CN108148789A - 一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用，所述鼠李糖乳杆菌其保藏的分类学名称为：鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）zrx01；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2017年12月22日；保藏号是CGMCC No.15076。本发明筛选的鼠李糖乳杆菌zrx01所产细菌素可以抑制多种有害菌，尤其是对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、炭疽杆菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌有较强的抑制作用，但对植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌没有抑制作用，对鼠李糖乳杆菌zrx01自身同大多数细菌素一样无抑制性。

Description

一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用

技术领域

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌及其在制 备细菌素中的应用。

背景技术

食品安全是人们选择食品的重要方面，其中食源性微生物引发的疾病在 发达和发展中国家均广泛存在，严重威胁公共健康。经过多年研究，与危害健康 相关的食品病原微生物已经得到鉴定，比如沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)和大 肠杆菌(Eschericiacoli)，这两种菌引起75％的食源性疾病。通过化学药物可以抑 制病原菌的生长，但是抗生素的滥用使病原菌产生耐药性，严重威胁人类的健康， 所以天然产物得到越来越多的重视。细菌素是由乳酸菌产生的具有抑菌活性肽类 或蛋白类物质，具有广泛的抑菌谱，可用于食品的防腐。产生细菌素的菌种来源 于食品、动物、植物和临床样品，而且不同的菌种产生的细菌素种类不尽相同， 如nisin(Lactococcussp.)、pediocin(Pediococcussp.)、lactocin(Lactobacillussp.)、 enterocin(Enterococcussp.)，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌产生更多的细菌素。

细菌素是一种由细菌核糖体代谢产生的多肽或蛋白类物质，产生细菌素 的菌体自身对其免疫，但对多种食源性菌和病原菌有抑制作用，因此细菌素作为 防腐剂应用在食品中具有极大的意义。乳酸菌细菌素可以抑制甚至杀死食品中的 部分腐败菌和病原菌，是一种天然的食品防腐剂。用乳酸菌发酵乳制品不仅可以 增加产品中的活菌数，而且可以延长产品的保质期，其发酵时产生的细菌素具有 无毒、无残留、无抗药性、无副作用，有一定的热稳定性，极易被人体内消化道 内部分蛋白酶降解，不会在人体内累积，不会引发不良反应等优点。抗生素在食 品中通常是禁止使用的，因此寻找一种自然安全的防腐剂便引起人们的日益关 注，而细菌素是一种天然、具有抗菌活性的物质，它使用能够部分减少甚至取代 抗生素的使用，同时也不会污染环境，因此细菌素作为一种天然的生物防腐剂， 受到了大众的关注，逐渐成为人们研究的热点。细菌素多为蛋白类物质，对其基 本生化特性进行研究，可以扩大其在食品中的应用。开菲尔粒(Kefirgrains)是传 统发酵乳制品开菲尔(Kefir)的发酵剂，其中混有多种活菌，包括乳酸菌和酵母菌， 对志贺氏菌，沙门氏菌等病原菌都有强烈的抑制作用，经常食用开菲尔制品可在 人体胃肠道中保持有益菌群的优势作用。从开菲尔粒中分离筛选产细菌素的菌株 不存在食品安全为题，可用于开发生产天然防腐剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌(从开菲尔粒中分离 筛选得)，其保藏的分类学名称为：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)zrx01； 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年12月 18日；保藏号是CGMCC No.15076。

优选的，所述的鼠李糖乳杆菌在制备细菌素中的应用，包括以下步骤： 1)发酵液制备：将鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃，初始pH 6.2，培养18h得到发酵液；

2)细菌素提取：将1)制备的发酵液离心(12000g，15min)去菌体沉淀，上清 液过0.22μm的微孔滤膜，用乙酸乙酯与发酵上清液按体积比1:1混合萃取1h， 45℃旋蒸后加入1mL磷酸缓冲液(pH 6.8)重溶后进行冷冻干燥得到细菌素。

所述MRS液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g，硫酸锰0.25g，葡萄 糖20g，乙酸钠5g；，MgSO₄﹒7H₂O 0.58g，柠檬酸氢二胺2g，磷酸氢二钾2 g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，吐温-801mL，蒸馏水1000mL。

优选的，所述步骤2)中用乙酸乙酯与发酵上清液按体积比1:1混合萃取采 用的是超声波-微波协同萃取，将混合液置于超声波微波协同萃取仪中，设置超 声功率30W，微波功率200W。

本发明产生的有益效果是：1、本发明从开菲尔粒中筛选出鼠李糖乳杆菌 zrx01，来源安全，毒副作用小。2、该菌产细菌素热稳定性较好，121℃高温高 压处理30min仍保留70.53％抑菌活性，pH稳定性较好，在pH为3-9的范围内 均有抑菌性，在pH 4时抑菌活性最强，pH 9时仍保留对照组抑菌圈直径的86％， 对胃蛋白酶敏感，37℃水浴1h后，残余抑菌活力76.82％。3、本发明筛选的鼠 李糖乳杆菌zrx01所产细菌素可以抑制多种有害菌，尤其是对革兰氏阳性菌金黄 色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、炭疽杆菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌、空肠弯曲杆 菌、酸土脂环酸芽孢杆菌有较强的抑制作用，但对植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌没有抑制作用，对鼠李糖乳杆菌zrx01自身同大多数细菌素一样无抑制性。

