嗜热链球菌JMCC0022、其分离纯化方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程领域,涉及一种菌株、其筛选方法及应用,具体地说,是一种嗜热链球菌JMCC0022、其分离纯化方法及应用。
背景技术
目前我国规定可用于食品的益生菌仅有双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌。在食品发酵、工业乳酸发酵、饲料行业和医疗保健领域均有比较广泛的应用。嗜热链球菌作为酸奶发酵剂的主要成分与保加利亚乳杆菌共同完成酸奶的发酵及酸奶风味的形成。研究表明,嗜热链球菌在发酵过程中,除进行产酸代谢外还可以产生丁二酮等酸奶特有的物质,增强酸奶的风味和口感。此外,嗜热链球菌也能够产生一些功能活性物质,如胞外多糖、细菌素和维生素。同时,在酸奶生产中分解乳糖产生乳酸是嗜热链球菌的主要生产功能,其产酸的快慢决定了酸奶的发酵时间,当嗜热链球菌产酸快时,发酵时间缩短、能耗降低、产能提高,具有重要的经济效益。因此筛选能够快速产酸,提高发酵速度的嗜热链球菌具有重要的经济效益。
发明内容
本发明的目的,是要提供一种嗜热链球菌JMCC0022,它具有快速发酵的特性。
本发明的另外一个目的,是提供一种嗜热链球菌JMCC0022的分离纯化方法,旨在从云南传统的发酵乳制品中采集样品,经样品富集、菌株的分离和菌株的纯化得纯培养物。
本发明还有一个目的,是提供一种嗜热链球菌JMCC0022的应用,旨在应用于快速发酵,生产酸奶。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是:
一种嗜热链球菌JMCC0022,它保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2018年5月28日,保藏编号为CGMCC NO. 15822,拉丁文名称为Streptococcus thermophilus。
作为本发明的一种限定,所述嗜热链球菌JMCC0022具有快速发酵的特性。
作为本发明的另一种限定,所述嗜热链球菌JMCC0022的16Sr RNA序列如下:
acgcggctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagattggctttaagagattagctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaaccattgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttattaccggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaacaaccatgcaccacctgtcaccgatgtaccgaagtaactttctatctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctggaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcggcactgaatcccggaaaggatccaacacctagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcgccaccggtgttcctccatatatctacgcatttcaccgctacacatggaattccactctccccttctgcactcaagtttgacagtttccaaagcgaactatggttgagccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtaggttagccgtccctttctggtaagctaccgtcacagtgtgaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagagctttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgccgaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctatgtatcgtcgcctaggtgagccattacctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgtagtggagcaattgcccctttcaaataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgtttccaatagttatcccccgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaagaagagcaagctcctctcttcagcgttctacttgcagta。
作为本发明的第三种限定,所述嗜热链球菌JMCC0022的Phes基因序列为:
ttgcttcgcactcatacaagtcctgtccaagctcgtacacttgataaacatgatttttctaaaggtcctcttaagatgatctcaccaggacgtgttttccgtcgtgataccgatgatgcgactcacagccaccagtttcaccaaatcgaaggtttggtcgttggtaaaaacatctcaatgggtgatctgaagggaacgcttgagatgattattcaaaaaatgtttggtgcagaacgtcgaatccgtttgcgtccttcttacttcccattcactgaaccttccgttgaggttgacgtgtcatgcttcaagtgtggtggtaaaggatgtaacgtatgcaagaatacaggttggattgagatccttggtgctggtatggttcacccacaagtgcttgagatgtcaggtgttgattctgaagaatattcaggttttgcttttggttt。
本发明还提供了一种嗜热链球菌JMCC0022的分离纯化方法,它按照以下步骤顺序进行:
①样品采集
取25mL云南传统的发酵乳制品,加入200~250mL生理盐水中,充分混匀,得到采集样品;
②样品富集
取2mL采集样品,加入80~120 mL的MRS液体培养基中,32~42℃培养64~80h,得到培养液;
③菌株分离
取1mL培养液,用无菌生理盐水将其稀释10倍,继续用无菌生理盐水分别做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍的梯度稀释,得到不同浓度的菌悬液;
取MRS固体培养基,融化后,倒入灭菌的培养皿中制成无菌平板,待其冷却、完全凝固后,吸取0.1mL不同浓度的菌悬液分别涂布到无菌平板,置32~42℃厌氧培养64~80h;
待平板出现典型菌落后,根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片,挑选出相应的单菌落;
