CN107058159A - 在乳饮料中有良好存活性的植物乳杆菌jmcc0017、其筛选方法及应用 - Google Patents

在乳饮料中有良好存活性的植物乳杆菌jmcc0017、其筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种在乳饮料中有良好存活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017，它是从我国新疆传统发酵乳制品中筛选出的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO.12323。本发明依次通过菌株的筛选、菌株的复筛、菌株的后添加效果等实验，最终筛选出植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017，该菌具有耐受温度变化，高活性、弱后酸、无特殊植物风味、很好的耐酸耐胆盐和抗氧化性能的优良菌株，该植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017应用于制备乳酸菌饮料。

Description

在乳饮料中有良好存活性的植物乳杆菌JMCC0017、其筛选方 法及应用
技术领域
本发明属于微生物工程领域，涉及一种乳杆菌，具体涉及一种在乳饮料中有良好存活性的植物乳杆菌JMCC0017，同时，本发明还涉及该乳杆菌的筛选方法及应用。
背景技术
乳酸菌是存在于机体肠道正常菌群中，不可缺少的主要的有益菌之一，是肠道内重要的健康促进因子。研究发现，乳酸菌能够调节肠道微生物区系的平衡，增强机体的免疫力和抵抗力，促进肠道的生长发育和对营养物质的消化吸收，还具有抗衰老、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能。因此，维护肠道内乳酸菌群平衡，保持活性乳酸菌数量，对人体的健康具有重要意义。
目前，大部分由乳酸菌发酵制备的乳制品，如酸奶、乳饮料等主要是利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行发酵，这两种乳酸菌在乳制品发酵过程中能够产生相对较多的风味物质，优化产品风味。同时，为了加强发酵乳制品的健康功能，还会添加在肠道乳酸菌群中占据优势的双歧杆菌等。但是，这些菌在保存时受到环境温度的影响较大，在储存、运输等过程中须严格保证低温放置，保存温度波动容易对菌的活性、发酵风味等产生较大影响，最终导致产品失去原有风味以及健康因子。
发明内容
本发明的目的是提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017，该菌株是从我国新疆传统发酵乳制品中分离筛选而来，是一株具有耐受温度变化，高活性、弱后酸、无特殊植物风味、耐酸耐胆盐和抗氧化性能的优良菌株。本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017，已于2016年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.12323，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌JMCC0017的筛选方法，依次通过样品的采集、菌株的分离、纯化、鉴定等实验，最终筛选出植物乳杆菌JMCC0017。
本发明还有一个目的是提供了植物乳杆菌JMCC0017的应用，植物乳杆菌JMCC0017应用于制备乳酸菌饮料。
为实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案是：
一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017，它是从我国新疆传统发酵乳制品中筛选出的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO.12323。
进一步的，其16SrRNA的基因序列如下：
ATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGCAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCG。
进一步的，其pheS的基因序列如下：
CAAAGACGTGCTACTACGCACGCAGACGTCTGCTGATCAGCCGCGGTCACTTGAAAATCACGATTTTTCTAAAGGACCGCTGAAGGTCTTGTCACCTGGCCGCGTTTATCGGCGTGATACGGATGATGCAACCCATTCCCATCAATTTCATCAAATTGAAGGGTTAGTCGTGGACAAGCATATTACGATGGCTGATTTGAA GGGCACCTTAATTCTGGTTGCCAAGACTTTGTTTGGCGATCAATTCGATGTTCGGCTACGGCCAAGCTTCTTTCCATTCACGGAACCATCCGTAGAAGCTGATGTAACTTGCTTTAATTGCAATGGCAAGGGCTGTGCAATCTGTAAGCAAACGGGTTGGATCGAAGTACTGGGTGCCGGCATGGTTCACCCCCACGTGTTAGAAATGTCTGGCATTGATCCAGAAGAATATGGTGGCTTTGCCTTTGG。
本发明的所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017的筛选方法，按以下步骤顺序进行：
a、样品采集
