CN103288967B

CN103288967B - 具有吸附重金属离子功能的融合蛋白的构建、表达及其在生物除污中的应用

Info

Publication number: CN103288967B
Application number: CN201310188599.1A
Authority: CN
Inventors: 王宏; 刘斌; 杨海涛; 伍建军; 张绍伟; 高社
Original assignee: GUANGZHOU BIO-ZONE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Guangzhou lead Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: CN103288967A

Abstract

本发明公开了一种包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白(SEQ ID No：4)的制备方法及其应用，特别是在化妆品领域方面的应用。本发明的特征在于利用基因工程技术，获得编码包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的DNA序列(SEQ ID No：8)，然后在乳酸菌中以表面展示的方法进行重组表达。由于金属结合多肽和皮肤细胞黏附蛋白分别具有结合有害重金属离子及增加表达宿主黏附皮肤的能力，因此，利用表面展示方法表达含金属结合多肽和连接肽的十聚体及皮肤细胞黏附三肽融合蛋白的乳酸工程菌制备的化妆品可以有效减少有毒重金属在皮肤中的积聚，实现生物除污的效果。

Description

具有吸附重金属离子功能的融合蛋白的构建、表达及其在生物除污中的应用

技术领域

本发明涉及一种包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白，还涉及一种细胞表面展示表达所述融合蛋白的乳酸菌。具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。本发明还涉及所述融合蛋白或细胞表面展示表达所述融合蛋白的乳酸菌在制备用于结合皮肤表面有毒重金属的化妆品或药物中的应用。另外，本发明还涉及一种去除皮肤表面有毒重金属的药物或化妆品，所述药物或化妆品包含所述融合蛋白或细胞表面展示表达所述融合蛋白的乳酸菌。

背景技术

随着中国各产业工业化的发展，重金属污染已成为社会十分关注的问题。大量的有毒重金属离子通过水、空气、土壤以及生物链污染到人类赖于生存的动植物产品及水源上，给人们的健康带来潜在的危害。一般来说，重金属污染是指铅、汞、镉、砷等重金属离子的污染。其主要来源一方面是未经处理的工业废水、废气、废渣的随意排放。另一方面则是农业上滥用的农药和化肥。

有毒重金属可以通过水、空气及日常生活用品(眼镜、化妆品、服装、玩具等)对人体皮肤的健康带来诸如角质化、色斑、粗糙、提前衰老等极大危害。由于生活中重金属污染常以慢性中毒的方式影响人类，因此，这种危害又往往容易被人们所忽视。

在动物、高等植物、真核微生物和一些原核生物中存在一些富含半胱氨酸的重金属结合蛋白(如金属硫蛋白、植物螯合素等)。这些重金属结合蛋白可以利用其半胱氨酸残基上的巯基与重金属结合，形成无毒或低毒的络合物。生物体在遇到重金属污染的环境时会持续大量表达结合蛋白，进而减少或清除重金属对机体的毒害。进一步研究显示，部分含组氨酸的多肽也具有结合重金属离子的功能。Sousa等在大肠杆菌中表达6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)的多肽，结果发现，该重组菌吸附镉的含量比对照组的高6-11倍(Sousa et al.，Nature Biotechnololgy，1996，14(8)：1017-1720)。更有趣的是，部分研究显示，含组氨酸残基的金属结合多肽在以串联方式进行重复表达时，其结合重金属能力有增加的趋势(Mejáreand Bülow，TRENDS in Biotechnology，2001，19(2)：67-73)。Kotrba等在大肠杆菌中表达另一个含组氨酸多肽(Gly-His-His-Phe-His-Gly)的二聚体，结果发现，重组菌表面结合镉的含量大概比对照组的高3倍(Kotrba etal.，Applied and Environmental Microbiology，1999，65：1092-1098)。

富含半胱氨酸的金属硫蛋白在重金属解毒方面起着重要的作用，然而，利用基因工程的方法很难在宿主中进行大量重组表达。一方面，金属硫蛋白分子量小，半胱氨酸残基多，难以可溶性表达；另一方面，大量巯基也会阻碍宿主细胞正常的氧化还原途径，严重影响宿主细胞正常生理活动。因此，在宿主细胞表面进行展示表达含组氨酸的金属结合多肽是解决这方面困难的一个有效方法。

