CN110537575A - 弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法、其应用，及相应的酸奶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法、其应用，及相应的酸奶，本发明的发酵剂将嗜热链球菌JMCC16、嗜热链球菌JMCC0019、嗜热链球菌JMCC0022和德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018四种菌粉以菌数1000：（1～10000）：（1～1000）：（1～100）混配，经弱后酸处理即得弱后酸酸奶复合发酵剂JLB‑1510，所制的酸奶复合发酵剂应用于鲜牛乳/复原奶进行发酵，以制备弱后酸酸奶。所用四种菌粉均采用我国分离自传统发酵乳制品中的优良菌株，配比科学合理，能够利用乳糖产生乳酸和香气物质，使得发酵出的酸奶酸甜可口，并且克服了现有酸奶在运输过程中冷链不完善造成的酸奶后酸影响产品口感和状态的弊病。本发明适用于所有酸奶复合发酵剂JLB‑1510，进一步应用于酸奶发酵时能有效控制后酸。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及酸奶发酵和制备技术，具体地说，是一种弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法、其应用，及相应的酸奶。
背景技术
酸奶是我们常见的饮品之一，酸奶发酵剂在酸奶生产中起着不可替代的作用，其发酵特性直接影响酸奶的风味及品质，决定发酵剂发酵性能、发酵产品风味、发酵产品功能和发酵产品保质期的主要因素便是发酵剂所使用的菌种，所以筛选具有优良特性的乳酸菌菌种是制备高品质发酵剂的前提，但是我国在酸奶的发酵速度、发酵风味、后酸控制和产品被食用前弱后酸的控制等方面还存在很大的技术壁垒，因此酸奶发酵剂仍然依赖于进口。
酸奶的后酸受环境影响很大，是个世界级的难题，后酸化也称过酸化或后发酵，是指酸奶在正常发酵结束后，在工厂贮存、产品运输、销售、食用前这一过程中，菌体仍在生长繁殖，分解残存的乳糖产生乳酸，使酸奶的pH值继续下降，以至出现了消费者不可接受的过酸味及感官质量下降。一般采用的防治措施是选择产酸弱的发酵剂、培养温度采用最下限、发酵好的酸奶迅速冷却、控制好贮藏条件等。
专利号为201410294825.9的中国发明专利，公开了一种酸奶发酵乳酸菌组合及发酵剂，该发酵剂为单菌株复配而成，具有性能良好，降低噬菌体污染等特点，但针对酸奶的后酸控制、风味等方面未进行过多的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是要提供一种弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法、其应用，及相应的酸奶，通过对单菌株进行适合比例的复配而成的发酵剂，实现其控制酸奶的后酸，并得到风味良好的酸奶。
本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：一种弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法，由至少两种菌粉通过复合而成，所述菌粉包括复合嗜热链球菌，还包括德氏乳杆菌保加利亚亚种。
作为对本发明弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法的限定：所述复合嗜热链球菌为嗜热链球菌JMCC0019、嗜热链球菌JMCC16、嗜热链球菌JMCC0022三种单菌株混合而成，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种为德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018单菌，所述嗜热链球菌JMCC16、嗜热链球菌JMCC0019、嗜热链球菌JMCC0022和德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018四种菌粉以菌数1000:(1～10000):(1～1000):(1～100)混配，经弱后酸处理制得酸奶复合发酵剂。
本发明也提供了一种弱后酸酸奶复合发酵剂的应用：所述弱后酸酸奶复合发酵剂应用于鲜牛乳/复原奶进行发酵，以制备弱后酸酸奶。
本发明还提供了一种弱后酸酸奶的制备方法：制备弱后酸酸奶的原料，以重量份数计，包括主料鲜牛乳/复原奶85～95份、辅料甜味剂7～10份，以及权利要求1-3中任意一项所述的弱后酸酸奶复合发酵剂0.01～0.1份；所述弱后酸酸奶的制备方法包括依次进行的调配基料、均质、杀菌、接种、发酵、破乳。
作为对本发明弱后酸酸奶的制备方法的限定：所述调配基料的步骤是：将主料鲜牛乳/复原奶中加入辅料，搅拌，控温存放，得到基料。
作为对本发明弱后酸酸奶的制备方法的进一步限定：所述基料输入均质机中进行均质，所述均质的二级压力为4.8～5.1MPa、一级压力为17.2～17.8MPa，所述均质温度为58～62℃。
作为对本发明弱后酸酸奶的制备方法的再进一步限定：所述杀菌在93～98℃温度下进行，且杀菌时间为300～310s。
作为对本发明弱后酸酸奶的制备方法的更进一步限定：所述接种步骤是：将杀菌后的料液降温至40～42℃，加入自冷冻取出、常温下活化30分钟的弱后酸酸奶复合发酵剂；