取25mL新疆传统的发酵乳制品，加入到225mL无菌生理盐水中，充分混匀，得到混合液样品，
b、菌株分离、纯化
取1mL混合液样品，用无菌生理盐水按梯度稀释，分别稀释成10-3、10-4、10-5倍，得到不同浓度的样品稀释液；吸取0.1mL样品稀释液涂布于固体MRS培养基平板上，37℃厌氧培养72h后，根据标准植物乳杆菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑取备选菌落继续培养，连续传代不少于三次，获得纯化的菌落。
c、菌株的鉴定
从分离的菌株中，选择革兰氏染色阳性、H2O2试验阴性、能够产酸、不产气的菌株，将纯化的菌落置于无菌的20％甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存，将上述菌株通过DNA提取、PCR扩增，16SrRNA基因序列，pheS基因序列等实验数据综合分析，鉴定结果为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017。
进一步的，步骤c中MRS琼脂培养基由以下成分组成：
酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸钠：5g；柠檬酸二胺：2g；吐温-80：1g；K2HPO4：2g；MgSO4·7H2O：0.2g；MnSO4·7H2O：0.05g；琼脂：15g；蒸馏水：1000mL；
该培养基调节pH6.8±0.1。
进一步的，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017应用于制备益生菌菌粉或乳酸菌饮料。
进一步的，上述益生菌菌粉由以下重量份数的原料制成：
植物乳杆菌JMCC0017 2-15份，低聚糖10-50份，麦芽糊精5-30份。
进一步的，上述乳酸菌饮料由以下重量份数的原料制成：
纯牛奶60-80份，水20-40份，白砂糖3-6份，105-107CFU/mL的植物乳杆菌JMCC0017，105-107CFU/mL的保加利亚乳杆菌，105-107CFU/mL的嗜热链球菌。
具体实施方式
实施例1
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017及其筛选方法
一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017，它是从我国新疆传统发酵乳制品中筛选出的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO.12323。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017的筛选方法，按以下步骤顺序进行：
a、样品采集
取25mL新疆传统的发酵乳制品，加入到225mL无菌生理盐水中，充分混匀，得到混合液样品，
b、菌株分离、纯化
取1mL混合液样品，用无菌生理盐水按梯度稀释，分别稀释成10-3、10-4、10-5倍，得到不同浓度的样品稀释液；吸取0.1mL样品稀释液涂布于固体MRS培养基平板上，37℃厌氧培养72h后，根据标准植物乳杆菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑取备选菌落继续培养，连续传代不少于三次，获得纯化的菌落。
c、菌株的鉴定
从分离的菌株中，选择革兰氏染色阳性、H2O2试验阴性、能够产酸、不产气的菌株，将纯化的菌落置于无菌的20％甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存，将上述菌株通过DNA提取、PCR扩增，16SrRNA基因序列，pheS基因序列等实验数据综合分析，鉴定结果为植物乳杆菌JMCC0017。
植物乳杆菌JMCC0017的16SrRNA基因序列如下：
ATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGCAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCG。
植物乳杆菌JMCC0017的pheS基因序列如下：
CAAAGACGTGCTACTACGCACGCAGACGTCTGCTGATCAGCCGCGGTCACTTGAAAATCACGATTTTTCTAAAGGACCGCTGAAGGTCTTGTCACCTG GCCGCGTTTATCGGCGTGATACGGATGATGCAACCCATTCCCATCAATTTCATCAAATTGAAGGGTTAGTCGTGGACAAGCATATTACGATGGCTGATTTGAAGGGCACCTTAATTCTGGTTGCCAAGACTTTGTTTGGCGATCAATTCGATGTTCGGCTACGGCCAAGCTTCTTTCCATTCACGGAACCATCCGTAGAAGCTGATGTAACTTGCTTTAATTGCAATGGCAAGGGCTGTGCAATCTGTAAGCAAACGGGTTGGATCGAAGTACTGGGTGCCGGCATGGTTCACCCCCACGTGTTAGAAATGTCTGGCATTGATCCAGAAGAATATGGTGGCTTTGCCTTTGG。
植物乳杆菌JMCC0017的筛选方法，步骤c中MRS琼脂培养基由以下成分组成：
酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸钠：5g；柠檬酸二胺：2g；吐温-80：1g；K2HPO4：2g；MgSO4·7H2O：0.2g；MnSO4·7H2O：0.05g；琼脂：15g；蒸馏水：1000mL；
