CN103748220A - 来源于鼠李糖乳杆菌的细菌素 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能容易且大量地产生的、低浓度下抗菌力也高、而且抗菌谱广、进而产生耐性菌的可能性低的细菌素。该细菌素的特征在于，具有序列表的序列号1或序列号2所示的氨基酸序列、或者序列表的序列号1或序列号2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、置换、插入和／或加成而带来抗菌活性的氨基酸序列，并且等电点为12以上。

Description

来源于鼠李糖乳杆菌的细菌素
技术领域
本发明涉及对口腔内的疾病的病原菌发挥抗菌力的细菌素（bacteriocin）、以该细菌素作为有效成分的口腔内疾患的预防、改善和／或治疗用组合物、编码该细菌素的基因、插入该基因而得到的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞、通过该重组表达载体而转化后的转化体、该细菌素的生产方法、以及、产生该细菌素的新型乳酸菌株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）KO1株。
背景技术
现在，龋齿病和牙周疾病等口腔内疾病与全身健康的相关性正受到重视。因而，作为龋齿病和牙周疾病等口腔内疾病的治疗方法，正在大量开发对这些病原菌发挥抗菌力的肽。例如，非专利文献1中记载了关于通过鼠李糖乳杆菌strain68株产生的、低分子量细菌素鼠李肽A（rhamnosin A）。
另外，近年也在大量进行对龋齿菌和牙周病菌等口腔内疾病的病原菌发挥抗菌力的、新型的乳酸菌的分离鉴定。例如，本发明人以前提出了能够制造对口腔内疾病的病原菌的抗菌谱广、口味好，并且嗜好性优异的发酵物的、新型乳酸菌株鼠李糖乳杆菌KO3株（L8020菌）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei)YU3株和类干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）YU4株（参照专利文献1）。进而，口腔内疾病的治疗方法之中，作为抗菌肽和乳酸菌分离株以外的技术，还提出了利用抗生素的治疗方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2011／007584号
非专利文献
非专利文献1:R.Dimitrijevic,M.Stojanovic,I.Petersen,R.M.Jankov,L.Dimitrijevic,M.Gavrovic-Jankulovic、2009、Journal of Applied Microbiology（107）、2108－2115
发明内容
发明要解决的课题
但是，前述的各种抗菌肽的大部分是来源于人等哺乳类的肽，或人工合成的肽，因此不能容易且大量地产生这些肽。而且，低浓度的话抗菌力弱，因此使用它们时，高浓度、即大量的抗菌肽是必要的。
另外，就利用抗生素的治疗方法而言，由于滥用抗生素引起的多剂耐性菌的出现，有时无法获得其治疗效果。因此，正在需求可以容易且大量地产生、低浓度下抗菌力也高、进而产生耐性菌的可能性低的新型的细菌素。
解决课题的手段
本发明是鉴于上述情况而完成的，目的在于提供一种能容易且大量地产生的、低浓度下抗菌力也高、而且抗菌谱广、进而产生耐性菌的可能性低的细菌素。另外，目的还在于提供一种以该细菌素（含药学上允许的衍生物等）作为有效成分的口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物、编码该细菌素的基因、插入该基因而得到的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞、通过该重组表达载体而转化后的转化体、该细菌素的生产方法、以及产生该细菌素的新型乳酸菌株鼠李糖乳杆菌KO1株。
本发明人进行了深入研究，结果发现：专利文献1中提案的鼠李糖乳杆菌KO3株（L8020菌）（2009年6月10日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心（〒292－0818日本国千叶县木更津市上总镰足2－5－8）申请保藏，之后基于布达佩斯条约于2010年6月28日进行保藏移管请求，作为保藏号NITE BP－771而保藏）中产生的、具有序列号1记载的氨基酸序列的肽（hypothetical protein HMPREF0539＿2969、保藏号ZP＿04442437.1、以下记为Kog1）和具有序列号2记载的氨基酸序列的肽（hypothetical proteinHMPREF0539＿1169、保藏号ZP＿04440638.1、以下记为Kog2）作为抗菌谱广、低浓度下抗菌力高、而且产生耐性菌的可能性低的等电点为12以上的细菌素而发挥功能。
另外，本发明人进行了深入研究，结果在作为同样地产生Kog1和Kog2的新型乳酸菌株的、鼠李糖乳杆菌KO1株（2012年2月16日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－1065而保藏）的分离鉴定方面也获得了成功。即，通过使用鼠李糖乳杆菌KO3株和鼠李糖乳杆菌KO1株，能够容易且大量地产生抗菌谱广、低浓度下抗菌力高、而且产生耐性菌的可能性低的细菌素Kog1和Kog2。
进而，本发明人进行了深入研究，结果阐明了细菌素Kog1和Kog2的、抗菌谱广、低浓度下抗菌力高、产生耐性菌的可能性低的理由。在后面的实施例7在详细叙述，这是因为细菌素Kog1和Kog2具有关于牙周病菌等革兰氏阴性菌所具有的内毒素（LPS、Lipopolysaccharide）的灭活作用。
因而，本发明的第1实施方式的细菌素的特征在于，具有序列表的序列号1或序列号2所示的氨基酸序列、或者、序列表的序列号1或序列号2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、置换、插入和／或加成而带来抗菌活性的氨基酸序列，并且等电点为12以上。