乳酸菌是一类能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌，其包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属，在食品工业各个领域中的长期应用已证明其无致病性，被公认为安全级微生物。在人和大多数动物体内及各种人类生活环境中广泛分布。研究发现，乳酸菌具有提供人体必需的营养物质、维持泌尿生殖系统健康、增强机体免疫作用、降低胆固醇含量、改善胃肠道功能以及抗肿瘤作用等多种重要的生理功能。有鉴于其具有极其重要应用价值，从20世纪80年代开始，人们就开始致力于对各种乳酸菌，尤其是乳酸乳杆菌，的生物学特性和分子机制研究。乳杆菌作为表达外源蛋白的理想菌株有其独特的优势：首先，该菌已经进行全基因组测序，其所有的功能基因以及生化途径一清二楚；其次，乳杆菌抗原性弱，不会产生内毒素，宿主本身不会引起强烈的免疫应答；最后，乳杆菌现时已作为一种食品级表达宿主用于表达各种抗原、生长因子以及功能蛋白。

本发明的主要目的就是将包含金属结合多肽十聚体和皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白在乳酸菌表面进行展示表达，皮肤细胞黏附三肽有助于将融合蛋白黏贴在皮肤表面(赵强，等，2003，生物医学工程学杂志，20(3)：384-387)，而金属结合多肽十聚体则能结合皮肤表面的有毒重金属离子，形成无毒的复合物。最后，将结合有毒重金属离子的工程菌从人体皮肤上洗脱，可有效从而减少有毒重金属在皮肤中的积聚及损害，实现生物除污的效果。

发明内容

针对上述研究背景，本发明公开了一种包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的重组融合蛋白的制备方法及其应用，特别是在化妆品领域方面的应用。本发明将编码包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的核苷酸序列克隆到乳酸菌表面表达载体(例如pL3UA)中，然后转化至干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，ATCC393)中，并利用红霉素进行重组子筛选。重组乳酸工程菌在发酵过程中能在表面表达包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白，且该融合蛋白具有结合皮肤表面的重金属(例如，Pb、Cd以及Hg)的能力。本发明还涉及所述重组乳酸菌在制备用于减少有毒重金属在人体皮肤表面积聚及损害的药物或化妆品中的应用。

因此，本发明涉及以下各项：

1.一种包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白，

其中，金属结合多肽与连接肽连接，位于所述融合蛋白的N端，共有十次重复，皮肤细胞黏附三肽位于所述融合蛋白的C端，

其中所述金属结合多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，皮肤细胞黏附三肽的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。

2.一种在乳酸菌细胞表面展示表达第1项的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

1)利用细胞表面表达载体构建在细胞表面表达第1项所述的融合蛋白

的重组表达载体；

2)将步骤1)中构建的重组表达载体转化到乳酸菌细胞中；

3)在适于以表面展示形式表达所述融合蛋白的条件下培养步骤2)中被转化的乳酸菌，由此在所述乳酸菌细胞表面展示表达出第1项1的融合蛋白。

3.第2项所述的方法，其中所述乳酸菌细胞选白干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，Orla-Jensen，ATCC393)，粪肠球菌(例如，粪肠球菌OGIX、FA2-2)，或植物乳杆菌(例如，ATCC8014)，优选干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，Orla-Jensen，ATCC393)。

4.第2项所述的方法，其中所述细胞表面表达载体为pL3UA。

5.第2项所述的方法，其中所述适于在乳酸菌表面展示表达所述融合蛋白的条件是指在乳酸菌培养基中，37℃厌氧静置培养24小时，其中所述乳酸菌培养基的成分为：基于培养基总重量，1重量％肉蛋白胨、1重量％牛肉膏、0.5重量％酵母提取物、2重量％葡萄糖、0.5重量％乙酸钠、0.1重量％吐温80、0.2重量％磷酸钾、0.2重量％柠檬酸铵、0.01重量％硫酸镁以及0.0005重量％硫酸锰，pH＝6.5。

