品原有风味质构，因此筛选不具有发酵性的菌株，即菌株在10％(w/w)复原脱脂乳中，20～37℃的温度范围内培养3个月，不凝乳。
(2)涉及活性。在10％(w/w)复原脱脂乳中，20～37℃的温度范围内培养3个月，一般不发生凝乳的乳酸菌，3个月后基本检测不到活菌数。所述具有室温存活能力的菌株，当初始加入量107CFU/ml时，3个月后活菌数能够维持在104CFU/ml以上。
(3)涉及室温活性。通常益生菌发酵乳制品，pH在4.0～4.5之间，保质期20天左右。此类产品需要低温储存，即便如此，乳酸菌在保质期内还会发生大量死亡。所述具有室温活性的菌株，在pH为4.2的发酵乳体系中，20～37℃储存3个月，活菌数维持在104CFU/ml以上。
二、微生物学性质
以下所示为所述乳杆菌WHH1689的微生物学特性：
a.培养温度优选为42℃；
b.培养基优选为MRS培养基；
c.革蓝氏阳性，短杆，无芽孢，无鞭毛(图1)；
d.菌落的形态特征为：在MRS固体培养基37℃培养48h后，菌落呈白色，边缘不规则，少光泽；
所述的乳杆菌WHH1689的16S rDNA序列(5’-3’)如下所示：
TGCAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGTTGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAGAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCACCTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGCGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCT(SEQ ID No.1)。
将16S rDNA基因序列通过NCBI的Blast在GenBank数据库中进行同源比对分析鉴定，该乳酸菌和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株LR199同源性为99％，依据同源性＞97％则为同一种类的原则，因此菌株WHH1689鉴定为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)。
综述所述，本发明筛选到的乳酸菌菌株归属于乳杆菌(Lactobacillus)属，罗伊氏乳杆菌中(Lactobacillus reuteri)，命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri(Lactobacillus reuteri WHH1689)，于2016年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.13122。
三、WHH1689菌株特性
它具有下述性质：
(1)发酵性，即在10％(w/w)复原脱脂乳中，20～37℃温度范围内培养3个月，不凝乳；
(2)10％(w/w)复原脱脂乳中，20～37℃温度范围内培养3个月，活菌数维持在104CFU/ml以上；
(3)发酵乳制品(pH4.2)中，20～37℃温度范围内培养3个月，活菌数维持在104CFU/ml以上。
(4)该菌株API50细菌鉴定系统结果显示：不具有核糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖同化性。
(5)该菌株发酵培养基测试结果显示：具有极弱的蔗糖、果糖同化性能。
(6)该株菌株表现为：氧化酶阴性，接触酶阴性。
(7)该菌菌株具有较强的耐酸性。结果显示：在pH为2.0和pH为3.0条件下，培养2h后对该菌株的活菌数没有显著影响。
(8)该菌株具有很强的耐胆盐性。结果显示：0.3％胆盐对该菌存活没有影响，0.5％胆盐条件下，培养3h，活菌数降低不足1个数量级。
(9)该菌菌株具有较强的消化酶耐受性。0.3％浓度的胰蛋白酶在2h内对菌株的存活没有影响。
(10)该菌株的抗生素耐受结果显示：对万古霉素和卡纳霉素有抗性，对巴龙霉素和链霉素的MIC值为256ug/ml，对红霉素和氯霉素的MIC值为8ug/ml和4ug/ml，对四环素和氨苄青霉素的MIC值为0.5ug/ml。
(11)该菌株具有广谱的抑菌活性。结果显示：在采用平板倾注法与致病菌乙型副伤寒沙门氏菌(CICC 10437)、金黄葡萄球菌(CICC 10301)、福氏志贺氏菌(CICC 21534)、大肠埃希氏菌(CICC 23689)共培养过程中，抑菌圈直径11-21mm，均大于多黏菌素B(15ug/ml)，1％浓度Nisin阳性对照的抑菌圈。
试验部分：
1、在10％(w/w)复原脱脂乳中的凝乳实验
1)配制10％复原脱脂乳，外加1％蔗糖，10ml分装于试管，95℃，10min灭菌；
2)将WHH1689甘油管保存菌液以1％接种于MRS培养基试管，活化1代；
3)活化后菌液1％接种于乳中，28℃、37℃放置；
4)3个月持续观察凝乳情况。
结果显示罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri在28℃、37℃放置3个月不发生凝乳。
2、在10％(w/w)复原脱脂乳中的常温储存实验
1)配制10％脱脂乳，10ml分装于试管，95℃，10min灭菌；
2)将WHH1689甘油管保存菌液以1％接种于相应培养基试管，活化1代；
3)活化后菌液1％接种于乳管中，37℃放置；
4)间隔1个月检测活菌数，共观察3个月。
测定结果如表1所示：
表1
所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri，在10％脱脂乳中，37℃放置3个月，从初始的107CFU/ml下降到104CFU/ml，保持了104CFU/ml以上的较高的活菌数。
3、耐酸、耐胆盐性能
耐酸实验：
a、菌体分别重悬在PBS pH2.0，PBS pH3.0，PBS pH2.0+0.3％pepsin，PBS pH3.0+0.3％pepsin，PBS pH7.2的5个体系中；