搅拌30～40min后，关闭搅拌，40～42℃下保温发酵，自关闭搅拌时刻4小时后开始测酸，每隔20～30min测酸一次，当所测滴定酸度达到68～72゜T时，保持5min后破乳，搅拌20～30min，降至室温即成。
作为对本发明弱后酸酸奶的制备方法的一种限定：所述甜味剂为白砂糖、阿斯巴甜、蔗糖、木糖醇或麦芽糖中的至少一种。
作为对本发明弱后酸酸奶的制备方法的另一种限定：所述原料的辅料还包括香精，在破乳后搅拌10～20min时加入，加入后继续搅拌10min。
作为对本发明弱后酸酸奶的制备方法的再另一种限定：所述调配基料步骤中的控温存放，控制温度在0～15℃，存放0～1h，于均质杀菌前15min开启搅拌15min；当存放时间达到1h，但不能及时进入均质机中进行均质时，需控制温度在0～10℃，并继续存放0～1h，于均质杀菌前15min开启搅拌15min。
作为对本发明弱后酸酸奶的制备方法的最后一种限定：所述弱后酸酸奶制得后不能即时饮用时，需降温后灌装，入4-10℃库房保存，期间酸度≤77゜T。
在本发明的上述配方中：
(Ⅰ)嗜热链球菌JMCC0019(Streptococcus thermophiles)
嗜热链球菌JMCC0019(Streptococcus thermophiles)，是从西藏拉萨市夺底乡牧民家中自制传统发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2017年7月14日，保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.14426。将菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrRNA测序，NCBI网站blast最终确定为嗜热链球菌。
嗜热链球菌JMCC0019的16SrRNA测序结果如下：
GTGGCTCAAAGGTTCCTCACCGACTTCGGGTGTTAAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAGAGATTAGCTCGCCGTCACCGACTCGCAACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGATGTACCGAAGTAACTTTCTATCTCTAGAAATAGCATCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAATCCCGGAAAGGATCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTTGACAGTTTCCAAAGCGAACTATGGTTGAGCCACAGCCTTTAACTTCAGACTTATCAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTAAGCTACCGTCACAGTGTGAACTTTCCACTCTCACACCCGTTCTTGACTTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGGGTTGCCCCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCTCACCTACTAGCTAATACAACGCAGGTCCATCTTGTAGTGGAGCAATTGCCCCTTTCAAATAAATGACATGTGTCATCCATTGTTATGCGGTATTAGCTATCGTTTCCAATAGTTATCCCCCGCTACAAGGCAGGTTACCTACGCGTTACTCACCCGTTCGCAACTCATCCAAGAAGAGCAAGCTCCTCTCTTCAGCGTCTACTGCAG
嗜热链球菌JMCC0019的Phes基因测序结果如下：
TCGCAACTCTACAAGTCCTGTCCAAGCTCGTACACTTGATAAACATGATTTTTCTAAAGGTCCTCTTAAGATGATCTCACCAGGACGTGTTTTCCGTCGTGATACCGATGATGCGACTCACAGCCACCAGTTTCACCAAATCGAAGGTTTGGTCGTTGGTAAAAACATCTCAATGGGTGATCTGAAGGGAACGCTTGAGATGATTATTCAAAAAATGTTTGGTGCAGAACGTCGAATCCGTTTGCGTCCTTCTTACTTCCCATTCACTGAACCTTCCGTTGAGGTTGACGTGTCATGCTTCAAGTGTGGTGGTAAAGGATGTAACGTATGCAAGAATACAGGTTGGATTGAGATCCTTGGTGCTGGTATGGTTCACCCACAAGTGCTTGAGATGTCAGGTGTTGATTCTGAAGAATATTCAGGTTTTGTTTTGGGTTTAGGAAG
嗜热链球菌JMCC0019的分离纯化方法，按照以下步骤顺序进行：
①样品采集
取25mL西藏拉萨市夺底乡牧民家中自制传统的发酵乳制品，加入到250mL生理盐水中，充分混匀，得到样品；
②样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的LC液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
③菌株分离