优选地，前述细菌素的特征在于对全部龋齿菌、牙周病菌和念珠菌具有抗菌性。
本发明的第2实施方式的口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物的特征在于，以第1方案的细菌素、或者、前述细菌素的药学上允许的衍生物或药学上允许的盐类作为有效成分。
优选地，前述口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物的特征在于，是龋齿菌、牙周病菌和／或念珠菌的增殖抑制剂。
本发明的第3实施方式的基因的特征在于，编码第1方案的细菌素。
本发明的第4实施方式的重组表达载体的特征在于，是插入第3方案的基因而得到的。
本发明的第5实施方式的宿主细胞的特征在于，含有第4方案的重组表达载体。
本发明的第6实施方式的转化体的特征在于，是通过第4方案的重组表达载体转化后的转化体。
优选地，前述转化体是细菌。
本发明的第7实施方式的细菌素的生产方法的特征在于，包括：
培养鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）的培养工序；和
从通过前述培养工序得到的菌体培养物提取第1方案的细菌素的提取工序。
优选地，前述鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）是鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）KO1株（2012年2月16日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－1065而保藏）、和／或、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）KO3株（2010年6月28日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－771而保藏）。
进一步优选地，在前述培养工序中，添加念珠菌的死菌。
本发明的第8方案的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）KO1株的特征是2012年2月16日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－1065保藏。
发明的效果
根据本发明，可以提供能够容易且大量地产生的、抗菌谱广、而且产生耐性菌的可能性低的细菌素、以该细菌素（含药学上允许的衍生物等）作为有效成分的口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物、编码该细菌素的基因、插入该基因而得到的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞、通过该重组表达载体而转化后的转化体、该细菌素的生产方法、以及产生该细菌素的新型乳酸菌株鼠李糖乳杆菌KO1株。进而，本发明所涉及的细菌素的耐热性高，例如在煮沸条件下也维持抗菌性能。
附图说明
[图1]表示实施例2的0.39至25μM时的Kog1对白色念珠菌GDH18株的抗菌力的图。
[图2]表示实施例2的0.39至12μM时的Kog2对白色念珠菌GDH18株的抗菌力的图。
[图3]表示实施例3的Kog1、Kog2和其他的抗菌肽对远缘链球菌B－13株的抗菌力的图。
[图4]表示实施例4的Kog1、Kog2和其他的抗菌肽对变形链球菌NCTC10449株的抗菌力的图。
[图5]表示实施例4的Kog1、Kog2和其他的抗菌肽对变形链球菌Ingbritt株的抗菌力的图。
[图6]表示实施例5的Kog1、Kog2和其他的抗菌肽对伴放线菌聚集菌Hudoe001株的抗菌力的图。
[图7]表示实施例6的添加了念珠菌的死菌的鼠李糖乳杆菌KO1株的、在DNA微阵列中的Kog1的表达量的图。
[图8]表示实施例6的添加了念珠保有的死菌的鼠李糖乳杆菌KO1株的、在DNA微阵列中的Kog2的表达量的图。
[图9]表示根据实施例7的LPS和Kog1的量的关系的ccL2的分泌量的图。
[图10]表示根据实施例7的LPS和Kog1的量的关系的TNF－α的分泌量图。
[图11]表示根据实施例8的LPS和Kog2的量的关系的ccL2的分泌量的图。
[图12]表示根据实施例8的LPS和Kog2的量的关系的TNF－α的分泌量的图。
[图13]表示与以LPS为原因的各种疾病等的关系的图。
[图14]表示实施例8的实时定量RT－PCR的I型胶原／β－肌动蛋白的值的图。
[图15]表示由实施例9的煮沸实验得到的耐热数据的结果的图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明的方案。予以说明，本说明书中，“具有”、“包括”或“含有”这样的表达也包括“由……形成”或“由……构成”的意思。
（细菌素）
本发明的实施方式1的细菌素涉及具有特定的氨基酸序列、带来特定的效果、具有特定的特征的碱性抗菌肽。更具体地，本说明书中的“细菌素”，可以举出具有序列号1记载的氨基酸序列的碱性抗菌肽（KOg1）、或者具有序列号2记载的氨基酸序列的碱性抗菌肽（Kog2）。进而也包括：在具有序列号1和序列号2记载的氨基酸序列的碱性抗菌肽中，1个或数个氨基酸被缺失、置换、插入和／或加成，带来抗菌活性，并且等电点为12以上的碱性抗菌肽。“数个”是2至8个，优选是2至6个，更优选是2至5个，进一步优选是2至4个。
这样的具有在Kog1或Kog2的氨基酸序列中缺失、置换、插入和／或加成了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并且带来抗菌活性的细菌素的情况下，优选地，具有与Kog1或Kog2同等的抗菌力和近似的碱性（等电点）。进而优选对全部龋齿菌、牙周病菌和念珠菌具有抗菌性。
