CN104402975B

CN104402975B - 抗衰老短肽及其制备方法

Info

Publication number: CN104402975B
Application number: CN201410755706.9A
Authority: CN
Inventors: 杨霞
Original assignee: Shanxi Jinbo Biomedical Co ltd
Current assignee: Shanxi Jinbo Biomedical Co ltd
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: CN104402975A

Abstract

本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种新型抗衰老短肽及制备方法。本发明公开了一种抗衰老短肽命名为G13，由13个氨基酸所组成；同时公开了一种利用大肠杆菌发酵的工艺，可以实现工业化大规模的制备重组G13（简称rG13）。本发明利用多种生物学手段检测，证实rG13具有比同类产品更高的生物学活性，能够刺激细胞大量分泌胶原蛋白，具有抗衰老的能力。本发明所述的抗衰老短肽生物活性显著，生产工艺简单，成本低廉，能够让抗衰老皮肤营养产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。

Description

抗衰老短肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域重组蛋白的设计和制备方法，具体是一种新型抗衰老短肽及其制备方法。

背景技术

人和高等动物的皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成。表皮没有血管，细胞的能量和营养必须由真皮微循环提供。真皮层是皮肤的生命源泉，是一层致密、坚韧且有弹性的组织，主要由纤维成分（胶原蛋白纤维、弹力纤维和网状纤维）、糖蛋白、氨基葡萄糖和玻尿酸等组成。玻尿酸是一种透明的胶状物质，吸水能力可达 500-1000倍，是公认的最佳保湿产品。年轻的皮肤，玻尿酸含量高，皮肤光滑、弹性、水嫩、膨胀饱满；皮肤老化时，真皮层变薄，减少了真皮层与表皮层之间物质交换的界面，细胞的正常代谢和有丝分裂作用受到阻碍，皮肤萎缩产生皱纹，因此抗衰老要从补充真皮层营养物质（如胶原蛋白和玻尿酸等）开始。胶原蛋白可以弥补基底膜功能，帮助表皮层与真皮层的结合，能够将水分、养分保送至真皮层。因此，如果能够补充人体皮肤中的胶原蛋白，将能够有效地对抗皮肤衰老的问题。

棕榈酸五胜肽-3（Pentapeptide-3）别名五环短肽或五胜月肽，它是由法国著名化妆品公司Sederma公司研发出品的一种人工合成的短肽。它能够有效促进透明质酸、胶原蛋白和弹力纤维增生，减少肌肤细纹，提高肌肤的含水量，增加皮肤厚度，增强肌肤紧致感和光泽度。它是胶原蛋白I（Collagen I）碎片与棕榈酸（Palmitic Acid）结合后得到的对皮肤更具亲和性和亲水、锁水性的物质。研究表明，若将棕榈酸五胜肽-3加入纤维组织母细胞培养皿中，能加强胶原蛋白I、VII（纤维胶原)和纤维黏连蛋白的合成能力，还能促进表皮内的纤维母细胞产生胶原蛋白和玻尿酸等重要成分。可见，棕榈酸五胜肽-3对减轻皮肤老化有重要作用。试管内测试表明，棕榈酸五胜肽-3能迅速激活胶原蛋白IV合成能力达到100%～327%，激活玻尿酸的合成能力达到267%。如今，该短肽已经广泛应用于许多知名品牌的化妆品行列。

目前，已经有很多国家的知名化妆品品牌的许多系列添加了棕榈酸五肽-3作为抗衰老的营养成分。我国上海和深圳的一些生物科技公司也有该产品销售。但是，目前棕榈酸五胜肽-3的制备方法还都是局限于化学合成，其高额的成本限制了这类产品的广泛使用。因此，为了能使这类短肽类的皮肤营养产品不断走近百姓的日常生活，使得普通人拥有安全、稳定、实用的高品质化妆品，有必要设计研发更加高效的抗衰老短肽，并探索大规模制备抗衰老短肽的技术。

发明内容

本发明为了提高现有抗衰老短肽—棕榈酸五肽-3的生物学活性，同时降低这类美容肽的生产成本，提供了一种新型抗衰老短肽的设计方案，并提供其大规模的制备方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种抗衰老短肽，由13个氨基酸所组成，其氨基酸序列为：Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln，用单字符号表示为GPKTTKSLEVLFQ。

上述G13短肽可以通过多种生产工艺进行制备：

1、利用大肠杆菌发酵的工艺，重组表达制备的G13，简称rG13，生产工艺简单，成本低廉，易于推广。

2、利用化学合成的工艺合成G13，简称sG13，成本较高，但是具有与rG13类似的生物学功能。

本发明提供上述的抗衰老短肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）、大肠杆菌基因工程菌的构建

1.1、设计Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser（用单字符号表示为LEVLFQGPKTTKS）氨基酸序列为基本重复单元L13构建蛋白序列pL13-n，其中n为1-100的任意数值；

1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列nL13：（ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc）_n；