取培养液1mL，用0.9％(重量与体积的百分比)无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液；
取MRS琼脂培养基(MRS培养基具有以下组成：10g酪蛋白胨；10g牛肉膏；5g酵母膏；20g葡萄糖；5g乙酸钠；2g柠檬酸二胺；1g吐温-80；2g K2HPO4；0.2g MgSO4·7H2O；0.05gMnSO4·7H2O；15g琼脂；1000mL蒸馏水；该培养基调节pH6.8±0.1)，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL菌悬液涂布到培养基上；
置36±1℃环境下厌氧培养72h(H2：CO2：N2＝5：10：85)，观察菌落生长情况；
待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的菌落，进行下一步的菌株纯化；
④菌株的纯化
挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，36±1℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，36±1℃有氧环境培养72h；连续培养三次；
最后，将纯培养物置于无菌的20％甘油中在-80℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
嗜热链球菌JMCC0019的菌种细菌学特征
A1.基本特征如表1：
表1嗜热链球菌JMCC0019基本特征
| 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 细胞形态 | 球状 | 形成芽孢 | - |
| 氧化酶 | - | 接触酶 | - |
由表1可知，嗜热链球菌JMCC0019为革兰氏阳性、球状、无芽孢、接触酶和氧化酶试验阴性的菌株。
A2.糖发酵特性实验
将菌株挑取单菌落进行平板划线，36±1℃培养24h，传代一次，取菌悬液接种至糖发酵管中，36±1℃培养48h，观察颜色变化，具体结果见表2：
表2嗜热链球菌JMCC0019的鉴定结果
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
A3.菌株发酵特性
取鲜牛奶75-98份，白砂糖2-15份，调配均匀后，于60-65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，接种JMCC0019 106CFU/mL，于37℃发酵约16h，检测其pH为4.0-4.5之间时，停止发酵，搅拌破乳后，4-8℃后酵24h后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果如表3所示：
表3 JMCC0019发酵特性
| 菌株 | 风味和香气 |
| JM0215 | 酸感强所，制较酸顺奶滑的，香有气涩感 |
| JM0237 | 拉丝，酸感较柔和，香气清淡 |
| JMCC0019 | 顺滑，粘度、酸度适中，香气充裕 |
(Ⅱ)嗜热链球菌JMCC16(Streptococcus thermophiles)
嗜热链球菌JMCC16(Streptococcus thermophiles)是一株从内蒙古传统发酵乳中分离筛选出来的；该菌菌株已于2015年11月16日，保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.11672。
嗜热链球菌JMCC16的16Sr RNA序列如下：
GGCTCCAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAGAGATTAGCTCGCCGTCACCGACTCGCAACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGATGTACCGAAGTAACTTTCTATCTCTAGAAATAGCATCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAATCCCGGAAAGGATCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTTGACAGTTTCCAAAGCGAACTATGGTTGAGCCACAGCCTTTAACTTCAGACTTATCAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTAAGCTACCGTCACAGTGTGAACTTTCCACTCTCACACCCGTTCTTGACTTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGGGTTGCCCCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCTCACCTACTAGCTAATACAACGCAGGTCCATCTTGTAGTGGAGCAATTGCCCCTTTCAAATAAATGACATGTGTCATCCATTGTTATGCGGTATTAGCTATCGTTTCCAATAGTTATCCCCCGCTACAAGGCAGGTTACCTACGCGTTACTCACCCGTTCGCAACTCATCCAAGAAGAGCAAGCTCCTCTCTTCAGCGTTCTACT
嗜热链球菌JMCC16的Phes基因序列如下：