本实施方式1的细菌素也可以通过后面的实施方式4中详细叙述的使用鼠李糖乳杆菌KO1株或KO3株等的方法来产生。但是，也可以通过肽合成法或基因工程学的方法等该技术领域中的人工的常规方法来产生。关于基因工程学的方法在后面的实施方式3中详细叙述。
肽合成法的情况下，可以举出液相法或固相法。液相法是在溶液状态下进行反应，从反应混合物中分离精制生成物，以该生成物为中间体而用于接下来的肽延伸反应的方法。另一方面，固相法是使氨基酸与不溶于反应溶剂的固相载体结合，对该氨基酸顺次进行缩合反应，使肽链延伸的方法。
具体地，肽合成是首先使保护了氨基的氨基酸与保护了羧基的氨基酸脱水缩合，形成肽键。接着，除去氨基保护基后，在游离的氨基，从C末端朝N末端逐个地依次延长下一个氨基保护氨基酸。在脱水缩合反应中，活化羧基，使其与要结合的氨基反应。对于活化，可以举出二环己基碳二亚胺（DCC）法、活性酯法、酸酐法或叠氮法等，考虑其反应性的高低、外消旋化和其他的副反应而适当选择即可。为了防止缩合反应时的副反应，在氨基酸的氨基、羧基和／或侧链的官能基上导入保护基。这些保护基优选是在缩合反应的条件下稳定、在必要的时候能快速除去的基团。另外，优选氨基的保护基和羧基的保护基能够相互选择性地除去。
作为氨基的保护基，可以举出例如，苄基氧羰基（Bz）、叔丁基氧羰基（Boc）、对联苯基异亚丙基氧羰基或9－芴基甲基氧羰基（FMOc）等。作为羧基的保护基，可以举出例如，能形成烷基酯或苄基酯等的基团。
但是，在固相法的情况下，由于C末端的羧基与氯三甲苯基树脂、氯甲基树脂、氧甲基树脂或对烷氧基苄基醇树脂等载体结合，因此缩合反应优选在碳二亚胺等缩合剂的存在下、或使用N保护氨基酸活性酯或肽活性酯来实施。缩合反应结束后，除去保护基。固相法的情况下，肽的C末端与树脂的结合也被切断。之后，化学合成了的肽可以通过例如离子交换色谱、高效液相色谱（HPLC）、逆相色谱、亲和色谱、埃德曼分解法或气相色谱质谱分析（GC－MS）等来精制，解析。
通过这样的肽合成法等、或后述的基因工程学的方法和使用鼠李糖乳杆菌KO1株或KO3株的方法产生的本实施方式1的细菌素也包括药学上允许的该细菌素的衍生物等，能够作为接下来叙述的实施方式2的口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物的有效成分而利用。
（口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物）
本发明的实施方式2涉及以前述的实施方式1的细菌素及其药学上允许的衍生物等作为有效成分的、口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物。本实施方式2的口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物由于以前述的实施方式1的细菌素及其药学上允许的衍生物等作为有效成分，因此具有同样的特性。
这里，若对实施方式1中叙述的细菌素Kog1和Kog2的氨基酸序列及其特征简单说明的话，其具有碱性氨基酸和疏水性氨基酸的占比较多的特征。该特征与来源于哺乳类的抗菌肽近似，因此产生耐性菌的可能性低。另外，因为等电点为12以上，成为高碱性的抗菌肽，所以细胞毒性变小。进而，如后述的实施例所示，具有优异的抗菌力。对于这些Kog1或Kog2的效果的细节，参照后述的实施例。
需要说明的是，本说明书中，“口腔内疾病”意味着由例如龋齿菌、牙周病菌和／或念珠菌等引起的、口腔内的疾病。具体地，可以举出例如，龋齿病（虫牙）、牙肉炎、牙周炎、舌炎、鹅口疮或口角炎等。
作为龋齿菌，可以举出例如，变形链球菌（Streptococcus mutans）或远缘链球菌（Streptococcus sobrinus）等。作为牙周病菌，可以举出例如，伴放线菌聚集菌Hudoe001（Aggregatibacter actinomycetemcomitans Hudoe001）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、中间普雷沃氏菌（Prevotella intermedia）、齿垢密螺旋体（Treponema denticola）、福赛斯坦纳菌（Tannerella forsythensis）、伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans）或核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）等。作为念珠菌，可以举出例如，白色念珠菌（Candida albicans）、光滑念珠菌（Candida glabrata）或热带假丝酵母菌（Candidatropicalis）等。
本说明书中、“口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物”的意思是，优选为，前述的、成为龋齿菌、牙周病菌和／或念珠菌的增殖抑制剂的组合物。具体地，可以举出能够抑制龋齿菌、牙周病菌和／或念珠菌的增殖的、食品、医药品或口腔用组合物等。
更详细地，食品的情况下，可以举出例如，设想预防?改善虫牙、牙周病或口腔内感染症等的健康食品、营养补品、特定保健用食品、乳饮料、酸奶或芝士等。医药品的情况下，可以举出例如，液剂、片剂、颗粒剂、细粒剂、粉剂、锭剂、胶囊剂、口腔用喷雾或片剂等，优选经口给药的给药形态。口腔用组合物的情况下，可以举出例如，洗口剂、漱口水、牙膏、牙粉、牙水、口腔用软膏剂、凝胶剂、片剂、颗粒剂、细粒剂、果冻、片剂、锭剂、胶囊、糖果或口香糖等。
需要说明的是，就本实施方式2的口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物而言，为了调制各种食品、医药品或口腔用组合物等，也可以适当组合药学上允许的其他的组合物。进而，将该细菌素和该组合物制成衍生物或盐的形态来使用也是可以的。