该培养基调节pH6.8±0.1。
本发明植物乳杆菌JMCC0017的生物学特性如下：
1、细胞形态和理化实验结果
植物乳杆菌JMCC0017的细胞形态和理化实验结果如下表1所示：
表1 JMCC0017的细胞形态和理化实验结果
由表1可知，植物乳杆菌JMCC0017为革兰氏染色阳性、杆状、无芽孢、接触酶和氧化酶实验阴性的菌株；该菌株葡萄糖产气实验阴性，葡萄糖酸钠产气实验阳性；碳水化合物产酸特性中，“+”表示发酵利用，“－”表示不发酵利用。
2、抗生素敏感性实验结果
表2 抗生素敏感性实验结果
抗生素名称 敏感性 抗生素名称 敏感性 抗生素名称 敏感性
哌拉西林/他唑巴坦 S 美洛培南 S 利福平 S
大观霉素 R 万古霉素 R 四环素 M
环丙沙星 R 呋喃妥因 S 复方新诺明 S
青霉素 S 头孢三曲松 S 阿米卡星 R
红霉素 S 头孢克罗 S 头孢他啶 S
氯霉素 S 头孢唑啉 S 头孢噻吩 S
阿奇霉素 M 头孢噻肟 S 头孢哌酮 S
克林霉素 M 氨苄西啉 S 庆大霉素 R
多西环素 S 头胞呋新 S 苯唑西林 S
克拉霉素 S 米诺环素 S
测定了植物乳杆菌JMCC0017对29种抗生素的敏感性，结果表明，该菌种对测试的21种抗生素表现敏感，对5种抗生素不敏感。
3、耐酸耐胆盐特性实验
将植物乳杆菌JMCC0017和本实验室保存的其他菌株(305、DL111105、N1115、N3117)分别挑取1接种环纯化菌株接种到MRS培养基中，37℃培养48h；各取1mL该培养基，分别加入到pH为2.5的磷酸盐缓冲液和3‰含牛胆盐的MRS培养溶液中37℃孵育，于0h、3h进行菌数的测定，并计算其存活率；
表3 耐酸耐胆盐数据
4、活菌抗氧化能力实验
活化菌株，在MRS液体培养基，37℃培养传代3次后，接种于MRS液体培养基中，37℃培养16h，收集菌液于4000rpm，4℃离心10min，收集菌体，生理盐水洗涤1次。用生理盐水将细胞浓度调整至1×108CFU/mL，备用；
A)羟自由基清除能力检测(Fenton法)
在10mL试管中依次加入1mL 5mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1mL 5mmol/L硫酸亚铁，1mL 3mmol/L过氧化氢和不同菌液混合均匀。用双蒸水补足10mL，37℃水浴15min，于4℃、6000rpm离心10min，取上清液在510nm处测定吸光度(以双蒸水为参比)。
HO·清除率(％)＝[(Ao-As)/Ao]×100％
Ao为无样品的OD值；As为有样品的OD值。
B)超氧阴离子清除能力检测(邻苯酚自氧化法)
在不同菌液样品中加入4.5mLTris-HCl(pH 8.2 150mmol/L)，25℃水浴20min，加入0.4mL 1.2mmol/L邻苯三酚，25℃水浴5min，立即加入2滴8mol/L HCl终止反应。取上清液在325nm处测定吸光度(以双蒸水为参比)。
O2 —清除率(％)＝[1-(Ao/As)]×100％
Ao为无样品的OD值；As为有样品的OD值。
C)DPPH清除能力检测
在不同菌液样品中加入1mL 0.2mmol/L DPPH·无水乙醇溶液，混匀后在室温下避光反应30min，并在6000rpm离心10min，取上清液在517nm处测定吸光度(以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液为参比)。空白组以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液。
清除率＝[1-(As-Aj)/Ao]×100％
Ao为对照品的OD值；As为有样品的OD值；Aj为空白组的OD值。
表4 抗氧化性能测试数据
5、不同温度保存下植物乳杆菌JMCC0017的生存力和产酸能力对比测试
(1)菌株的筛选
a、自君乐宝乳业乳酸菌菌种库中挑选100株菌株，包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌等。将冻存管中的菌株接种至液体MRS培养基37℃培养48h为第一代；依次活化三代，并测定其活菌数。
b、以菌液溶度为107CFU/mL接种于9mL脱脂奶中，置于37℃放置培养，根据菌株种类的不同，选择培养时间，一般乳杆菌控制在20-36h,培养完毕后取出样品快速降温至25℃以下，震荡破乳并转入4℃冷藏过夜。若20h前出现凝乳则记录凝乳时间并震荡后4℃过夜后再存于37℃。
c、取出b步骤中的培养样品，分别于37℃、常温、4℃放置，每7d检测一次，观察21d内样品的pH值及活菌数等指标。将37℃下放置21d内活菌数仍保持在106CFU/mL以上，pH值不低于3.5，且发酵风味无明显异味的菌株挑选出来，共16株。
(2)菌株的复筛
a、将上述(1)中初筛得到的16株乳酸菌重新接种至乳饮料A中，初始菌液溶度为107CFU/mL，置于37℃放置培养，发酵结束后置于4℃冷藏过夜。
b、a步骤中的乳饮料A，由以下重量分数的原料制备而成：生牛奶10-50份，白砂糖2-20份，果葡糖浆2-10份，水10-50份。
c、取出a步骤中的培养样品，分别于37℃、常温、4℃放置，每7d检测一次，观察21d内样品的pH值及活菌数等指标。将37℃下放置21d内活菌数仍保持在106CFU/mL以上，pH值不低于3，且发酵风味无明显异味的菌株挑选出来，共5株。
(3)菌株后添加效果
a、将上述(2)中复筛得到的5株乳杆菌，编号分别为JMCC0017、305、DL111105、N1115、N3117，以初始菌液溶度为104CFU/mL和105CFU/mL分别添加至乳饮料B中。