GCTTCGCACTCATACAAGTCCTGTCCAAGCTCGTACACTTGATAAACATGATTTTTCTAAAGGTCCTCTTAAGATGATCTCACCAGGACGTGTTTTCCGTCGTGATACCGATGATGCGACTCACAGCCACCAGTTTCACCAAATCGAAGGTTTGGTCGTTGGTAAAAACATCTCAATGGGTGATCTGAAGGGAACGCTTGAGATGATTATTCAAAAAATGTTTGGTGCAGAACGTCGAATCCGTTTGCGTCCTTCTTACTTCCCATTCACTGAACCTTCCGTTGAGGTTGACGTGTCATGCTTCAAGTGTGGTGGTAAAGGATGTAACGTATGCAAGAATACAGGTTGGATTGAGATCCTTGGTGCTGGTATGGTTCACCCACAAGTGCTTGAGATGTCAGGTGTTGATTCTGAAGAATATTCAGGT
嗜热链球菌JMCC16的菌种细菌学特征如下：
B1.基本特征如表4所示：
表4嗜热链球菌JMCC0016基本特征
| 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 细胞形态 | 球状 | 形成芽孢 | - |
| 氧化酶 | - | 接触酶 | - |
由表4可知，嗜热链球菌JMCC0016为革兰氏阳性、球状、无芽孢、接触酶和氧化酶试验阴性的菌株。
B2.糖发酵特性实验：
将上述分离纯化菌株挑取单菌落进行平板划线，36±1℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中，36±1℃培养48h，观察颜色变化，具体结果见下表。
表5嗜热链球菌JMCC0016的鉴定结果
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
B3.菌株发酵特性
取鲜牛奶75-98份，白砂糖2-15份，调配均匀后，于60-65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，接种JMCC16 106CFU/mL，于37℃发酵约16h，检测其pH为4.0-4.5之间时，停止发酵，搅拌破乳后，4-8℃后酵24h后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果如表6所示：
表6 JMCC16发酵特性
| 菌株 | 风味和香气 |
| JM0219 | 酸感强所，制质酸构奶适的中香，气有涩感 |
| JM0237 | 拉丝，酸感较柔和，香气清淡 |
| JMCC16 | 顺滑，粘度、酸度适中，香气清香清淡 |
(Ⅲ)嗜热链球菌JMCC0022(Streptococcus thermophiles)
嗜热链球菌JMCC0022(Streptococcus thermophiles)是一株从内蒙古传统发酵乳中分离筛选出来的；该菌菌株已于2018年5月28日，保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.15822。
嗜热链球菌JMCC0022的16Sr RNA序列如下：
ACGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAGAGATTAGCTCGCCGTCACCGACTCGCAACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGATGTACCGAAGTAACTTTCTATCTCTAGAAATAGCATCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAATCCCGGAAAGGATCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTTGACAGTTTCCAAAGCGAACTATGGTTGAGCCACAGCCTTTAACTTCAGACTTATCAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTAAGCTACCGTCACAGTGTGAACTTTCCACTCTCACACCCGTTCTTGACTTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGGGTTGCCCCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCTCACCTACTAGCTAATACAACGCAGGTCCATCTTGTAGTGGAGCAATTGCCCCTTTCAAATAAATGACATGTGTCATCCATTGTTATGCGGTATTAGCTATCGTTTCCAATAGTTATCCCCCGCTACAAGGCAGGTTACCTACGCGTTACTCACCCGTTCGCAACTCATCCAAGAAGAGCAAGCTCCTCTCTTCAGCGTTCTACTTGCAGTA
嗜热链球菌JMCC0022的Phes基因序列如下：