作为衍生物，可以举出细菌素的部分置换体或加成化合物等肽衍生物。进而具体地，可以例示例如，将羧基酰胺化或酰化后的衍生物。作为盐的形态，可以举出氯化盐、硝酸盐或氢溴酸盐等无机酸盐、或者对甲苯磺酸盐、甲烷磺酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐或乳酸盐等有机酸盐等。
另外，就这些食品、医药品或口腔用组合物等而言，前述的实施方式1的细菌素的作为有效成分的含有量和一日的给药量能够根据该组合物等的种类来适当调节。
（基因）
本发明的实施方式3涉及编码前述的实施方式1的细菌素的基因。具体地，可以举出例如，具有序列号3（Kog1）或序列号4（Kog2）记载的碱基序列（和／或其互补链）的基因、聚核苷酸。
这样的具有序列号3（Kog1）或序列号4（Kog2）记载的碱基序列的基因，只要是该技术领域的技术人员，就能够使用常规方法从鼠李糖乳杆菌KO1株或KO3株进行DNA的分离精制、提取。另外，例如，也可以使用DNA合成试剂盒等，人工地进行DNA合成。
（重组表达载体）
分离精制或使用试剂盒等进行DNA合成后的基因序列，可以用于通过基因工程学的方法产生前述的实施方式1的细菌素时使用的重组表达载体。本实施方式4涉及插入前述的实施方式3的基因而得到的重组表达载体。该重组方法可以是技术人员利用的任意方法。作为重组表达载体的构建方法，例如，首先，进行具有序列号3（Kog1）或序列号4（Kog2）的碱基序列的基因的合成。接着，按照宿主细胞构建具有表达用基因构建物的重组表达载体，所述表达用基因构建物包含合成后的基因和用于使该基因在宿主细胞内表达的各种调节元件（启动子、核糖体结合部位、终止子、增强子和／或控制表达水平的各种顺式作用元件等）。
（宿主细胞、转化体）
如此构建的重组表达载体以能够表达地方式导入规定的宿主细胞。该导入方法可以是技术人员利用的任意方法。本实施方式5涉及含有该重组表达载体的宿主细胞。优选的是，宿主细胞是细菌。例如，可以举出乳酸菌、大肠菌或酵母等。进而，实施方式6涉及通过该重组表达载体而转化后的转化体。即，例如，可以举出在含有前述的实施方式5的重组表达载体的宿主细胞中发生了转化的转化细胞。优选地，转化体是细菌。与前述同样地，例如，可以举出乳酸菌、大肠菌或酵母等。在规定的条件下培养这些细菌。由此，前述的实施方式1的细菌素的宿主细胞（细菌）内的表达和产生成为可能，可以容易且大量地提取、精制。关于详细的生产方法，由于与后述的实施方式7中的培养乳酸菌鼠李糖乳杆菌的情况几乎是同样的，请参考。
（细菌素的生产方法）
本发明的实施方式7涉及使用鼠李糖乳杆菌的、前述的实施方式1的细菌素的生产方法。
具体地，包括：培养鼠李糖乳杆菌的工序；以及从通过培养工序得到的菌体培养物提取前述的实施方式1的细菌素的工序。优选地，该鼠李糖乳杆菌是鼠李糖乳杆菌KO3株和／或新型乳酸菌株鼠李糖乳杆菌KO1株。
需要说明的是，关于鼠李糖乳杆菌KO1株和KO3株，例如，接种于在121度灭菌20分钟后的MRS培养基等，在37度在大气下预培养48小时，用蒸馏水、超纯水或缓冲液等清洗后，通过离心分离等进行集菌，可以得到菌体。
由于鼠李糖乳杆菌KO1株和KO3株产生Kog1和Kog2，因此教导了只要是乳酸菌属鼠李糖乳杆菌种的菌株，就产生Kog1和Kog2。因此，大量培养乳酸菌属鼠李糖乳杆菌种的菌株，通过使用该技术领域的蛋白质提取的常规方法（例如，细胞破碎法等），能够容易且大量地得到所产生的Kog1和Kog2肽。
培养工序中，可以使用果汁培养基、野菜汁培养基、牛乳培养基、脱脂粉乳培养基、含乳成分的培养基或不含乳成分的半合成培养基等各种培养基。具体地，可以举出例如，还原脱脂乳并加热灭菌后的还原脱脂乳培养基、添加了酵母提取物的脱脂粉乳培养基、MRS培养基或GAM培养基等。
培养方法是静止培养、使PH恒定的中和培养、旋转培养或连续培养等，只要是该鼠李糖乳杆菌良好生长的条件就没有特别限定。鼠李糖乳杆菌KO3株的详细的菌学性质与实施方式8中后述的新型乳酸菌株鼠李糖乳杆菌KO1株的详细的菌学性质几乎相同。
需要说明的是，如果在培养工序中添加念珠属的菌的死菌，则可以更大量地获得Kog1和Kog2，因而优选（参照实施例6）。
（鼠李糖乳杆菌KO1株）
鼠李糖乳杆菌KO1株（2012年2月16日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－1065而保藏）是本发明人从人的口腔内新分离鉴定出的乳酸菌株。需要说明的是，鼠李糖乳杆菌KO1株是与鼠李糖乳杆菌KO3株同样，是被分类于产生KOg1和KOg2的乳酸菌属鼠李糖乳杆菌种，但各种蛋白质的表达量和基因组信息不同的新型的乳酸菌株。
鼠李糖乳杆菌KO1株，与16S rRNA的碱基序列的鼠李糖乳杆菌strainIDCC3201的碱基序列1443／1443之间显示100%的同源性，在革兰氏染色后的显微镜下呈现革兰氏阳性杆菌的模样，被认定为乳杆菌属鼠李糖菌种。该鼠李糖乳杆菌KO1株的菌学性质的特征是，革兰氏阳性乳酸杆菌、同型乳酸发酵、过氧化氢酶阴性、无芽胞形成能力、好氧条件下也能培养、形成菌体外多糖类。
如实施方式7中前述那样，通过培养本实施方式8的新型乳酸菌株鼠李糖乳杆菌KO1株，从培养得到的菌体培养物能够容易且大量地提取前述的实施方式1的碱性抗菌肽Kog1和Kog2，因此是有效的。
实施例
以下，用实施例详细说明本发明，但实施例并不限定本发明。
（制备例）
本制备例中，对被检测菌株的制备、培养方法进行说明。
作为念珠菌、龋齿菌和牙周病菌，使用白色念珠菌GDH18株、远缘链球菌B－13株、变形链球菌NCTC10449株、变形链球菌Ingbritt株、牙龈卟啉单胞菌Hudoi001株、和伴放线菌聚集菌Hudoe001株，各被检测菌株在日本国国立大学法人广岛大学牙学部和牙科医院接受提供。