附图说明

图1是鼠李糖乳杆菌zrx01个体形态特征-呈杆状、单个或成排连接；

图2是鼠李糖乳杆菌zrx01系统发育树；

图3是鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的过氧化氢排除试验结果，图中1和2分别 是发酵上清液不用过氧化氢酶处理和发酵上清液用过氧化氢酶处理下的抑菌圈；

图4是鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的有机酸排除试验结果；图中1-3和CK分 别是有机酸(乙酸1、盐酸2、乳酸3)和发酵上清液(CK)处理下的抑菌圈；

图5是鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的温度稳定性试验结果；

图6为鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的pH稳定性试验结果；

图7为鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的不同蛋白酶作用下稳定性试验结果。

具体实施方式

实施例1

所述鼠李糖乳杆菌zrx01是从开菲尔粒中分离筛选得到，将冻藏zrx01菌 株接于MRS培养基中，200r/min、37℃恒温培养24h，作为一级种子液。按2％ 的接种量将一级种子接种至100mL MRS培养基中，过夜培养作为二级种子液， 4℃冰箱备用。将培养好的二级种子液zrx01平板划线于MRS平板上，37℃培 养2-3d，观察菌落形态。挑取单菌落经革兰氏染色，于显微镜下观察菌体形态。 结果表明菌株zrx01的菌落呈湿润的乳白色液滴状，不透明，质地均匀，边缘整 齐。经革兰氏染液染色，显微镜观察，菌体成短杆状的革兰氏阳性菌(图1)。 生化特性(表1)显示菌株zrx01可发酵单糖、水杨苷等糖苷，能利用明胶、淀 粉大分子物质，不能利用乳糖和三糖中的棉子糖。伏-普实验为阳性，可发酵葡 萄产生丙酮等。马尿酸钠和七叶苷显示阳性，说明其可水解七叶苷为厌氧肠道杆 菌。

挑取单菌落接种于MRS液体培养基(胰蛋白胨10g，硫酸锰0.25g，葡 萄糖20g，乙酸钠5g；，MgSO₄﹒7H₂O 0.58g，柠檬酸氢二胺2g，磷酸氢二钾 2g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，吐温-801mL，蒸馏水1000mL)中37℃，初 始pH 6.2，培养18h得到单克隆菌液，呈杆状、单个或成排连接(如图1所示)。 取单克隆菌液，使用DNA提取试剂盒按其使用说明进行基因组DNA提取，使 用乳酸菌通用引物(引物27F序列：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′， 引物1492R序列：5′-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3′)，16S rDNAPCR 扩增，测序结果在NCBI上进行序列比对并采用MEGA 5.10建立进化树。

该菌的16S rDNA如序列表SEQ ID NO：1所示，综合乳酸菌生理生化鉴 定(表1)和16S rDNA(图2)系统发育分析，鉴定该菌株zrx01为鼠李糖乳杆 菌(Lacttobacillusrhamnosus)。

表1乳酸菌生理生化特性

注：“+”，表示阳性，“-”，表示阴性。

鼠李糖乳杆菌在制备细菌素中的应用，包括以下步骤：

1)发酵液制备：将鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃，初始pH 6.2，培养18h得到发酵液；MRS液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g，硫 酸锰0.25g，葡萄糖20g，乙酸钠5g；，MgSO₄﹒7H₂O 0.58g，柠檬酸氢二胺2 g，磷酸氢二钾2g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，吐温-801mL，蒸馏水1000mL；

2)细菌素提取：将1)制备的发酵液离心(12000g，15min)去菌体沉淀，上清 液过0.22μm的微孔滤膜，用乙酸乙酯与发酵上清液按体积比1:1混合萃取1h (采用的是超声波-微波协同萃取，将混合液置于超声波微波协同萃取仪中，设 置超声功率30W，微波功率200W)，45℃旋蒸后加入1mL磷酸缓冲液(pH 6.8) 重溶后进行冷冻干燥得到细菌素。

抑菌试验

从新活化好的各指示菌平板上挑取一株单菌落，接种至50mL的对应培养基中， 于相应温度下，250r/min恒温振荡培养过夜，将各菌悬浮液以1.0％～1.5％的量转 接于100mL的各对应培养液中，直至OD₆₀₀为0.35～0.4时停止培养，于4℃冰 箱中保存备用。将培养好的鼠李糖乳杆菌zrx01单克隆菌液12000g、4℃离心 15min去菌体沉淀，上清液过0.22的微孔滤膜滤膜，用乙酸乙酯与发酵上清液1:1 萃取1h，47℃旋蒸将其浓缩为原来的1/20，得到细菌素溶液，做抑菌试验。将 培养过夜的各指示菌涂布在对应的固体培养基平板中，用直径为6mm的打孔器 打孔，加入旋蒸获得的细菌素溶液，100μL/孔做抑菌实验。结果如表2所示，细菌素zrx01可以抑制多种有害菌，尤其是对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、单 增李斯特氏菌、炭疽杆菌，但对对植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和菌体本身等益生菌 无抑制作用，对鼠李糖乳杆菌zrx01自身同大多数细菌素一样无抑制性。对革兰 氏阴性菌大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌有较强的抑制作用。