6.一种在细胞表面展示表达第1项的融合蛋白的乳酸菌细胞。

7.第1项所述的融合蛋白或第6项所述的乳酸菌细胞在制备用于结合皮肤表面有毒重金属的化妆品或药物中的应用。

8.第7项所述的应用，其中所述重金属选自铅、镉、汞或它们的任意组合。

9.第7项所述的应用，其中权利要求1所述的融合蛋白或权利要求7所述的乳酸菌细胞以冻干粉针、溶液剂、喷雾剂或凝胶剂的形式存在。

10.一种去除皮肤表面有毒重金属的药物或化妆品，所述药物或化妆品包含有效量的第1项所述的融合蛋白或第6项所述的乳酸菌细胞。

11.第10项所述的药物或化妆品，其中所述重金属选自铅、镉、汞或它们的任意组合；并且所述药物或化妆品以冻干粉针、溶液剂、喷雾剂或凝胶剂的形式存在。

更具体地，本发明的包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白具有下述结构：

(金属结核多肽-连接肽)₁₀-皮肤细胞黏附三肽(参见图2，方向是从N端到C端)。更具体地，在本发明的重组表面展示表达载体中，其中所述融合蛋白中的金属结合多肽的核苷酸序列(SEQ ID No：5)、连接肽的核苷酸序列(SEQ ID No：6)以及皮肤细胞黏附三肽的核苷酸序列(SEQ IDNo：7)可以是天然来源中筛选的野生序列或人工化学合成的序列，优选方法是人工合成方法。因为，以人工合成方法得到的编码金属结合多肽、连接肽以及皮肤细胞黏附三肽融合蛋白基因，可以避免氨基酸密码子偏好性的影响，从而增加目的蛋白的表达量。按照Itatura等人所述的技术(Science，1977，198：1056-1063)来合成基因，也可以利用本领域已知的技术从宿主基因组中获得和鉴定基因。而本领域已知的技术包括进行基因的合成、克隆和表达载体的构建、DNA序列分析及鉴定、宿主细胞的转化和培养以及表达产物的分离鉴定等操作(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)。

可以使用任何一种适于在其中以表面展示表达所需融合蛋白的乳酸菌作为宿主，这样的菌株包括干酪乳杆菌(Orla-Jensen)，粪肠球菌(例如，粪肠球菌OGIX、FA2-2)，或植物乳杆菌(例如，ATCC8014)。本发明优选的宿主是优选干酪乳杆菌Orla-Jensen(Lactobacillus casei，Orla-Jensen，ATCC393)。

本发明涉及一种制备表面展示表达含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽融合蛋白重组乳酸菌的方法，该方法包括以下步骤：

1)构建以表面展示方式表达包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白(即，本发明的融合蛋白)的重组表达载体；

2)将1)中构建的重组表达载体转化乳酸菌宿主细胞中，并且用含红霉素抗性的乳酸菌培养基(成分：基于培养基总重量，2重量％蛋白胨、0.5重量％酵母粉、0.4重量％氯化钠，0.15重量％乙酸钠，0.1重量％红霉素和1.5重量％琼脂粉)筛选转化成功的重组乳酸菌；

3)在适于以表面展示形式表达所述融合蛋白的条件下培养步骤2)中被转化的重组乳酸菌，由此在所述乳酸菌细胞表面展示表达出所述融合蛋白。

优选地，其中所述的乳酸菌宿主细胞选自：干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei，Orla-Jensen，ATCC393)，粪肠球菌(例如，粪肠球菌OGIX、FA2-2)，或植物乳杆菌(例如，ATCC8014)，优选干酪乳杆菌(Orla-Jensen)。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明涉及一种制备表面展示表达包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的重组乳酸菌的方法，该方法包括以下步骤：

1)人工合成编码由金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID No：8)，并用限制性内切酶BamH I和Hind III处理；

2)将步骤(1)中核苷酸序列连接到用限制性内切酶BamH I和Hind III处理过的乳酸菌表面展示表达载体pL3UA上，获得重组表达质粒pL3UA-Dec-H-R；