白色念珠菌GDH18株用SD培养基（Difco社），在37度、24小时好氧条件下进行了预培养。远缘链球菌B－13株、变形链球菌NCTC10449株和变形链球菌Ingbritt株，用添加5%的酵母提取物（Difco社）的TSB培养基（Difco社），在37度、24小时好氧条件下进行了预培养。用添加了氯化血红素（5mg／L）和维生素K3（1mg／L）的BHI培养基（Difco社），将牙龈卟啉单胞菌Hudoi001株和伴放线菌聚集菌Hudoe001株在37度、使用Anaero Pack System（三菱气体化学株式会社）的厌氧条件下进行了96小时预培养。
培养后，这些念珠菌、龋齿菌和牙周病菌通过1000×g条件下的离心分离进行集菌，用1mM、PH6.8的磷酸盐缓冲液清洗两次，以最终浓度达到1×108cfu／mL或1×107cells／mL的方式进行悬浮。对链球菌属的菌株悬浮还进行了超声波处理。
（实施例1）
本实施例1涉及Kog1和Kog2的合成。
首先，为了确认作为细菌素的机能，通过用9－芴基甲基氧羰基作为保护基、用P－苯甲酰氧苄基醇作为树脂的茶袋法（Helmerhorst等人的方法（1999））合成具有序列号1记载的氨基酸序列的Kog1和具有序列号2记载的氨基酸序列的Kog2。碱性抗菌肽完成后，使用5%苯甲硫醚、5%苯酚、5%精制水和85%三氟醋酸的混合物，进行从树脂切断以及侧链上的脱保护基。
测定合成后的Kog1和Kog2的等电点（PI）和分子量（MW），Kog1为PI＝12.90、MW＝5485.5，Kog2为PI＝12.38、MW＝4686.6。抗菌肽中，hBD2（人β－防御素－2（参照Eur J.、2002、Oral Sci.（109）、121－124））作为碱性的抗菌肽是有名的，等电点为10左右。但是，本实施例2的Kog1和Kog2的等电点比该hBD2的等电点还高，与来源于哺乳类的抗菌肽近似，即确认了细胞毒性小。
需要说明的是，合成后的肽的精制和纯度的分析用高效液相色谱和逆相色谱进行。进而，通过质量分析仪（MALDI－TOF）进行了分子量的确认。
（实施例2）
本实施例2涉及针对白色念珠菌GDH18株的Kog1和Kog2的抗菌力的分析。
抗菌活性的评价是通过对Edgerton等人的方法（1998）加入若干改变后的方法进行的。将前述制备例记载的方法中培养、制备的白色念珠菌GDH18株的悬浮液20μL混合到含有0至25μM的前述实施例1中合成的Kog1或Kog2的1mM磷酸盐缓冲液20mL中，一边使其振动一边在37度培养90分钟。需要说明的是，作为对照，仅使用了1mM磷酸盐缓冲液20ML。通过加入360mL的YNB培养基（Difco社）而使反应停止，与对照组一起计数形成的菌落（colony forming units；CFUs），从而作为活菌的百分比。即，用（含Kog1或Kog2的悬浮液的CFUs／对照的悬浮液的CFU mL－1）×100的式子，算出百分比。
图1是表示实施例2的0.39至25μM的Kog1对白色念珠菌GDH18株的抗菌力的图。图2是表示实施例2的0.39至12μM的Kog2对白色念珠菌GDH18株的抗菌力的图。如图1和图2所示，Kog1和Kog2均在0.39μM的肽浓度下使白色念珠菌GDH18株100%死灭。
在相同方法和相同条件下，测定了作为抗真菌剂的两性霉素B、作为来源于牛乳的抗菌肽的牛乳铁蛋白抗菌肽B（具有序列号5记载的氨基酸序列）、作为来源于人唾液的抗菌肽的唾液富组蛋白5（具有序列号6记载的氨基酸序列）、和、日本专利第3472821号的抗菌肽JH8194（具有序列号7记载的氨基酸序列）的抗菌力，结果分别在5μM死灭100%、5μM死灭100%、100μM死灭100%、2.5μM死灭100%。需要说明的是，任一均与实施例1同样地用茶袋法进行了肽合成。
该结果证明：抗菌肽Kog1和Kog2在比所有这些抗真菌剂和抗菌肽更低的浓度下、即以少量就可以使念珠菌死灭。
（实施例3）
本实施例3涉及针对远缘链球菌B－13株的Kog1和Kog2的抗菌力的分析。具体地，示出了与hBD2和溶菌酶蛋白（Lysozyme）比较抗菌力的实施例。
远缘链球菌B－13株通过制备例中叙述的方法培养、制备。抗菌力的评价方法是使用与前述的实施例2同样的方法进行了评价。需要说明的是，对于各抗菌肽的浓度为0至100μM的情况进行了评价。
图3是表示实施例3的Kog1、Kog2和其他的抗菌肽对远缘链球菌B－13株的抗菌力的图。需要说明的是，对于图3的横轴的肽浓度（Concentration of peptide），用对数轴表示。如图3所示，hBD2在浓度为3.125μM时使远缘链球菌B－13株100%死灭。溶菌酶蛋白没能使远缘链球菌B－13株完全死灭。另一方面，Kog1在浓度为1.56μM时、Kog2在浓度为0.39μM时，使远缘链球菌B－13株100%死灭。因此证明了被检测菌株是远缘链球菌B－13株的情况下，在低浓度下也能够死灭。
（实施例4）
本实施例4涉及变形链球菌菌的Kog1和Kog2的抗菌力的分析。具体地，与前述的实施例同样地，示出了与hBD2和溶菌酶蛋白比较抗菌力的实施例。
变形链球菌NCTC10449株和变形链球菌Ingbritt株通过前述制备例的方法培养、制备。抗菌力的评价方法用与前述实施例3同样的方法评价、比较。需要说明的是，对于所有变形链球菌，均对抗菌肽的浓度为0至100μM的情况进行了评价、比较。
图4是表示实施例4的Kog1、Kog2和其他的抗菌肽对变形链球菌NCTC10449株的抗菌力的图。图5是表示实施例4的Kog1、Kog2和其他的抗菌肽对变形链球菌Ingbritt株的抗菌力的图。对于图4和图5的横轴的肽浓度（Concentration of peptide），用对数轴表示。如图4和图5所示，仍然，关于变形链球菌，与其他的抗菌肽相比，Kog1和Kog2在比较低的浓度下可以使大量的变形链球菌死灭。
另外，虽然没有图示，但评价出Kog1和Kog2对牙龈卟啉单胞菌Hudoi001株也发挥抗菌力。该结果也被以下内容所启示：专利文献1的实施例评价、记载了本发明人发现的鼠李糖乳杆菌KO3株对牙龈卟啉单胞菌Hudoi001株也发挥抗菌力。即，考虑专利文献1记载的实施例的话，可以推测鼠李糖乳杆菌KO3株表达Kog1和Kog2，该Kog1和Kog2发挥针对牙龈卟啉单胞菌Hudoi001株的抗菌力。基于此，启示了Kog1和Kog2对于其他的卟啉菌属牙龈卟啉单胞菌种的菌株（牙周病菌等）也同样的发挥抗菌力。