b、a步骤中的乳饮料B，由以下重量分数的原料制备而成：生牛奶10-50份，白砂糖2-20份，果葡糖浆2-10份，水10-50份，保加利亚乳杆菌0.5-10份，嗜热链球菌0.5-10份。
c、将a步骤中的样品分别于37℃、常温、4℃放置，每7d检测一次，观察21d内样品的pH值、酸度及活菌数等指标。经过酸度和风味比较，确定JMCC0017在37℃条件下保存21d后，仍无明显的植物乳杆菌特殊异味，且菌株活性强，产酸弱，是一株在乳饮料中可添加的有良好存活性的乳杆菌。
表5 不同温度保存下备选菌株的生存力和产酸能力
实施例2 含植物乳杆菌JMCC0017的乳酸菌饮料的制备
将纯牛奶60份，水30份，白砂糖5份混合均匀于110℃下灭菌15min制备培养基液；
将106CFU/mL的植物乳杆菌JMCC0017、106CFU/mL的保加利亚乳杆菌和106CFU/mL嗜热链球菌接入培养基液中混匀，39℃发酵至pH至4.2-4.6，终止发酵，冷却灌装，冷藏保存。
制备得到的含植物乳杆菌JMCC0017的乳酸菌饮料具有抗氧化功能、无特殊植物风味。
实施例3 含植物乳杆菌JMCC0017的益生菌菌粉的制备
原料组成：植物乳杆菌JMCC0017 8份，低聚糖40份，麦芽糊精15份；该益生菌菌粉制备工艺为：按配方比例称取菌粉、低聚糖、麦芽糊精进行混合，在真空分装机上进行分装，2g/袋，贴标入库，冷藏保存。
制备得到的益生菌粉具有抗氧化功能且产品中活性乳酸菌总数≥4×1010CFU/袋。
SEQUENCE LISTING
<110> 石家庄君乐宝乳液有限公司
<120> 在乳饮料中有良好存活性的植物乳杆菌JMCC0017、其筛选方法及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌植物乳杆菌JMCC0017的16SrRNA基因序列
<400> 1
atgcagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat catgatttac atttgagtga 60
gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga agcgggggat aacacctgga 120
aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt ccgagcttga aagatggctt 180
cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atggtggggt aacggctcac 240
catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggcaatcggc cacattggga ctgagacacg 300
gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga 420
acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta accagaaagc cacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540
aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag 600
tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact 720
gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatacc 780
gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat 840
taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc 960
ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg gatacaggtg 1020
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa 1140
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200
tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc 1260
cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat 1320
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttaggaacca gccgcctaag 1440
gtgggacaga tgattagggt gaagtcg 1467
<210> 2
<211> 450
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌植物乳杆菌JMCC0017的pheS基因序列
<400> 2
caaagacgtg ctactacgca cgcagacgtc tgctgatcag ccgcggtcac ttgaaaatca 60
cgatttttct aaaggaccgc tgaaggtctt gtcacctggc cgcgtttatc ggcgtgatac 120