TTGCTTCGCACTCATACAAGTCCTGTCCAAGCTCGTACACTTGATAAACATGATTTTTCTAAAGGTCCTCTTAAGATGATCTCACCAGGACGTGTTTTCCGTCGTGATACCGATGATGCGACTCACAGCCACCAGTTTCACCAAATCGAAGGTTTGGTCGTTGGTAAAAACATCTCAATGGGTGATCTGAAGGGAACGCTTGAGATGATTATTCAAAAAATGTTTGGTGCAGAACGTCGAATCCGTTTGCGTCCTTCTTACTTCCCATTCACTGAACCTTCCGTTGAGGTTGACGTGTCATGCTTCAAGTGTGGTGGTAAAGGATGTAACGTATGCAAGAATACAGGTTGGATTGAGATCCTTGGTGCTGGTATGGTTCACCCACAAGTGCTTGAGATGTCAGGTGTTGATTCTGAAGAATATTCAGGTTTTGCTTTTGGTTT
C1.基本特征如表7所示：
表7嗜热链球菌JMCC0022基本特征
| 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 细胞形态 | 球状 | 形成芽孢 | - |
| 氧化酶 | - | 接触酶 | - |
由表7可知，嗜热链球菌JMCC0022为革兰氏阳性、球状、无芽孢、接触酶和氧化酶试验阴性的菌株。
C2.糖发酵特征实验：
将上述分离纯化菌株挑取单菌落进行平板划线，36±1℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中，36±1℃培养48h，观察颜色变化，具体结果见下表8。
表8嗜热链球菌JMCC0022的鉴定结果
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
C3.菌株发酵特性：
取鲜牛奶75-98份，白砂糖2-15份，调配均匀后，于60-65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，接种嗜热链球菌JMCC0022 106CFU/mL，于37℃发酵约16h，检测其pH为4.0-4.5之间时，停止发酵，搅拌破乳后，4-8℃后酵24h后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果如表9所示：
表9嗜热链球菌JMCC0022发酵特性
| 菌株 | 风味和香气 |
| JM0219 | 酸感强所，制质酸构奶适的中香，气有涩感 |
| JM0150 | 拉丝长，酸感较柔和，香气清淡 |
| JMCC0022 | 发酵香气浓，产酸快，粘度好，香气充裕 |
(Ⅳ)保加利亚乳杆菌JMCC0018(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)
保加利亚乳杆菌JMCC0018是从西藏传统发酵乳中分离筛选出来的，该菌菌株已于2017年保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.14425。经对菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrRNA测序，NCBI网站blast最终确定为为德氏乳杆菌保加利亚亚种。
保加利亚乳杆菌JMCC0018的16Sr RNA序列结果如下：
GACTCCTATAAAGGTTATCCCACCGACTTTGGGCATTGCAGACTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACAGCTTTAAGAGATCCGCTTACCCTCGCGGGTTCGCTTCTCGTTGTACTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCTTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAAGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTCTGCGTCCCCGAAGGGAACCACCTATCTCTAGGTGTAGCACAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGCGCTTAATGCGTTTGCTGCGGCACTGAGGACCGGAAAGTCCCCAACACCTAGCGCTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGAATGACAGTTTCCGATGCAGTTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTATCATTCCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGATTACCGTCAAATAAAGACCAGTTACTGCCTCTATCCTTCTTCACCAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTACGCATCATTGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCTCATCCTAAAGTGACAGCTTACGCCGCCTTTCAAACTTGAATCATGCGATTCATGTTGTTATCCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGGTATCCCAGTCTTTAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCATCCGCCGCTAGCGTCCAACAAATCATCCCGAAGGAAT