3)用步骤(2)的重组表达载体转化适当的乳酸菌宿主细胞(Lactobacilluscasei，Orla-Jensen)中，红霉素筛选重组子；

4)在适于以表面展示形式表达融合蛋白的条件下培养步骤3)中被转化的乳酸菌宿主细胞，由此在所述乳酸菌细胞表面展示表达出所述融合蛋白。

根据本发明的方法，其中所述适于以表面展示形式表达融合蛋白的条件是指在乳酸菌培养基(乳酸菌培养基的组成：基于培养基总重量，1重量％肉蛋白胨、1重量％牛肉膏、0.5重量％酵母提取物、2重量％葡萄糖、0.5重量％乙酸钠、0.1重量％吐温80、0.2重量％磷酸钾、0.2重量％柠檬酸铵、0.01重量％硫酸镁以及0.0005重量％硫酸锰，pH＝6.5)中，37℃厌氧静置培养24小时。

实施例的实验数据证明，本发明所述的含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白具备结合有毒重金属离子的能力，进而可以减少有毒重金属在皮肤中的积聚及损害，实现生物除污的功效，因此，本发明所述的在菌体表面展示表达含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的重组乳酸菌可以用于在药品及化妆品制剂方面应用：包括将上述的重组食品级乳酸菌加入本领域技术人员熟知的药物载体或赋形剂，按照化妆品领域的常规方法制成适于外用的霜剂、乳化剂或者水剂等剂型；也可以将上述的重组食品级乳酸菌加入药品领域技术人员熟知的载体或赋形剂并按照药品领域的常规方法制成适于口服的固态或者液态药品。本发明优选化妆品方面的应用。

此外，本发明还提供本发明所述的以表面展示方式表达包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的重组乳酸菌在制备用于从皮肤表面去除有害重金属离子，从而减少有毒重金属在皮肤中的积聚及损害的药物或化妆品中的应用，其中所述的重金属是指铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)或它们的任意组合。本领域技术人员应该理解，本发明所述的重金属是指不同价态的重金属盐。对于Pb，常见价态有+4价和+2价；对于Cd，常见价态为0价和+2价；对于Hg，常见价态是+1和+2价。在本发明中，优选上述为+2价态的重金属离子，例如，Pb²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺等。

本发明还提供一种用于从皮肤表面去除有害重金属离子的药物或化妆品，其包含药效学有效量的本发明所述的融合蛋白或本发明所述的以表面展示方式表达本发明的融合蛋白(即，包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白)的重组乳酸菌。

本领域技术人员应该注意，上述“药学有效量”或“有效量”意指治疗有效量，本领域技术人员根据现有技术、经过简单的、有限次的实验即可确定其具体的数值。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.乳酸菌重组表达质粒pL3UA-Dec-H-R图谱；

图2.金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽融合蛋白结构图；

图3.融合蛋白Western Blot检测，泳道1和泳道2均为重组融合蛋白；

图4.重组乳酸菌对不同重金属离子(Cd²⁺、Pb²⁺和Hg²⁺)的结合能力分析。

序列表说明

为了清楚起见，以下对后附序列表中各个序列作简要说明：

SEQ ID No：1：金属结合多肽的氨基酸序列(N端-C端，共6个氨基酸)；

SEQ ID No：2：连接肽的氨基酸序列(N端-C端，共4个氨基酸)；

SEQ ID No：3：皮肤细胞黏附三肽的氨基酸序列(N端-C端，共3个氨基酸；参见赵强，等，2003，生物医学工程学杂志，20(3)：384-387)；

SEQ ID No：4：金属结合多肽和连接肽的十聚体及皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的氨基酸序列(N端-C端，共103个氨基酸)；

SEQ ID No：5：编码金属结合多肽的核苷酸序列(5’-3’，共18个碱基)

SEQ ID No：6：编码连接肽的核苷酸序列(5’-3’，共12个碱基)

SEQ ID No：7：编码皮肤细胞黏附三肽的核苷酸序列(5’-3’，共9个碱基)；

SEQ ID No：8：编码金属结合多肽和连接肽的十聚体及皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的核苷酸序列(5’-3’，共324个碱基)；