④菌株纯化
挑取选中的单菌落,将其划线接种到另一无菌平板上,32~42℃厌氧环境培养64~80h,然后挑取该无菌平板上的单菌落,继续划线接种到另一无菌平板上,32~42℃厌氧环境培养64~80h,连续培养三次至培养基内菌落形态一致,显微镜观察菌株细胞形态单一后,即获得纯培养菌株,接种环挑取菌落接种至液体MRS培养基内,37℃培养24h;
⑤菌株保存
各取800μL纯培养菌株与无菌的50%甘油,置于菌种保存管内,混匀后在-70℃保存,同时接种MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。
作为本发明的进一步限定,所述MRS液体培养基主要由以下原料组成:酪蛋白胨 8~12 g,牛肉膏8~12 g,酵母膏4~6g,葡萄糖16~24 g,乙酸钠4~6 g,柠檬酸二胺1.5~2.5 g,吐温-80 0.8~1.2 g,K2HPO4 1.5~2.5 g,MgSO4·7H2O 0.1~0.3g,MnSO4·7H2O 0.04~0.06g,蒸馏水 1000mL。
本发明还有一种限定,所述MRS固体培养基主要由以下原料组成:酪蛋白胨 8~12g,牛肉膏8~12 g,酵母膏4~6g,葡萄糖16~24 g,乙酸钠4~6 g,柠檬酸二胺1.5~2.5 g,吐温-80 0.8~1.2 g,K2HPO4 1.5~2.5 g,MgSO4·7H2O 0.1~0.3g,MnSO4·7H2O 0.04~0.06g,琼脂13~17 g,蒸馏水 1000mL。
本发明还提供了一种嗜热链球菌JMCC0022的应用,它应用于快速发酵,生产酸奶。
本发明由于采用了上述的技术方案,其与现有技术相比,所取得的技术进步在于:
本发明的菌株具有更快的发酵速度,能够在相同条件下缩短生产时间,减少能耗和生产周期从而节约生产成本。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
具体实施方式
以下实施例只用于说明本发明,而并不限定本发明。
实施例1一种嗜热链球菌JMCC0022
本发明的嗜热链球菌JMCC0022,是从云南传统发酵乳中分离筛选出来的,已于2018年05月28日,保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号为CGMCC NO.15822,拉丁文名称为Streptococcusthermophilus。
实施例2 一种嗜热链球菌JMCC0022的分离纯化方法
①样品采集
取25mL云南传统的发酵乳制品,加入225mL生理盐水中,充分混匀,得到采集样品;
②样品富集
取2mL采集样品,加入100 mL的MRS液体培养基中,37℃培养72h,得到培养液;
③菌株分离
取1mL培养液,用无菌生理盐水将其稀释10倍,继续用无菌生理盐水分别做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍的梯度稀释,得到不同浓度的菌悬液;
取MRS固体培养基,融化后,倒入灭菌的培养皿中制成无菌平板,待其冷却、完全凝固后,吸取0.1mL不同浓度的菌悬液分别涂布到无菌平板,置37℃厌氧培养72h;
待平板出现典型菌落后,根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片,挑选出相应的单菌落;
④菌株纯化
挑取选中的单菌落,将其划线接种到另一无菌平板上,37℃厌氧环境培养72h,然后挑取该无菌平板上的单菌落,继续划线接种到另一无菌平板上,37℃厌氧环境培养72h,连续培养三次至培养基内菌落形态一致,显微镜观察菌株细胞形态单一后,即获得纯培养菌株,接种环挑取菌落接种至液体MRS培养基内,37℃培养24h;
⑤菌株保存
各取800μL纯培养菌株与无菌的50%甘油,置于菌种保存管内,混匀后在-70℃保存,同时接种MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。
实施例3~7嗜热链球菌JMCC0022的分离纯化方法
实施例3~7分别为一种嗜热链球菌JMCC0022的分离纯化方法,所述操作步骤均与实施例2相同,仅仅是生理盐水和培养基的体积、培养时间、培养温度等参数不同,具体见下表:
实施例8~12 MRS液体培养基
实施例8~12 分别为一种MRS液体培养基,其包含的原料类完全相同,区别仅在于原料的重量不同,具体见下表:
实施例13~17 MRS固体培养基
实施例13~17 分别为一种MRS固体培养基,其包含的原料类完全相同,区别仅在于原料的重量不同,具体见下表:
实施例18 嗜热链球菌JMCC0022的菌种细菌学特征
一.基本特征
实施例1所述嗜热链球菌JMCC0022基本特征如表1所示:
表1. 嗜热链球菌JMCC0022基本特征
二.糖发酵特性实验
将分离纯化的菌株挑取单菌落进行平板划线,37℃培养24h,传代一次,取菌悬液分别接种至糖发酵管中,37℃培养48h,观察颜色变化。具体结果见表2。
表2. 嗜热链球菌JMCC0022的鉴定结果
三.分子生物学鉴定
将实施例1所述嗜热链球菌JMCC0022进行分子生物学鉴定,通过DNA提取、PCR扩增,16SrRNA测序,NCBI网站blast最终确定为嗜热链球菌。
嗜热链球菌JMCC0022的16SrRNA测序结果如下:
acgcggctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagattggctttaagagattagctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaaccattgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttattaccggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaacaaccatgcaccacctgtcaccgatgtaccgaagtaactttctatctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctggaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcggcactgaatcccggaaaggatccaacacctagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcgccaccggtgttcctccatatatctacgcatttcaccgctacacatggaattccactctccccttctgcactcaagtttgacagtttccaaagcgaactatggttgagccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtaggttagccgtccctttctggtaagctaccgtcacagtgtgaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagagctttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgccgaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctatgtatcgtcgcctaggtgagccattacctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgtagtggagcaattgcccctttcaaataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgtttccaatagttatcccccgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaagaagagcaagctcctctcttcagcgttctacttgcagta