（实施例5）
进而，本发明人也分析了针对其他的牙周病菌的抗菌力。本实施例5涉及细菌素Kog1和Kog2对于牙周病菌伴放线菌聚集菌Hudoe001株的抗菌力的分析。具体地，示出了与前述同样的和hBD2以及唾液富组蛋白5、进而牛乳铁蛋白抗菌肽B以及牛乳铁蛋白抗菌肽H（人由来牛乳铁蛋白抗菌肽）比较抗菌力的实施例。
伴放线菌聚集菌Hudoe001株通过前述的制备例的方法培养、制备。抗菌力的评价方法使用与前述的实施例3同样的方法进行了评价、比较。需要说明的是，对各抗菌肽的浓度为0至50μM的情况进行了评价、比较。
图6是表示实施例5的Kog1、Kog2和其他的抗菌肽对伴放线菌聚集菌Hudoe001株的抗菌力的图。需要说明的是，对于图6的横轴的肽浓度（Concentration of peptide），用对数轴表示。如图6所示，Kog1在3.13μM时、Kog2在1.56μM时，使牙周病菌伴放线菌聚集菌Hudoe001株100%死灭。这是与牛乳铁蛋白抗菌肽B或hBD2同等或其以上的抗菌性。
（实施例6）
本实施例6涉及添加念珠菌的死菌的鼠李糖乳杆菌KO1株的培养。具体地，在白色念珠菌GDH18株的死菌的非存在下和存在下，培养鼠李糖乳杆菌KO1株，通过DNA微阵列系统测定Kog1和Kog2的表达量。
首先，在含0、2、4和6μg的白色念珠菌GDH18株的死菌的5mL的MRS培养基中，接种20μL的鼠李糖乳杆菌KO1株悬浮液，在37℃培养48小时。培养后，立即将菌悬浮于100mL的RNA protect reagent（Qiagen）和900ML的利福平（25mg／mL甲醇）（Sigma-Aldrich）中。之后，通过漩涡混合器混合15分钟，在室温培养10分钟。这些处理后，通过离心分离对菌进行集菌，废弃上清，从在－20℃保存的颗粒利用RNA提取试剂盒来精制。如此进行了前处理之后，用NimbleGen微阵列解析用软件进行微阵列数据的统计分析，进行了分析。
图7是表示实施例6的添加了念珠菌的死菌的鼠李糖乳杆菌KO1株的、在DNA微阵列中的Kog1的表达量的图。图8是表示实施例6的添加了念珠菌的死菌的鼠李糖乳杆菌KO1株的、在DNA微阵列中的Kog2的表达量的图。图7和图8中均为，与左端的仅KO1株的培养相比，使念珠菌（CaGDH18）的死菌共存而培养的情况下，依赖于其量（从左开始为2、4和6μg），Kog1和Kog2的表达量均增加了。
这些实施例的结果证明：通过培养新型乳酸菌株鼠李糖乳杆菌KO1株、以及同样地产生Kog1和Kog2的鼠李糖乳杆菌KO3株，能够容易且大量地产生抗菌谱广（龋齿菌、牙周病菌和念珠菌）、而且产生耐性菌的可能性低的等电点12以上的细菌素Kog1和Kog2。进而启示了，在乳酸菌属鼠李糖乳杆菌种的其他的菌株中，能够容易且大量地产生细菌素Kog1和Kog2。另外，根据这些结果，对于该技术领域的技术人员来说，通过培养用插入编码该细菌素Kog1或Kog2的基因而得到的重组表达载体转化后的乳酸菌或大肠菌等细菌，当然能够容易且大量地产生具有优异的抗菌力的细菌素Kog1或Kog2。
（实施例7）
本实施例7中，对于实施例1至6中证明了的、细菌素Kog1和Kog2的抗菌谱的广度、由于碱性的等电点引起的耐性菌的产生难度进行了研究。需要说明的是，本发明人预测了细菌素Kog1和Kog2或许将牙周病菌等革兰氏阴性菌所具有的LPS灭活，从而分析了LPS与细菌素Kog1和Kog2的关系。
首先，培养基使用添加了10%FBS（Fetal Bovine Serum）（Biologicalindustries,Haemek,Israel）、1%抗生素和1%L－谷氨酰胺的RPMI1640培养基。在24－微孔板中各添加400μL前述的各培养基，以100,000cells／well接种来源于小鼠的RAW264.7巨噬细胞样细胞。
需要说明的是，细菌素Kog1或Kog2使用的是与实施例1同样的物质，在微量离心管中，以下述四个条件，将牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）LPS（InvivoGen社制）（以下，P.g－LPS），与前述同样的培养基一起、在37度、5%CO2气相下培养2小时。（1）100ng／mL P.g－LPS positive control、（2）100ng／mL P.g－LPS＋5μM Kog1或Kog2、（3）100ng／mL P.g－LPS＋10μMKog1或Kog2、（4）100ng／mL P.g－LPS＋20μM Kog1或Kog2。
用Pipetman移液器吸取最初叙述的各个24－微孔板的培养基后，放入前述的四个条件的各微量离心管的培养基，与微孔板的细胞一起，在37度、5%CO2气相下培养12小时。之后，回收培养上清，通过ELISA法用吸光度450nM酶标仪对分泌到培养基中的趋化因子的ccL2的量、或细胞因子的TNF－α的量进行定量。由于它们均与炎症的形成有关，因此可以分析作为内毒素的LPS与细菌素Kog1和Kog2的关系。
图9是表示根据实施例7的LPS和Kog1的量的关系的ccL2的分泌量的图。即，表示使用LPS和Kog1进行了2小时孵育时的、分泌的趋化因子的ccL2的量（将Kog1为0μM的情况设为100%）（LPS＋Kog1→cell ccL2）。图9中，＊（有意义水平）表示P＜0.05，＊＊（有意义水平）表示P＜0.01，N＝3。如图9所示，Kog1的添加量越增加，所分泌的趋化因子的ccL2的量越减少。即，说明了细菌素Kog1具有LPS的灭活作用。
图10是表示根据实施例7的LPS和Kog1的量的关系的TNF－α的分泌量的图。即，表示用LPS和Kog1进行了2小时的培养时的、所分泌的细胞因子的TNF－α的量（将Kog1为0μM的情况设为100%）（LPS＋Kog1→cell TNF－α）。图10中，＊＊（有意义水平）表示P＜0.01、N＝3。如图10所示，Kog1的添加量越增加，所分泌的细胞因子的TNF－α的量越减少。即，与图9所示的结果同样地说明了细菌素Kog1具有LPS的灭活作用。