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。

实施例1：重组食品级乳酸菌表达载体pL3UA-Dec-H-R的构建

将含有pL3UA质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)NovaBlue(购自Novagen，Inc.，Madison，Wisconsin)在含红霉素抗生素的Luria-broth(LB)固体培养平板(成分：基于培养基总重量，1重量％肉汤，0.5重量％酵母提取物，1重量％氯化钠，1.5重量％琼脂粉，终浓度为100μg/ml的红霉素)上划线培养。37℃厌氧培养14小时后，从平板培养基上挑单菌落接种至含红霉素抗生素的LB液体培养基(成分：1％肉汤，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，终浓度为100μg/ml的红霉素)中，37℃静置培养至OD₆₀₀＝0.6。离心收集菌体并利用质粒抽提试剂盒(TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.2.0，购自大连宝生物工程有限公司，大连，中国)获得乳酸菌表面展示表达质粒pL3UA。按照已有的方法建立标准的限制性内切酶消化体系，然后利用BamH I(购自New England Biolabs，Inc.，USA)和Hind III(购自New England Biolabs，Inc.，USA)处理pL3UA(具体操作参考Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，回收线性片段。

将编码金属结合多肽和连接肽的十聚体及皮肤细胞黏附三肽融合蛋白的DNA片段送到广州杰特伟生物科技有限公司(Guangzhou JetwayBiotech Co.Ltd.，China)进行全基因合成(SEQ ID No：8)。利用相同的限制性内切酶BamH I和Hind III处理并回收，然后与上述载体片段相连，构建出重组乳酸菌表面展示表达质粒pL3UA-Dec-H-R。将该重组质粒利用电转方法(1.25kV，200Ω，25μF)转化宿主菌干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei，Orla-Jensen)中(购自ATCC，Catalog：393，USA)中，红霉素筛选重组子。培养增殖后从转化菌株中抽提重组质粒pL3UA-Dec-H-R，按本领域工作人员熟知的方法测序确定片段插入的方向以及编码的氨基酸都是正确的(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。抽取测序正确的重组表达质粒备用。

实施例2：重组乳酸菌的制备及融合蛋白的表达

将含测序正确表达质粒pL3UA-Dec-H-R的重组乳酸菌接种到含红霉素(终浓度为100ng/ml)的表达培养基中，(成分：基于培养基总重量，1重量％肉蛋白胨、1重量％牛肉膏、0.5重量％酵母提取物、2重量％葡萄糖、0.5重量％乙酸钠、0.1重量％吐温80、0.2重量％磷酸钾、0.2重量％柠檬酸铵、0.01重量％硫酸镁以及0.0005重量％硫酸锰，pH＝6.5)中，37℃、厌氧静置培养1天。发酵结束后，12000rpm离心收集菌体，按1∶10的比例(v/w)加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)重悬菌体。超声波破碎仪破碎细胞后，18000rpm离心30分钟，收集上清。SDS-PAGE以及Western-blot检测和分析融合蛋白的表达(具体操作参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)。通过凝胶电泳分析结果表明，重组融合蛋白在重组乳酸菌中得到表达(融合蛋白结构如图2)，其分子量约为53kDa(其中锚定蛋白PgsA约为43kDa，而由金属结合多肽和连接肽的十聚体及皮肤细胞黏附三肽组成的融合蛋白约为10kDa)。此外，乳酸菌表面展示表达的重组融合蛋白可以与金属结合多肽(SEQ ID No：1，HNLGMN)抗体(抗体定制于南京金斯瑞生物科技有限公司，也可以以金属结合多肽(SEQ ID No：1，HNLGMN)作为抗原免疫动物，按照常规免疫方法产生该抗体)产生阳性反应(图3)，与预期一致。

实施例3：金属结合多肽和连接肽的十聚体及皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的有毒重金属离子结合能力分析

在表达培养基中(成分：基于培养基总重量，1重量％肉蛋白胨、1重量％牛肉膏、0.5重量％酵母提取物、2重量％葡萄糖、0.5重量％乙酸钠、0.1重量％吐温80、0.2重量％磷酸钾、0.2重量％柠檬酸铵、0.01重量％硫酸镁以及0.0005重量％硫酸锰，pH＝6.5)分别添加不同浓度的氯化镉(CdCl₂，200μM、300μM、400μM、500μM)、醋酸铅(PbAc₂，0.2mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM)或二氯化汞(HgCl₂，15μM、50μM、150μM、450μM)，然后接种重组表达金属结合多肽和连接肽的十聚体和皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的乳酸工程菌，以含空载体的乳酸菌作为对照，37℃厌氧静置培养1天。离心收集菌体，并用原子吸收光谱法分析融合蛋白结合重金属离子能力，结果表明，融合蛋白对Cd²⁺、pb²⁺和Hg²⁺的结合能力分别高于含空载体对照菌的5.8倍、7.1倍和2.4倍(见图4)。