保加利亚乳杆菌JMCC0018的Phes基因测序结果如下：
CACCTGCTGCGGAGCCTCACTTCACCAGTTCAAGCCCGGACCATGGAAAAGCATGACTTCATAAAGGGGACCTCAAGATGATCTCCCCAGGCAAGGTTTACACAATAGACGATGACGACGCCACCCAGTCCCACCAGTTCATGCAGATGGAAGGGCTGGTTGTCAGCAAGAACATCTCCTTGAGTGACCTTAAGGGGACCTTGGAACTGGTGGCCAAACACGAATTCGGCCAGGACCGGGAAACCCGCTTGCGGCCAAGCTACTTCCCATTTACTGAACCATCACTTGAAATGGACTTTTCTTGCTTTGAATGCGGCGGCAAGGGCTGCTCGATCTGCAAGAACACCGGCTGGATCGAAGTTCTGGGTGCCGGGATCGTTCACCCGAATGTTTTGTCTGCCGCCGGCATTGACCCAAACGTCTACTCTGGTT
保加利亚乳杆菌JMCC0018细菌学特征如下：
D1.基本特征如表10所示：
表10保加利亚乳杆菌JMCC0018基本特征
| 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 细胞形态 | 杆状 | 形成芽孢 | - |
| 氧化酶 | - | 接触酶 | - |
由表10可知，保加利亚乳杆菌JMCC0018为革兰氏阳性、杆状、无芽孢、接触酶和氧化酶试验阴性的菌株。
D2.糖发酵特性实验：
将上述分离纯化菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中，37℃培养48h，观察颜色变化。具体结果见下表11。
表11保加利亚乳杆菌JMCC0018的鉴定结果
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
D3.菌株发酵特性：
取鲜牛奶75-98份，白砂糖2-15份，调配均匀后，于60-65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，接种嗜热链球菌JMCC0018 106CFU/mL，于37℃发酵约16h，检测其pH为4.0-4.5之间时，停止发酵，搅拌破乳后，4-8℃后酵24h后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果如表12所示：
表12嗜热链球菌JMCC0018发酵特性
| 菌株 | 风味和香气 |
| JM0455 | 酸感强所，制质酸构奶适的中香，气涩感强 |
| JM0237 | 拉丝，酸感较柔和，香气清淡 |
| JMCC0018 | 稠厚感，发酵香重、质构好 |
在本发明的上述技术方案中：
①嗜热链球菌JMCC0019(Streptococcus thermophiles)作为发酵剂的主要组成部分，具有产生香气物质的功能，产酸弱，酸感柔和，能够使得发酵出的酸奶具有浓郁的酪香气；
②嗜热链球菌JMCC16(Streptococcus thermophiles)作为发酵剂的组成部分，具有发酵风味香气清淡、清香的特点；
③将保加利亚乳杆菌JMCC0018(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)作为发酵剂的组成部分，具有产酸增香的功能，能够使得酸奶发酵提高同时提供独特的酸奶香气；
④嗜热链球菌JMCC0022(Streptococcus thermophiles)作为发酵剂的组成部分，具有发酵前期产酸快的功能，能够使得酸奶发酵过程中前期发酵速度提升并通过其自身代谢为发酵后期JMCC0018的生长提供适合的发酵条件和营养物质。
上述四种菌种相互配合，能够利用乳糖产生乳酸和香气物质，使得发酵出的酸奶酸甜可口口感良好，香气浓郁；嗜热链球菌JMCC16、嗜热链球菌JMCC0019、嗜热链球菌JMCC0022和德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018之间以活菌数1000:(1～10000):(1～1000):(1～100)配比，目的在于获得最优的酸奶状态和口感以及香气，其中，不同的嗜热链球菌可以在产酸速度、产粘能力、香气风味、后酸化、质构、噬菌体控制等特性进行互补，优化组合，如果保加利亚乳杆菌JMCC0018和嗜热链球菌JMCC0022添加量增多，酸奶保质期的后期酸度会快速上升影响酸奶口感，添加量减少，酸奶的发酵速度变慢，影响产能，且香气不明显，失去原有的口感，造成风味不足；如果嗜热链球菌JMCC0019和嗜热链球菌JMCC16加的多，发酵速度提高不明显造成浪费，同时产品存放后期由于嗜热链球菌大量死亡造成产品口感状态变差，加的少则发酵速度和香气明显变差，影响产品品质。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明的酸奶复合发酵剂JLB-1510配方中各菌种，均采用我国分离自传统发酵乳制品中的优良菌株，进行科学合理的配比，通过对4种不同程度的弱后酸化菌株按照不同比例复合组成风味好后酸弱的发酵剂，同时在常温(30℃)下进行贮藏实验，以期得到一组后酸化较慢，适用于工业上生产长保质期酸奶的发酵剂组，本土菌株能够更好的适应我国的温度及环境，生长特性更加适合现有条件，能够利用乳糖产生乳酸和香气物质，使得发酵出的酸奶酸甜可口，口感良好，香气浓郁，能克服现有酸奶在运输过程中冷链不完善造成的酸奶后酸影响产品口感和状态的弊病。
