CN111363028B

CN111363028B - 重组人源ⅰ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法

Info

Publication number: CN111363028B
Application number: CN201811589560.XA
Authority: CN
Inventors: 赵健烽; 高力虎; 冯丽萍; 黄建民
Original assignee: Jiangsu Jland Biotech Co ltd
Current assignee: Jiangsu Jland Biotech Co ltd
Priority date: 2018-12-25
Filing date: 2018-12-25
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2038-12-25
Also published as: CN111363028A

Abstract

本发明公开了一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法。所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白含有510个氨基酸，理论分子量约55.911kd，构建的重组人源Ⅰ型胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白。本发明的重组人源胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。

Description

重组人源Ⅰ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白、表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法。

背景技术

胶原(Collagen)是脊椎动物体内最重要的结构蛋白，约占蛋白总量的25～30％。作为细胞外基质中含量最丰富的蛋白，胶原是结缔组织和几乎所有薄壁器官间隙组织中最主要的结构蛋白，起着稳定组织和器官并维持其结构完整的作用。由于天然胶原蛋白不易溶于水，且使用的通常为牛或猪来源的胶原，分子量大小不等，性质非常复杂，难于进行进一步的加工，存在动物病毒隐患，限制了其作为生物材料在医疗器械等领域的应用。因此，通过基因构建技术，利用生物反应器表达重组胶原蛋白来解决这些问题，且已经取得良好进展。

毕赤酵母表达系统作为一种新型酵母表达系统，它既有原核微生物的特点，又有真核生物的特性，可以对目的蛋白进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰。在过去的20年中已有200多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达，其中许多产品已被广泛应用于临床的诊断治疗和科研工作中。在毕赤酵母表达系统中外源基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起通过同源重组整合在酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可实现细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，并且毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，便于纯化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种亲水性优异的重组人源Ⅰ型胶原蛋白，以及分泌表达该蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法，能高效、安全地进行重组人源Ⅰ型胶原蛋白的胞外分泌表达。

实现本发明目的的技术方案如下：

本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ No.2所示。

本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因Iα1 510aa，核苷酸序列如SEQ No.3所示。

本发明构建的重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的核苷酸序列如SEQNo.4所示，通过将重组人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因Iα1 510aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。

本发明构建的分泌表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白的菌株为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris JY0201，保藏编号为CGMCC No.16461，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201通过将Sac I酶切得到的线性化重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。

本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因I型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。

附图说明

图1为人Ⅰ型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。

图2为重组人源Ⅰ型胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。

图3为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的构建示意图。

图4为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的Sac I酶切琼脂糖凝胶电泳图。

图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。

图6为阳性克隆菌株的凝胶电泳图。

图7为阳性克隆菌株的PCR凝胶电泳图。

图8为#3，#5，#7，#8阳性克隆菌株培养48和72小时的样品的蛋白表达分析图。

图9为#7阳性克隆菌株的蛋白表达的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

1.蛋白序列选择

对人Ⅰ型α1链胶原蛋白的氨基酸序列(SEQ No.1)进行疏水性分析，评价结果如图1所示。疏水性评价分值越低其亲水性越好。根据疏水性分析结果，选择评分低的氨基酸片段，将这些片段整合成新的蛋白，即本发明的重组人源Ⅰ型胶原蛋白(SEQ No.2)。对重组人源Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸进行疏水性分析，结果如图2所示，该蛋白中所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明该蛋白的亲水性很好。

2.质粒构建及线性化

将重组人源Ⅰ型胶原蛋白翻译成碱基序列(SEQ No.3)，采用基于PAS(PCR-basedAccurate Synthesis)的方法合成基因Iα1 510aa，双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I之间，图3为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的构建示意图。将获得的重组质粒ppic9K-Iα1 510aa转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如SEQNo.4所示。SEQ No.4的第77-82碱基处及1625-1632碱基处区域为酶切位点。

提取质粒20μg，使用Sac I酶切线性化，冻干浓缩待用。37℃消化3h。取5μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4所示。其中M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1为Sac I酶切；2为回收的目的片段。

表1酶切线性化体系配制表

3.电转毕赤酵母细胞GS115

冰浴电转杯，将10μL线性化质粒加入到装有80μL毕赤酵母GS115感受态细胞的1.5mL EP管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。电击条件为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec。电击完成后，将650uL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中，30℃静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于MD平板上，30℃恒温培养3-4d。图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。