b、于0h，1h，2h，3h取样，梯度稀释涂布MRS平板；
c、平板于37℃，培养48h，计数。
耐胆盐实验：
a、菌体分别重悬在PBS 0.3％胆盐，PBS 0.5％胆盐，PBS+0.1％tyrosin，PBSpH7.2的4个体系中；
b、于0h，1h，2h，3h取样，梯度稀释涂布MRS平板；
c、平板于37℃，培养48h，计数。
耐酸性实验结果显示：pH2.0和pH3.0在2h对该菌的存活均没有显著的影响，pH3.0下3h活菌数降低约1个数量级，pH2.0下3h活菌数降低约3个数量级。胃蛋白酶在pH2.0时，明显抑制菌株存活，但在pH3.0时，对菌株的存活没有影响。上述结果说明该菌有很强的耐酸性。
耐胆盐实验结果显示：0.3％胆盐对该菌存活没有影响，0.5％胆盐3h，活菌数降低0.7个数量级。胰蛋白酶在2h内对菌株的存活没有影响。上述结果说明该菌有很强的耐胆盐性。
4、罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri黏附性
采用HT-29细胞作为黏附性试验的细胞株，采用常规黏附性试验科学方法，结果显示：
a、平板计数算粘附率
| 菌株 | LGG | 1689 |
| 初始菌液 | 9.52*10<sup>8</sup>CFU/ml | 2.92*10<sup>8</sup>CFU/ml |
| 粘附菌液 | 4.4*10<sup>6</sup>CFU/ml | 1.285*10<sup>6</sup>CFU/ml |
| 粘附率 | 0.46 | 0.44 |
b、显微镜检算粘附率，实验结果经SPASS分析
| 菌株 | LGG(10<sup>8</sup>CFU/ml) | 1689(10<sup>8</sup>CFU/ml) | 1689(10<sup>7</sup>CFU/ml) | 1689(死菌) |
| 粘附率 | 4.60±1.67<sup>a</sup> | 4.00±1.22<sup>a</sup> | 1.80±1.48<sup>b</sup> | 0.80±0.84<sup>c</sup> |
c、小结
两种实验方法，算出的粘附率相差10倍。但在两个实验体系中，1689菌株的粘附性和阳性对照菌株LGG接近，没有显著差别，说明1689有很好的粘附性能。
5、罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri抗生素敏感性
益生菌对抗生素的敏感性是检测菌株安全性的指标之一。为了检测1689菌株的安全性，选取了8种抗生素进行测试，检测1689菌株对8种抗生素的敏感性，实验设计如下：
a、将8种抗生素配制成如下表的浓度(ug/ml)，50ul加入到96孔板中
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| A | 四环素 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 阴性对照 | 阳性对照 |
| B | 氨苄青霉素 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | ||
| C | 巴龙霉素 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | ||
| D | 链霉素 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | ||
| E | 万古霉素 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | ||
| F | 卡那霉素 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | ||
| G | 氯霉素 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | ||
| H | 红霉素 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 |
b、实验结果
| OD600 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 0.218 | 0.169 | 0.134 | 0.114 | 0.106 | 0.103 | 0.096 | 0.098 | 0.115 | 0.163 | 0.235 | 0.673 |
| B | 0.181 | 0.174 | 0.176 | 0.171 | 0.169 | 0.167 | 0.162 | 0.162 | 0.169 | 0.175 | 0.034 | 0.034 |
| C | 0.850 | 0.837 | 0.803 | 0.367 | 0.556 | 0.841 | 0.855 | 0.845 | 0.846 | 0.174 | 0.036 | 0.037 |
| D | 0.885 | 0.869 | 0.863 | 0.826 | 0.710 | 0.264 | 0.693 | 0.865 | 0.355 | 0.168 | 0.036 | 0.037 |
| E | 0.991 | 0.969 | 0.949 | 0.864 | 0.878 | 0.871 | 0.833 | 0.825 | 0.834 | 0.480 | 0.036 | 0.035 |
| F | 0.978 | 0.955 | 0.893 | 0.932 | 0.880 | 0.736 | 0.445 | 0.959 | 0.973 | 0.917 | 0.036 | 0.035 |
| G | 1.064 | 0.988 | 0.865 | 0.226 | 0.182 | 0.177 | 0.177 | 0.178 | 0.181 | 0.172 | 0.035 | 0.035 |