图11是表示根据实施例7的LPS和Kog2的量的关系的ccL2的分泌量的图。即，表示使用LPS和Kog2进行了2小时的培养时的、所分泌的趋化因子的ccL2的量（将Kog2为0μM的情况设为100%）（LPS＋Kog2→cell ccL2）。图11中，＊（有意义水平）表示P＜0.05、＊＊（有意义水平）表示P＜0.01、N＝3。如图11所示，启示了，Kog2的添加量为少量的情况下（5μM），所分泌的趋化因子的ccL2的量增加，但如果添加量超过某一定量，则添加量越增加ccL2的量越减少。即，说明了Kog2通过多量添加，也具有LPS的灭活作用。
图12是表示根据实施例7的LPS和Kog2的量的关系的TNF－α的分泌量的图。即，表示使用LPS和Kog2进行了2小时的培养时的、所分泌的细胞因子的TNF－α的量（将Kog2为0μM的情况设为100%）（LPS＋Kog2→cell TNF－α）。图12中，＊＊（有意义水平）表示P＜0.01、N＝3。如图12所示，启示了，Kog2的添加量为少量的情况下（5μM），所分泌的细胞因子的TNF－α的量增加，但如果添加量超过某一定量，则添加量越增加TNF－α的量越减少。即，与图11所示的结果同样地说明了通过多量添加，具有LPS的灭活作用。
如此，由图9至图12的结果说明了，细菌素Kog1和Kog2的优异的抗菌力等至少与细菌素Kog1和Kog2所具有的LPS的灭活作用相关。另外启示了，细菌素Kog1和Kog2具有LPS的灭活作用也可以用于至今已经解明的作为内毒素的LPS所相关的其他的疾病等的预防、或治疗方法。这样的疾病，除了口腔内疾病以外，还可以举出骨吸收、慢性炎症的助长、肝损伤、糖尿病和动脉硬化等。图13是表示与以LPS为原因的各种疾病等的关系的图。如图13所示，作为内毒素的LPS经由各种各样的物质，参与很多疾病或治疗机制。
（实施例8）
因而，除了口腔内疾病以外，本发明人利用实时定量RT（反转录酶）－PCR对Kog2是否影响骨芽细胞的分化进行了调查。
细胞使用的是来源于小鼠的骨芽细胞様细胞的MC3T3－E1细胞。在含有10%FBS（Biological industries,Haemek,Israel）、L－谷氨酰胺、抗生素混合物（Invitrogen）、50μg／mL抗坏血酸（Sigma）、和0nM、250nM、500nM或1000nM的Kog2的α变法极限培养基（α－MEM）中，在37度、5%CO2条件下，在塑料上或钛上培养该MC3T3－E1细胞。用TRIzol reagent（Invitrogen）从如此培养后的MC3T3－E1细胞中提取全RNA，用ReverTra Ace反转录酶（东洋纺）制作cDNA。之后，用作制的cDNA，通过实时定量RT－PCR，解析作为骨芽细胞的分化标记物的I型胶原和作为内在性对照的β－肌动蛋白的表达。
实时定量RT－PCR中，I型胶原使用了序列号8记载的正向引物、序列号9记载的反向引物、序列号10记载的探针。β－肌动蛋白使用了序列号11记载的正向引物、序列号12记载的反向引物、序列号13记载的探针。
图14是表示实施例8的实时定量RT－PCR的I型胶原／β－肌动蛋白的值的图。如图14所示，添加了250nM的Kog2的情况与完全不添加Kog2的情况（对照（0μM））相比，I型胶原／β－肌动蛋白的值增加了近3倍。此次的实验中，添加了250nM左右的Kog2时，判断为最促进骨芽细胞的分化。即，充分启示了细菌素Kog2也可以用于各种骨疾病。
（实施例9）
进而，本发明人通过煮沸实验对细菌素Kog1和Kog2被加热后的情况下是否具有同样的抗菌力进行了调查。
本实施例9中，以白色念珠菌MYA274株作为对象调查了抗菌力。首先，用沙氏葡萄糖液状培养基（Sabouraud Dextrose Broth）（Difco）对白色念珠菌MYA274株在37度进行24小时预培养，用MＱ水清洗2次后，制备成以OD600计为0.3（1.0×107cells／mL）。
需要说明的是，本实施例9中，不直接使用细菌素Kog1或Kog2、或鼠李糖乳杆菌KO1株或KO3株，而使用作为含鼠李糖乳杆菌KO3株的乳酸菌培养基的、8020酸奶（饮用型）进行了实验。具体地，该8020酸奶（饮用型）是在15%脱脂乳＋3%葡萄糖培养基中添加鼠李糖乳杆菌KO3株1%和YF－L811引子1%，在35度培养2天后的物质。更详细地，作为其他的原材料而含果糖葡萄糖液糖、乳制品、砂糖、稳定剂（果胶）、酸味料和香料，制成Brix为17.4%、乳酸酸度为0.57%、PH为3.96、无脂乳固形分为3.0%的物质。
实验中，对这样的8020酸奶（饮用型）进行离心沉淀，使用除去乳酸菌后的上清（以下，记为上清B）以及、将该上清B在100度煮沸20分钟后的物质（以下，记为上清Boil）。需要说明的是，根据至此的实施例的结果，可以认为上清B中含有从鼠李糖乳杆菌KO3株提取的细菌素Kog1和Kog2。
为了调查由于煮沸引起的抗菌力的变化，用24－微孔板，注入以下叙述的三种试样，测定37度24小时后的ATP的值（pmol／L）。三种试样是：1）含沙氏液状培养基（Sabouraud Broth）1mL、上清B1mL和前述的白色念珠菌MYA274株制备液50μL的试样;2）含沙氏液状培养基（Sabouraud Broth）1mL、上清Boil1mL和前述的白色念珠菌MYA274株制备液50μL的试样;和3）作为对照的含沙氏液状培养基（Sabouraud Broth）1mL、15%脱脂乳＋3%葡萄糖培养基1mL和前述的白色念珠菌MYA274株制备液50μL的试样。
图15是表示实施例9的根据煮沸实验的耐热数据的结果的图。该耐热数据是将各试样分别制作四个，算出平均值±SD后的数据。如图15所示，由于100度20分钟煮沸后的上清Boil也测定到了与上清B同样的ATP的量，因此确认了煮沸后的上清Boil具有与上清B同样的高抗菌性。即，确认了细菌素Kog1和Kog2被加热后的情况下具有同样的抗菌力。