本发明适用于所有酸奶复合发酵剂JLB-1510，进一步应用于酸奶发酵时有效控制后酸。
具体实施方式
本发明下面将结合实施例作进一步详细说明。弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法、其应用，及相应的酸奶
实施例1-7弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法
本实施例1－7分别为一种弱后酸酸奶复合发酵剂，它们是由嗜热链球菌JMCC16、嗜热链球菌JMCC0019、嗜热链球菌JMCC0022和德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018四种菌粉以菌数1000:(1～10000):(1～1000):(1～100)混配，经弱后酸处理制，即得弱后酸酸奶复合发酵剂JLB-1510(JLB-1510为企业内部编号)。
其中：
嗜热链球菌JMCC16、嗜热链球菌JMCC0019、嗜热链球菌JMCC0022和德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018四种菌粉，每一种的制备方法均是：用单菌株的菌泥，于-60℃下预冻3h，于-40～-50℃、真空度为1Pa下，真空冷冻干燥35-45h，粉碎后制成。
实施例8-14制备弱后酸酸奶的方法
实施例8-14分别为一种制备弱后酸酸奶的方法，实质就是实施例1-7所提供的每种弱后酸酸奶复合发酵剂JLB-1510的一种应用，每种弱后酸酸奶复合发酵剂JLB-1510在实施例8－14均用于对鲜牛乳/复原奶进行发酵以制备弱后酸酸奶。
实施例8-14中，制备弱后酸酸奶的原料，以重量份数计，包括主料鲜牛乳/复原奶85～95份、辅料甜味剂(白砂糖、阿斯巴甜、蔗糖、木糖醇或麦芽糖中的至少一种)7～10份、辅料香精微量(常规种类及常规添加量)，弱后酸酸奶复合发酵剂JLB-1510为0.01～0.1份(实施例8-14分别一一对应地选用实施例1-7所提供的弱后酸酸奶复合发酵剂JLB-1510)。
实施例8-14中，弱后酸酸奶的制备方法按照以下步骤依次进行的基料调配、均质、杀菌、接种与发酵、破乳步骤，即得。其中：
1、基料调配
(1)混料
将主料鲜牛乳/复原奶打入混料罐中，加入辅料甜味剂，搅拌至甜味剂完全溶解；
(2)控温存放
控制温度在0～15℃，存放0～1h，于均质杀菌前15min开启搅拌15min；当存放时间达到1h，但不能及时进入均质机中进行均质时，需控制温度在0～10℃，并继续存放0～1h，于均质杀菌前15min开启搅拌15min。
2、均质
将基料输入均质机中进行均质，均质二级压力4.8～5.1MPa、一级压力17.2～17.8MPa；均质温度58～62℃。
3、杀菌
在93～98℃温度下杀菌时间300～310s。
4、接种
将杀菌后的料液降温至40～42℃，输入发酵罐；同时，自冷冻状态取出酸奶复合发酵剂，常温下活化30分钟，添加至发酵罐中，搅拌30～40min后,关闭搅拌；40～42℃保温发酵，自关闭搅拌时刻起4h时开始测酸，其中，测酸频次为每隔20min测酸一次，直至滴定酸度达到68～72゜T。
5、破乳
当所测滴定酸度达到68～72゜T，保持5min，进行破乳，搅拌10～20min时加入香精，继续搅拌10min，降至室温后灌装，入10-15℃库房保存，期间酸度≤77゜T。
说明：实施例8-14中,辅料甜味剂的种类标号①～⑤分别表示白砂糖、阿斯巴甜、蔗糖、木糖醇、麦芽糖。
实施例15实施例8-14所制的弱后酸酸奶的口感对比试验
本实施将实施例8-14利用实施例1-7所提供的发酵剂所制弱后酸酸奶，与商业发酵剂君乐宝WO-153所制酸奶进行了口感对比试验，对比结果见表13。
表13感官评价指标统计结果
通过表13可见：本发明利用酸奶复合发酵剂JLB-1510制的弱后酸酸奶，其整体喜好度、奶香气、酸味的感官指标均好于现有技术。
实施例16弱后酸酸奶的后酸控制研究
本实施例设计了两个实验组，对实施例8-14所制的弱后酸酸奶进行了后酸控制研究，其中：
实施组1为未经本发明的弱后酸控制工艺的商业发酵剂君乐宝WO-153(由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌种配制而成)所制酸奶；
实施组2为实施例1-7所提供的弱后酸酸奶复合发酵剂JLB-1510所制的弱后酸酸奶I～VII。
所有实验组均经过6小时左右发酵达到pH＜4.5，分别将发酵好的样品放置于4℃、15℃和30℃，每7天检测其pH值、酸度。检测结果如表14和表15所示。
表14各实验组酸奶21天内pH值变化表
表15各实验组酸奶21天内酸度变化表
由表14和表15可见：实验组2的产品在不同温度下放置一段时间后，由pH值和酸度显示，本发明所提供的复合发酵剂均可以改善产品的后酸。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 石家庄君乐宝乳业有限公司
<120>弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法、其应用，及相应的酸奶