| H | 1.026 | 1.161 | 0.984 | 0.341 | 0.179 | 0.183 | 0.180 | 0.179 | 0.175 | 0.173 | 0.035 | 0.034 |
由上表的数据可以得出1689菌株对8种抗生素的敏感性，其中万古霉素和卡纳霉素有抗性，对其余6种抗生素的MIC值为：
| 抗生素 | 四环素 | 氨苄青霉素 | 巴龙霉素 | 链霉素 | 氯霉素 | 红霉素 |
| MIC(ug/ml) | 0.5 | 0.5 | 256 | 256 | 4 | 8 |
c、小结
抗生素敏感性实验结果显示，1689菌株对万古霉素和卡纳霉素有抗性，对巴龙霉素和链霉素的MIC为256ug/ml，对红霉素和氯霉素的MIC值为8ug/ml和4ug/ml，对四环素和氨苄青霉素的MIC值为0.5ug/ml。
6、罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri抑菌活性
a、用营养肉汤悬浮指示菌种，调整浓度，使得培养基中菌数终浓度约如下(CFU/ml)：
乙型副伤寒沙门氏菌(CICC 10437)：1.8*107
金黄葡萄球菌(CICC 10301)：3.6*107
福氏志贺氏菌(CICC 21534)：2.1*107
大肠埃希氏菌(CICC 23689)：1.2*107。
b、分别加100μl发酵液和供试菌液至平板孔洞中，置4℃冰箱过夜扩散8h，后置37℃培养24h。大肠、沙门、志贺指示菌的阳性对照为多黏菌素B(15ug/ml)，金黄球菌阳性对照为Nisin(1％)，阴性对照为MRS培养基。
c、实验结果
d、小结
实验结果显示罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri有广谱的抑菌活性，对革兰氏阴性菌和阳性菌都有抑菌活性。1689有很强的抑菌活性，抑菌圈直径比阳性对照大。但其发酵液没有显示出抑菌活性。
7、常温市售酸性发酵乳体系中的储存情况：
a、检测了罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri，鼠李糖乳杆菌LGG，植物乳杆菌LP-ONLY三个菌株在市售酸性娃哈哈“营养快线”发酵乳饮料中的在28℃、37℃储存情况。
b、结果如下：
表中数据显示，在28℃储存的条件下，鼠李糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌LP-ONLY都能维持很高的活菌数，但是它们都进一步发酵产酸，产品的pH值和酸度都显著变化，虽然有较高的活菌数，但无法实现产品的稳定性。在37℃储存的条件下，鼠李糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌LP-ONLY在3周后无法检测到活菌，产品的pH和酸度都显著变化。
罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri在28℃，37℃放置4周，产品的pH和酸度基本不变，活菌数都能维持在104CFU/ml以上。
c、检测了罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri，鼠李糖乳杆菌LGG，植物乳杆菌LP-ONLY三个菌株在市售娃哈哈“锌爽歪歪”发酵乳饮料(酸性)中28℃、37℃储存情况。
d、结果如下：
表中数据显示，在28℃储存的条件下，鼠李糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌LP-ONLY都能维持很高的活菌数，但是它们都进一步发酵产酸，产品pH值和酸度都显著变化，虽然有较高的活菌数，但无法实现产品的稳定性。在37℃储存的条件下，鼠李糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌LP-ONLY在3周无法检测到活菌，产品的pH值和酸度都显著变化。
罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri在28℃，37℃放置4W，产品的pH和酸度都基本不变，活菌数都能维持在104CFU/ml以上。
e、检测了罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri，鼠李糖乳杆菌LGG，植物乳杆菌LP-ONLY三个菌株在市售酸性娃哈哈“诺赞卡”常温酸奶中，在28℃、37℃储存情况中的常温储存情况：
f、结果显示：
所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri，在诺赞卡酸奶体系中，28℃和37℃放置7个月，活菌数保持在104CFU/ml以上。产品的pH值和总酸基本没有变化，感官评价放置后产品的风味质构也没有变化。
目前市场上含活性乳酸菌的酸奶或乳酸菌饮料，都需要4-10℃保藏，且保质期一般在20-30天左右。如果将产品置于室温环境，尤其是20-37℃条件下，则会出现：(1)乳酸菌快速死亡或者(2)产品中的乳酸菌活菌数量在前15天内能够维持在一定水平，但菌株产品中持续生长代谢，并进一步发酵产生乳酸(严重后酸化)，从而影响产品的pH值和酸度，造成产品的感官品质发生严重变化，导致腐败、不能食用等。由于以上两种情况，目前市场上还没有一款产品可以实现常温条件下长保质期维内维持乳酸菌的活性。通过本发明的乳杆菌属菌，可以在常温条件下，中性乳体系10％(w/w)复原脱脂乳或酸性乳体系pH4.2的发酵乳制品中，储存3-7个月，活菌数保持在104CFU/ml以上，且产品的pH值和酸度基本不变，产品的感官品质不发生变化，从而实现常温运输储存的活性乳酸菌乳制品的开发提供菌种资源。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州娃哈哈科技有限公司
<120> 一株室温下长货架期存活的罗伊氏乳杆菌