本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限定。只要不脱离权利要求的记载，在本领域技术人员容易想到的范围内的各种变形方式均包括在本发明的范围内。
关于本说明书中明示的论文和公开专利公报等内容，其全部内容通过援引而引用。
本申请的基础是2011年2月10日提出申请的日本国专利申请2011－27882号和2011年8月26日提出申请的日本国专利申请2011－184655号。本说明书中，日本国专利申请2011－27882号和日本国专利申请2011－184655号的说明书、权利要求书、附图全体作为参照而引入。
产业上的利用可能性
本发明人等发现：就鼠李糖乳杆菌KO3株（2010年6月28日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－771而保藏）而言，具有序列号1记载的氨基酸序列的Kog1和具有序列号2记载的氨基酸序列的Kog2作为抗菌谱广、低浓度下的抗菌力高、而且产生耐性菌的可能性低的细菌素发挥机能。进而，同样地产生Kog1和Kog2的新型乳酸菌株鼠李糖乳杆菌KO1株（2012年2月16日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－1065而保藏）的分离鉴定上获得了成功。
因而，根据本发明，可以提供能够容易且大量地产生的、抗菌谱广、而且产生耐性菌的可能性低的细菌素、以该细菌素（含药学上允许的衍生物等）作为有效成分的口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物、编码该细菌素的基因、插入该基因而得到的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞、通过该重组表达载体而转化后的转化体、以及、该细菌素的生产方法。另外，还可以提供产生该细菌素的新型乳酸菌鼠李糖乳杆菌KO1株。进而，本发明所涉及的细菌素由于耐热性高，因此容易工业加工。特别是果冻、片剂、锭剂、糖果或口香糖等，由于成形加工时伴随着热，因此使用具有耐热性的本发明所涉及的细菌素时，能够不降低抗菌效果地进行加工。另外，例如，即使添加到调理饭或汤等的食品中，该细菌素的效果也不丧失，因此可以期待各种各样的用途。
Figure GDA0000467593360000191
Figure IDA00003646680100011
Figure IDA00003646680100021
Figure IDA00003646680100031
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Claims (13)

1.一种细菌素，其特征在于，具有序列表的序列号1或序列号2所示的氨基酸序列、或者序列表的序列号1或序列号2所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、置换、插入和／或加成而带来抗菌活性的氨基酸序列，并且等电点为12以上。
2.如权利要求1所述的细菌素，其特征在于，所述细菌素对龋齿菌、牙周病菌和念珠菌全部具有抗菌性。
3.一种口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物，其特征在于，以权利要求1或2所述的细菌素、或者所述细菌素的药学上允许的衍生物或药学上允许的盐类作为有效成分。
4.如权利要求3所述的口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物，其特征在于，所述口腔内疾病的预防、改善和／或治疗用组合物是龋齿菌、牙周病菌和／或念珠菌的增殖抑制剂。
5.一种基因，其特征在于，编码权利要求1或2所述的细菌素。
6.一种重组表达载体，其特征在于，插入权利要求5所述的基因而得到。
7.一种宿主细胞，含有权利要求6所述的重组表达载体。
8.一种转化体，其特征在于，是通过权利要求6所述的重组表达载体而转化后的转化体。
9.如权利要求8所述的转化体，其特征在于，所述转化体是细菌。
10.一种细菌素的生产方法，其特征在于，包括：
培养鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）的培养工序；和
从通过所述培养工序得到的菌体培养物提取权利要求1或2所述的细菌素的提取工序。
11.如权利要求10所述的细菌素的生产方法，其特征在于，前述鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）是鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）KO1株（2012年2月16日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－1065而保藏）和／或鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）KO3株（2010年6月28日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－771而保藏）。
12.如权利要求10或11所述的细菌素的生产方法，其特征在于，所述培养工序中，添加念珠菌的死菌。
13.鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）KO1株，其特征在于，是2012年2月16日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心申请保藏，作为保藏号NITE BP－1065而保藏。
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