表2鼠李糖乳杆菌zrx01细菌素抑菌图谱

注：+++.抑菌圈直径20-30mm；++.抑菌圈直径15-20mm；+.抑菌圈直径10-15mm；-.无抑菌效果。

有机酸和过氧化氢的排除

用乙酸、盐酸、乳酸分别调未发酵培养基与发酵上清液相同pH，以发酵上清液 为对照做抑菌试验，用十字交叉法测量抑菌圈直径。过氧化氢排除实验，将过氧 化氢酶溶解于pH7的鼠李糖乳杆菌zrx01发酵上清液中，终浓度5g/L，37℃ 水浴2h，调至原始pH，以未添加的发酵上清液对照，检测过氧化氢酶处理后上 清液的抑菌活性。结果如图3、4，鼠李糖乳杆菌zrx01发酵上清液用过氧化氢酶 处理后抑菌圈由原来的16.33±0.5mm变为15.33±0.5mm，大小基本没变，因此产 生主要抑菌作用的不是过氧化氢。未发酵培养基用乙酸、盐酸、乳酸调制与发酵 上清液相同pH4.14做抑菌实验，均未产生抑菌圈。说明鼠李糖乳杆菌上清发酵液中产生的有机酸没有或不足以对指示菌产生抑菌作用。

鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的稳定性试验

将制备好的上清发酵液分别在-70℃、-20℃、4℃、20℃、40℃、60℃、80℃、 100℃、121℃下作用30min以室温下的为对照做抑菌试验，指示菌为大肠杆菌。 抑菌物质在不同的酸碱下有不同的抑菌强度，以大肠杆菌为指示菌，1mol/L的HCL和1mol/L的NaOH调节发酵上清液pH分别为3、4、5、6、7、8、9，在 室温下作用30min后调回原始发酵上清液的pH，做抑菌试验。用大肠杆菌作指 示菌，蛋白酶k、α-凝乳酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶分 别作用于发酵上清液，终浓度为5g/mL，37℃水浴1h，做抑菌试验。结果如图5， 121℃高温高压处理30min仍保留70.53％抑菌活性，该细菌素有较好的热稳定性。 在pH为3-9的范围内均有抑菌性，在pH 4抑菌活性最强，pH 9仍保留对照组 抑菌圈直径的86％，其对pH的抑菌稳定性较好。对胃蛋白酶敏感，37℃水浴1h 后，残余抑菌活力76.82％。不同蛋白酶能使细菌素活性降低，从而判断鼠李糖 乳杆菌zrx01产细菌素是多肽类细菌素。

序列表

<110> 河南科技学院

<120> 一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1483

<212> DNA

<213> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)

<400> 1

gccgtgggcc ggccggggcc ctatacatgc agtcgaacga gttctgatta ttgaaaggtg 60

cttgcatctt gatttagatt ttgaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 120

tgcccttaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcataa atccaagaac 180

cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta 240

ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaatgat acgtagccga actgagaggt 300

tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360

atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg 420

ggtcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac 480

ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540

gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600

gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660

gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720

ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac 780

aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt tggagggttt 840

ccgcccttca gtgccgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cgaccgcaag 900

gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960

gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatctttt gatcacctga gagatcaggt 1020

ttccccttcg ggggcaaaat gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatgact agttgccagc atttagttgg 1140

gcactctagt aagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200

atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaga 1260

ccgcgaggtc aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg 1320

cctacacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc 1380

cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccga agccggtggc 1440

gtaacccttt tagggagcga gccgtctaag gtgaccaagg atg 1483

Claims (6)

1.一种鼠李糖乳杆菌，其保藏的分类学名称为：鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）zrx01；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年12 月18日；保藏号是CGMCC No.15076。

2.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备细菌素中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于包括以下步骤：

1) 发酵液制备：将鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃，初始pH 6.2，培养18 h 得到发酵液；

2) 细菌素提取：将1)制备的发酵液离心（12000 g，15 min）去菌体沉淀，上清液过0.22μm的微孔滤膜，用乙酸乙酯与发酵上清液按体积比1:1混合萃取1h，45 ℃旋蒸后加入1 mL磷酸缓冲液（pH 6.8）重溶后进行冷冻干燥得到细菌素。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述MRS液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g，硫酸锰0.25 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g;，MgSO₄﹒7H₂O 0.58 g，柠檬酸氢二胺2 g，磷酸氢二钾2 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1000 mL。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述步骤2)中用乙酸乙酯与发酵上清液按体积比1:1混合萃取采用的是超声波-微波协同萃取，将混合液置于超声波微波协同萃取仪中，设置超声功率30W，微波功率200W。

6.权利要求2制备得到的细菌素。