<130> 2017.03
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 罗伊氏乳杆菌
<400> 1
tgcagtcgta cgcactggcc caactgattg atggtgcttg cacctgattg acgttggatc 60
accagtgagt ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc tgccccggag cgggggataa 120
catttggaaa cagatgctaa taccgcataa caacaaaagc cacatggctt ttgtttgaaa 180
gatggctttg gctatcactc tgggatggac ctgcggtgca ttagctagtt ggtaaggtaa 240
cggcttacca aggcgatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca caatggaact 300
gagacacggt ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atgggcgcaa 360
gcctgatgga gcaacaccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt 420
ggagaagaac gtgcgtgaga gtaactgttc acgcagtgac ggtatccaac cagaaagtca 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta 540
ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttgct taggtctgat gtgagagcct tcggcttaac 600
cgaagaagtg catcggaaac cgggcgactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg 660
tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt 720
ctgcacctga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag 780
tccatgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccggagc 840
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900
acgggcgccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatcttgc gctaacctta gagataaggc gttcccttcg gggacgcaat 1020
gacaggtggt gcatggtcgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttgttact agttgccagc attaagttgg gcactctagt gagactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcagatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatgga cggtacaacg agtcgcaagc tcgcgagagt aagctaatct 1260
cttaaagccg ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tggaagtttg taacgcccaa agtcggtggc ct 1422
Claims (3)
1.一株室温下长货架期存活的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，命名为：罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri WHH1689，该菌株已于2016年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏，其保藏编号为CGMCC No.13122；所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri WHH1689的16S rDNA 序列见SEQ ID No.1所示；所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri WHH1689在20-37℃环境温度下、在发酵乳制品中存活3-7个月，且活菌数能维持104CFU/ml以上。
2.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri WHH1689在25-32℃环境温度下、在发酵乳制品中存活3-7个月，且活菌数能维持104CFU/ml以上。
3.如权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌的用途，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri WHH1689应用于发酵乳制品、含果汁饮料、茶饮料、固体饮料中。
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| 罗伊氏乳杆菌的益生功能;庞洁等;《中国生物工程杂志》;20110531;第31卷(第5期);第131-137页 * |
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