1.3、将核苷酸序列nL13克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；

（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养

2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于LB培养基中35～38℃培养过夜；

2.2、将菌液接种放大培养，35～38℃培养2.5～3小时，加入IPTG进行诱导，15～18℃继续培养18～22小时，此时表达出的蛋白为GST-pL13-n，离心收集菌体；

（3）重组抗衰老短肽rG13的纯化

3.1、用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；

3.2、利用谷胱甘肽亲和柱从上清液中纯化得到抗衰老短肽rG13。

本发明所述的rG13短肽检测活性如下：

1、抗衰老短肽rG13理论分子量为1447.65Da，无法通过常规的SDS-PAGE进行检测，需要利用质谱方法进行鉴定。用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOFAXIMA-CFR Plus（KRATOS Analytical，Shimadzu corporation，Japan)在线性模式下进行分析。分析结果如图2所示。

2、细胞分泌胶原蛋白的过程中，TGF-β会大量表达。因此，TGF-β表达量的增高指示着细胞合成胶原蛋白的增强。以大鼠腱细胞为模型，加入不同浓度的短肽（0.2μg/ml,2μg/ml，20μg/ml，200μg/ml），24小时之后收集大鼠腱细胞上清，直接转移到TGF-β的检测试剂盒中进行检测。分析结果如图3所示。

3、利用标准的MTT法检测抗衰老短肽rG13的细胞毒性。参考标准mtt法的操作方法，加入不同浓度的短肽（0.2μg/ml，2μg/ml，20μg/ml，200μg/ml），24小时之后检测细胞活性。分析结果如图4所示。

4、免疫组化方法检测抗衰老短肽rG13刺激细胞合成胶原蛋白的效果。以大鼠腱细胞为模型，加入短肽（浓度为20μg/ml）24小时之后，4%多聚甲醛固定，3% BSA封闭，然后用兔抗鼠胶原蛋白的抗体（Novotec，Saint Martin La Garenne，France）进行标记1小时。用荧光显色，然后镜下观察即可。分析结果如图5所示。

与现有技术相比，本发明制备的抗衰老短肽rG13具有以下特点：

1、本发明所公开的新型抗衰老短肽G13（GPKTTKSLEVLFQ），为长期筛选优化的序列，比市场上同类产品效果显著提高。

2、本发明所公开的新型抗衰老短肽rG13的制备方法，采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，生产成本非常低，而且基因中的序列针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化，进一步提高了产量。

3、本发明产品经过多项活性检测，具有目前报道过的最优化的抗衰老效果，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。

本发明利用多种生物学手段检测，证实抗衰老短肽rG13具有比同类产品更高的生物学活性，能够刺激细胞大量分泌胶原蛋白，具有抗衰老的能力。

本发明所述的抗衰老短肽生物活性显著，生产工艺简单，成本低廉，能够让抗衰老皮肤营养产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1表示表达载体pGEX-6p-nL13-9的质粒构建图谱。

图2表示提纯产物中抗衰老短肽rG13的质谱鉴定结果。rG13的理论分子量为1447.65Da，与质谱检测结果完全吻合。

图3表示抗衰老短肽rG13刺激TGF-β表达的能力的检测结果。与空白对照组、棕榈酸五肽-3（K5）、合成的G13短肽（sG13）相比，重组表达制备的rG13具有更强的生物学活性。

图4表示MTT法检测抗衰老短肽rG13的细胞毒性。结果显示，棕榈酸五肽-3（K5）、本发明的基因工程表达的重组短肽rG13、化学合成的G13短肽（sG13）在所示浓度范围内，均未发现显著的细胞毒性。

图5表示免疫组化方法检测抗衰老短肽rG13刺激细胞合成胶原蛋白的效果。结果显示，rG13可显著刺激大鼠腱细胞产生胶原蛋白，其活性好于棕榈酸五肽-3（K5）及化学合成的G13短肽（sG13）。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细说明。

一种抗衰老短肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）、大肠杆菌基因工程菌的构建

1.1、为了酶切之后获得抗衰老短肽rG13，特别设计氨基酸序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser为基本重复单元L13，构建蛋白序列pL13-n。

这种单元的重复数目与最终短肽的收获量成正比关系。通常可以采用1-100个重组单元进行构建，这样构建的目的蛋白序列（LEVLFQGPKTTKS）_n简写为pL13-n，其中n为1-100的任意数值；实验证明当n=9时，抗衰老短肽rG13的得率较高。

本实施例以9个重复单元为例进行说明，9个重复单元的蛋白序列pL13-9为（LEVLFQGPKTTKS）₉：

LEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKS。

1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列nL13，并按照大肠杆菌有利的密码子进行优化，获得核苷酸序列nL13-9如SEQ ID NO.1所示：

ctggaggtgctgttccagggcccgaaaaccacaaagagcctggaggtgctgttccaaggtccgaagaccaccaagagcctggaggtgctgttccaaggcccgaaaaccaccaaaagcctggaggtgctgttccaaggcccgaagaccaccaagagcctggaagtgctgtttcagggtccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccagggccctaaaaccaccaagagcctggaggttctgtttcagggcccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccaaggcccgaagaccaccaagagcctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc。