实施例4：制备表面展示表达包含金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的乳酸菌剂型及其在生物除污中的应用

在表达培养基中(成分：基于培养基总重量，1重量％肉蛋白胨、1重量％牛肉膏、0.5重量％酵母提取物、2重量％葡萄糖、0.5重量％乙酸钠、0.1重量％吐温80、0.2重量％磷酸钾、0.2重量％柠檬酸铵、0.01重量％硫酸镁以及0.0005重量％硫酸锰，pH＝6.5)接种重组表达金属结合多肽和连接肽的十聚体与皮肤细胞黏附三肽的融合蛋白的乳酸工程菌，37℃厌氧静置培养1天，离心收集菌体，然后用0.2％的透明质酸水溶液重悬(重组乳酸菌的终浓度为1x10⁹/毫升)。将5毫升含重组乳酸菌的水溶液添加在市售面膜制品中，制备成可去除皮肤表面有害重金属离子实现生物除污功能的面膜，用于下面的实验。

在20人次的志愿者中，随机分成0.2％透明质酸水对照组和实验组。在双盲状态下，每人每天使用一次面膜并在面部停留30分钟。连续处理14天后，收集志愿者皮肤角质层细胞并用原子吸收光谱法测定皮肤样品中重金属离子的含量。实验结果显示，实验组中志愿者皮肤表面的Pb离子比0.2％透明质酸水溶液对照组中志愿者的低3.2倍，达到了较好的清除有毒重金属离子的效果。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims

其中，金属结合多肽与连接肽连接，位于所述融合蛋白的N端，共有十次重复，构成所述金属结合多肽和连接肽的十聚体，皮肤细胞黏附三肽位于所述融合蛋白的C端，

2.一种在乳酸菌细胞表面展示表达权利要求1的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

1)构建在细胞表面表达权利要求1所述的融合蛋白的重组表达载体；

2)将步骤1)中构建的重组表达载体转化到乳酸菌细胞中；

3)在适于以表面展示形式表达所述融合蛋白的条件下培养步骤2)中被转化的乳酸菌，由此在所述乳酸菌细胞表面展示表达出权利要求1的融合蛋白。

3.权利要求2所述的方法，其中所述乳酸菌细胞为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)细胞。

4.权利要求2所述的方法，其中所述适于在乳酸菌表面展示表达所述融合蛋白的条件是指在乳酸菌培养基中，37℃厌氧静置培养24小时，其中所述乳酸菌培养基的成分为：基于培养基总重量，1重量％肉蛋白胨、1重量％牛肉膏、0.5重量％酵母提取物、2重量％葡萄糖、0.5重量％乙酸钠、0.1重量％吐温80、0.2重量％磷酸钾、0.2重量％柠檬酸铵、0.01重量％硫酸镁以及0.0005重量％硫酸锰，pH＝6.5。

5.一种在细胞表面展示表达权利要求1的融合蛋白的乳酸菌细胞。

6.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求5所述的乳酸菌细胞在制备用于结合皮肤表面有毒重金属的化妆品或药物中的应用。

7.权利要求6所述的应用，其中所述重金属选自铅、镉、汞或它们的任意组合。

8.权利要求6所述的应用，其中权利要求1所述的融合蛋白或权利要求5所述的乳酸菌细胞以冻干粉针、溶液剂、喷雾剂或凝胶剂的形式存在。

9.一种去除皮肤表面有毒重金属的药物或化妆品，所述药物或化妆品包含有效量的权利要求1所述的融合蛋白或权利要求5所述的乳酸菌细胞。

10.权利要求9所述的药物或化妆品，其中所述重金属选自铅、镉、汞或它们的任意组合；并且所述药物或化妆品以冻干粉针、溶液剂、喷雾剂或凝胶剂的形式存在。