<130> 20190717
<140> 201910644913X
<141> 2019-07-17
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1407
<212> DNA
<213> 嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles）
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tctcgctaga gtgcccaact gaatgatggc aactaacaat aggggttgcg ctcgttgcgg 360
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ctggtaagct accgtcacag tgtgaacttt ccactctcac acccgttctt gacttacaac 1020
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<213> 保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）
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Claims (12)
1.一种弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法，包括至少两种菌粉，且通过复合而成，其特征在于：所述菌粉包括复合嗜热链球菌，还包括德氏乳杆菌保加利亚亚种。
2.根据权利要求1所述的弱后酸酸奶复合发酵剂的制备方法，其特征在于：所述复合嗜热链球菌为嗜热链球菌JMCC0019、嗜热链球菌JMCC16、嗜热链球菌JMCC0022三种单菌株混合而成，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种为德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018单菌，所述嗜热链球菌JMCC16、嗜热链球菌JMCC0019、嗜热链球菌JMCC0022和德氏乳杆菌保加利亚亚种JMCC0018四种菌粉以菌数1000：（1～10000）：（1～1000）：（1～100）混配，经弱后酸处理制得酸奶复合发酵剂。
3.一种弱后酸酸奶复合发酵剂的应用，其特征在于：所述弱后酸酸奶复合发酵剂应用于鲜牛乳/复原奶进行发酵，以制备弱后酸酸奶。
4.一种弱后酸酸奶的制备方法，其特征在于：制备弱后酸酸奶的原料，以重量份数计，包括主料鲜牛乳/复原奶85～95份、辅料甜味剂7～10份，以及权利要求1或2中所述的弱后酸酸奶复合发酵剂0.01～0.1份；所述弱后酸酸奶的制备方法包括依次进行的调配基料、均质、杀菌、接种、发酵、破乳。
5.根据权利要求4所述的弱后酸酸奶的制备方法，其特征在于：所述调配基料的步骤是：将主料鲜牛乳/复原奶中加入辅料，搅拌，控温存放，得到基料。
6.根据权利要求5所述的弱后酸酸奶的制备方法，其特征在于：所述基料输入均质机中进行均质，所述均质的二级压力为4.8～5.1 MPa、一级压力为17.2～17.8 MPa，所述均质温度为58～62℃。
7.根据权利要求6所述的弱后酸酸奶的制备方法，其特征在于：所述杀菌在93～98℃温度下进行，且杀菌时间为300～310s。
8.根据权利要求7所述的弱后酸酸奶的制备方法，其特征在于：所述接种步骤是：
将杀菌后的料液降温至40～42℃，加入自冷冻取出、常温下活化30分钟的弱后酸酸奶复合发酵剂；
搅拌30～40min后，关闭搅拌，40～42℃下保温发酵，自关闭搅拌时刻4小时后开始测酸，每隔20～30min测酸一次，当所测滴定酸度达到68～72゜T时，保持5 min后破乳，搅拌20～30 min，降至室温即成。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的弱后酸酸奶的制备方法，其特征在于：所述甜味剂为白砂糖、阿斯巴甜、蔗糖、木糖醇或麦芽糖中的至少一种。
10.根据权利要求4-8中任一项所述的弱后酸酸奶的制备方法，其特征在于：所述原料的辅料还包括香精，在破乳后搅拌10～20min时加入，加入后继续搅拌10min。
11.根据权利要求5-8中任一项所述的弱后酸酸奶的制备方法，其特征在于：所述调配基料步骤中的控温存放，控制温度在0～15℃，存放0～1h，于均质杀菌前15min开启搅拌15min；当存放时间达到1h，但不能及时进入均质机中进行均质时，需控制温度在0～10℃，并继续存放0～1h，于均质杀菌前15min开启搅拌15min。
12.根据权利要求11所述的弱后酸酸奶的制备方法，其特征在于：所述弱后酸酸奶制得后不能即时饮用时，需降温后灌装，入4-10℃库房保存，期间酸度≤77゜T。
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| CN112655762A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-16 | 石家庄君乐宝乳业有限公司 | 酸奶发酵剂的制备方法及用其制备无添加酸奶的方法 |
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