1.3、将核苷酸序列nL13克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；具体为：

设计引物P1和P2，

P1：CGACGGCCAGTGAATTCAGA，

P2：CAGCTATGACCATGCTCGAGTCC，

将引物稀释成50pmol/μl，引物和核苷酸序列进行PCR步骤，琼脂糖凝胶电泳检测nL13-9条带位于350bp左右，回收目的基因。用Bam I和Xho I将基因（上述核苷酸序列）酶切成粘性末端，同样处理pGEX-6p-1载体，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α，用于质粒的扩增；用氨苄青霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序列分析含有正确的基因序列阅读框架，成功构建pGEX-6p-nL13-9表达载体；将pGEX-6p-nL13-9表达载体，转化BL21菌（筛选得到大肠杆菌基因工程菌），用于表达蛋白。

（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养

2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于5ml的LB培养基中35～38℃培养过夜，优选温度为37℃。

2.2、将菌液按照1：100接种放大培养，35～38℃培养2.5～3小时，加入IPTG进行诱导，15～18℃继续培养18～22小时，优选为37℃培养3小时，加入0.5mM IPTG进行诱导，16℃继续培养20小时；此时表达出的蛋白为GST-pL13-9，离心收集菌体。

（3）重组抗衰老短肽rG13的纯化

3.1、用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用Tris缓冲液20-40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌，在冰水混合物环境下超声破菌（2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度44℃），12000rpm/min离心20min，收集上清液，此时溶液中即含有大量的GST-pL13-9重组蛋白。

3.2、用PBS缓冲液清洗谷胱甘肽亲和柱(Glutathione Sepharose beads)，然后将柱材和破菌上清混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱，用含有1M NaCl的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的GST-pL13-9重组蛋白。

在柱上加入适量的Prescission Protease（简称PPase）蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将抗衰老短肽rG13从谷胱甘肽亲和柱上释放出来，用PBS溶液洗脱抗衰老短肽rG13，所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。

上述方法制备的抗衰老短肽rG13由13个氨基酸所组成，其氨基酸序列为：Gly-Pro-Lys-Thr-Thr- Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln，用单字符号表示为GPKTTKSLEVLFQ。利用大肠杆菌发酵的工艺，重组表达制备的rG13，生产工艺简单，成本低廉，易于推广。该rG13被发现具有显著的促进细胞合成胶原蛋白的能力，与现有同类短肽相比，效果更强。

<110>杨霞

<120>抗衰老短肽及其制备方法

<160>1

<210>1

<211>351

<212>DNA

<400>

ctggaggtgctgttccagggcccgaaaaccacaaagagcctggaggtgctgttccaaggtccgaagaccaccaagagcctggaggtgctgttccaaggcccgaaaaccaccaaaagcctggaggtgctgttccaaggcccgaagaccaccaagagcctggaagtgctgtttcagggtccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccagggccctaaaaccaccaagagcctggaggttctgtttcagggcccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccaaggcccgaagaccaccaagagcctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc

Claims

1.一种抗衰老短肽，其氨基酸序列为：Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln。

2.一种制备权利要求1所述的抗衰老短肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、大肠杆菌基因工程菌的构建

1.1、设计Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser氨基酸序列为基本重复单元L13，构建蛋白序列pL13-9，所述pL13-9为（Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser）₉；

1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列L13-9：（ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc）₉；

1.3、将核苷酸序列L13-9克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；

具体为，设计引物P1和P2，

P1：CGACGGCCAGTGAATTCAGA，

P2：CAGCTATGACCATGCTCGAGTCC，

将引物和核苷酸序列进行PCR步骤，回收目的基因，用Bam I和Xho I将核苷酸序列酶切成粘性末端，同样处理pGEX-6p-1载体，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序列分析含有正确的基因序列阅读框架，成功构建pGEX-6p-L13-9表达载体；将pGEX-6p-L13-9表达载体，转化BL21菌；

（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养

2.2、将菌液接种放大培养，35～38℃培养2.5～3小时，加入IPTG进行诱导，15～18℃继续培养18～22小时，此时表达出的蛋白为GST-pL13-9，离心收集菌体；

（3）重组抗衰老短肽rG13的纯化

3.1、用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用Tris缓冲液重悬菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌，在冰水混合物环境下超声破菌，12000rpm/min离心20min，收集上清液，此时溶液中即含有大量的GST-pL13-9重组蛋白；

3.2、用PBS缓冲液清洗谷胱甘肽亲和柱，然后将柱材和破菌上清混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱，用含有1M NaCl的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的GST-pL13-9重组蛋白；在柱上加入Prescission Protease蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将抗衰老短肽rG13从谷胱甘肽亲和柱上释放出来。

3.根据权利要求2所述的抗衰老短肽的制备方法，其特征在于：步骤2.2具体为，将菌液按照1：100接种放大培养，37℃培养3小时，加入0.5mM IPTG进行诱导，16℃继续培养20小时，离心收集菌体。