Phes基因测序结果如下:
ttgcttcgcactcatacaagtcctgtccaagctcgtacacttgataaacatgatttttctaaaggtcctcttaagatgatctcaccaggacgtgttttccgtcgtgataccgatgatgcgactcacagccaccagtttcaccaaatcgaaggtttggtcgttggtaaaaacatctcaatgggtgatctgaagggaacgcttgagatgattattcaaaaaatgtttggtgcagaacgtcgaatccgtttgcgtccttcttacttcccattcactgaaccttccgttgaggttgacgtgtcatgcttcaagtgtggtggtaaaggatgtaacgtatgcaagaatacaggttggattgagatccttggtgctggtatggttcacccacaagtgcttgagatgtcaggtgttgattctgaagaatattcaggttttgcttttggttt
四.菌株发酵特性
实验组:
取鲜牛奶95份,白砂糖6份,调配均匀后,于65℃、15MPa下均质,95℃杀菌300s后,降温至40℃,接种106CFU/mL嗜热链球菌JMCC0022,于37℃有氧发酵,检测其pH为4.5后停止发酵,记录发酵时间,摇匀后对发酵样品进行感官品评。
对照组:
1. 取鲜牛奶95份,白砂糖6份,调配均匀后,于65℃、15MPa下均质,95℃杀菌300s后,降温至40℃,接种106CFU/mL嗜热链球菌JM0137,于37℃有氧发酵,检测其pH为4.5后停止发酵,记录发酵时间,摇匀后对发酵样品进行感官品评。
2. 取鲜牛奶95份,白砂糖6份,调配均匀后,于65℃、15MPa下均质,95℃杀菌300s后,降温至40℃,接种106CFU/mL嗜热链球菌JM0152,于37℃有氧发酵,检测其pH为4.5后停止发酵,记录发酵时间,摇匀后对发酵样品进行感官品评。
感官品评结果如表3所示:
表3.感官品评结果
结论为:用嗜热链球菌JMCC0022发酵出的酸奶的风味优于另外两株菌株,且嗜热链球菌JMCC0022的发酵时间短。说明嗜热链球菌JMCC0022可应用于制备发酵乳制品。
实施例19 嗜热链球菌JMCC0022的快速发酵特性实验
实验材料:
河北一然生物科技有限公司生产的酸奶发酵剂JLB1510(批次:20180925),
河北一然生物科技有限公司加工的JMCC0022菌粉,生牛乳,白砂糖。
实验方法:
实验组:
取鲜牛奶90份,白砂糖10份,调配均匀后,于65℃、15MPa下均质,95℃杀菌300s后,降温至40℃,接种0.4g/kg 酸奶发酵剂JLB1510和0.1g/kg JMCC0022菌粉,于42℃有氧发酵,检测其pH为4.5时停止发酵,记录发酵时间,摇匀后得发酵乳。
对照组:
取鲜牛奶90份,白砂糖10份,调配均匀后,于65℃、15MPa下均质,95℃杀菌300s后,降温至40℃,接种0.5g/kg 酸奶发酵剂JLB1510,于42℃厌氧发酵,检测其pH为4.5时停止发酵,记录发酵时间,摇匀后得发酵乳。
表4.快速发酵特性实验结果
实验结果:
发酵时间:实验组pH达到4.5用时5.5h,对照组pH达到4.5用时8h;通过JMCC0022少量替换酸奶发酵剂JLB1510显著提升了酸奶发酵剂JLB1510的发酵速度。表明嗜热链球菌JMCC0022具有快速发酵的特性。
序列表
<110> 石家庄君乐宝乳业有限公司
<120> 嗜热链球菌JMCC0022、其分离纯化方法及应用
<141> 2018-12-05
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 1
acgcggctgg ctccaaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt 60
gacgggaacg tattcaccgc ggcgtgctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcatg 120
taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg agattggctt taagagatta gctcgccgtc 180
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cctacgcgtt actcacccgt tcgcaactca tccaagaaga gcaagctcct ctcttcagcg 1380
ttctacttgc agta 1394
<210> 2
<211> 443
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 2
ttgcttcgca ctcatacaag tcctgtccaa gctcgtacac ttgataaaca tgatttttct 60
aaaggtcctc ttaagatgat ctcaccagga cgtgttttcc gtcgtgatac cgatgatgcg 120
actcacagcc accagtttca ccaaatcgaa ggtttggtcg ttggtaaaaa catctcaatg 180
ggtgatctga agggaacgct tgagatgatt attcaaaaaa tgtttggtgc agaacgtcga 240
atccgtttgc gtccttctta cttcccattc actgaacctt ccgttgaggt tgacgtgtca 300
tgcttcaagt gtggtggtaa aggatgtaac gtatgcaaga atacaggttg gattgagatc 360
cttggtgctg gtatggttca cccacaagtg cttgagatgt caggtgttga ttctgaagaa 420
tattcaggtt ttgcttttgg ttt 443