ggatgatgca acccattccc atcaatttca tcaaattgaa gggttagtcg tggacaagca 180
tattacgatg gctgatttga agggcacctt aattctggtt gccaagactt tgtttggcga 240
tcaattcgat gttcggctac ggccaagctt ctttccattc acggaaccat ccgtagaagc 300
tgatgtaact tgctttaatt gcaatggcaa gggctgtgca atctgtaagc aaacgggttg 360
gatcgaagta ctgggtgccg gcatggttca cccccacgtg ttagaaatgt ctggcattga 420
tccagaagaa tatggtggct ttgcctttgg

Claims (8)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017，其特征在于,它是从我国新疆传统发酵乳制品中筛选出的益生菌，该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO.12323。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌JMCC0017，其特征在于，其16SrRNA的基因序列如下：
ATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGCAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCG。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌JMCC0017，其特征在于，其pheS的基因序列如下：
CAAAGACGTGCTACTACGCACGCAGACGTCTGCTGATCAGCCGCGGTCACTTGAAAATCACGATTTTTCTAAAGGACCGCTGAAGGTCTTGTCACCTGGCCGCGTTTATCGGCGTGATACGGATGATGCAACCCATTCCCATCAATTTCATCAAATTGAAGGGTTAGTCGTGGACAAGCATATTACGATGGCTGATTTGAAGGGCACCTTAATTCTGGTTGCCAAGACTTTGTTTGGCGATCAATTCGATGTTCGGCTACGGCCAAGCTTCTTTCCATTCACGGAACCATCCGTAGAAGCTGATGTAACTTGCTTTAATTGCAATGGCAAGGGCTGTGCAATCTGTAAGCAAACGGGTTGGATCGAAGTACTGGGTGCCGGCATGGTTCACCCCCACGTGTTAGAAATGTCTGGCATTGATCCAGAAGAATATGGTGGCTTTGCCTTTGG。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述的植物乳杆菌JMCC0017的筛选方法，其特征在于，按以下步骤顺序进行：
a、样品采集
取25mL新疆传统的发酵乳制品，加入到225mL无菌生理盐水中，充分混匀，得到混合液样品，
b、菌株分离、纯化
取1mL混合液样品，用无菌生理盐水按梯度稀释，分别稀释成10-3、10-4、10-5倍，得到不同浓度的样品稀释液；吸取0.1mL样品稀释液涂布于固体MRS培养基平板上，37℃厌氧培养72h后，根据标准植物乳杆菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑取备选菌落继续培养，连续传代不少于三次，获得纯化的菌落。
c、菌株的鉴定
从分离的菌株中，选择革兰氏染色阳性、H2O2试验阴性、能够产酸、不产气的菌株，将纯化的菌落置于无菌的20％甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存，将上述菌株通过DNA提取、PCR扩增，16SrRNA基因序列，pheS基因序列等实验数据综合分析，鉴定结果为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JMCC0017。
5.根据权利要求4所述的植物乳杆菌JMCC0017的筛选方法，其特征在于，步骤c中MRS琼脂培养基由以下成分组成：
酪蛋白胨：10g；牛肉膏：10g；酵母膏：5g；葡萄糖：20g；乙酸钠：5g；柠檬酸二胺：2g；吐温-80：1g；K2HPO4：2g；MgSO4·7H2O：0.2g；MnSO4·7H2O：0.05g；琼脂：15g；蒸馏水：1000mL；
该培养基调节pH6.8±0.1。
6.一种如权利要求1-3任一项所述的植物乳杆菌JMCC0017的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌JMCC0017应用于制备益生菌菌粉或乳酸菌饮料。
7.根据权利要求6所述的植物乳杆菌JMCC0017的应用，其特征在于，所述益生菌菌粉由以下重量份数的原料制成：
植物乳杆菌JMCC0017 2-15份，低聚糖10-50份，麦芽糊精5-30份。
8.根据权利要求6所述的植物乳杆菌JMCC0017的应用，其特征在于，所述乳酸菌饮料由以下重量份数的原料制成：
纯牛奶60-80份，水20-40份，白砂糖3-6份，105-107CFU/mL的植物乳杆菌JMCC0017，105-107CFU/mL的保加利亚乳杆菌，105-107CFU/mL的嗜热链球菌。
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