4.PCR鉴定阳性克隆菌株

待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500μL YPD液体培养基离心管，30℃，180r/min过夜培养。挑选10株克隆，分别提取基因组DNA，如图6所示。图中，M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1-10：各克隆菌株提取的基因组。

使用载体上引物PCR鉴定，预期条带大小约2kb，2kb为扩增序列大小，结果如图7所示，其中，M：DNA标准品，从下到上100，200，500，750，1000，2000bp；1-10：各克隆菌株的PCR扩增片段。

5.小试表达

诱导表达：取鉴定的阳性菌株(3#，5#，7#，8#)50μl接入装有10ml BMGY的锥形瓶中，30℃，220r/min过夜培养，摇至OD₆₀₀＝2-6(对数生长，大约16-18h)；室温离心5000r/min离心5min，收集细胞，去除上清，用10ml BMMY重悬细胞，进行诱导表达；每24h从培养基中取样1ml，并加甲醇至终浓度0.5％继续诱导；以下各时间点0，24，48，72，96hr样品10000r/min离心2min收集上清液待检测。

三氯乙酸沉淀法浓缩表达产物：

(1)在离心管中加入500μl培养液上清和1/9体积的100％的TCA，振荡混合，4℃沉淀过夜；

(2)12000r/min离心10min，沉淀为粘稠带黄褐色胶状物，弃上清，收集沉淀，另将EP管倒置于吸水纸上，37℃烘箱静置10～20min，使管壁无明显液体残留；

(3)加入200μl冷丙酮，振荡混匀，样品在室温下静置10min，洗去管壁和管底残留的TCA；

(4)12000r/min离心10min，弃上清，重复步骤(2)和(3)，重复2～3次；

(5)加入上样缓冲液30μl，37℃孵育1h，溶解沉淀；如果沉淀不溶解，可用100μl枪头吹打至沉淀溶解。

6.鉴定分析

Western Blotting检测：

(1)取样品上样10μl；

(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；

(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h，恒流250mA；

(4)电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min；

(5)将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h；

(6)用封闭液稀释一抗(Rabbit anti-His)，膜在一抗稀释液(稀释比例1:1000)中4℃过夜；

(7)次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min；

(8)用含5％牛奶的封闭液稀释二抗(羊抗兔)，膜在二抗稀释液(稀释比例1:5000)中37℃反应1h；

(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min；

(10)ECL显影，曝光。

将选择的#3，#5，#7，#8阳性克隆菌株培养48和72小时的样品，进行Western Blot初步检测。检测结果如图8所示，其中M：蛋白标准品；1：GS115菌株培养72小时上清样品；2：3#阳性菌株培养48小时上清样品；3：3#阳性菌株培养72小时上清样品；4：5#阳性菌株培养48小时上清样品；5：5#阳性菌株培养72小时上清样品；6：7#阳性菌株培养48小时上清样品；7：7#阳性菌株培养72小时上清样品；8：8#阳性菌株培养48小时上清样品；9：8#阳性菌株培养72小时上清样品。

表达分析：

SDS-PAGE电泳检测：选取7#阳性菌进行表达情况分析结果如图9所示。其中，M：蛋白标准品；1：GS115菌株培养72小时上清；2：7#阳性菌株培养0小时上清；3：7#阳性菌株培养24小时上清；4：7#阳性菌株培养48小时上清；5：7#阳性菌株培养72小时上清；6：7#阳性菌株培养96小时上清。7#阳性菌命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.16461。

本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因I型的螺旋区中选择水溶性好、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。实验证明该法生产的重组类人胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，由于其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，所以应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。本发明采用的是分泌型表达载体，成功实现了重组类人胶原蛋白的分泌型表达，表达产物分泌在上清液中，方便纯化，具有其他重组类人胶原蛋白生产所不具备的优势，便于规模化生产操作。由于载体电转入毕赤酵母之后，基因整合在毕赤酵母基因组上，所以重组菌的稳定性好，经过多次传代基因不容易发生流失并能保持高效表达的性状，能够很好的实现稳定生产，毕赤酵母生产方法为好氧发酵，菌体密度高，表达量还有很大的提升空间。

序列表

<110> 江苏江山聚源生物技术有限公司

<120> 重组人源Ⅰ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法

<141> 2018-12-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1440

<212> PRT

<213> 人属(Homo sapiens)

<400> 1

Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr

1 5 10 15

Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp

20 25 30

Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His

35 40 45

Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp

50 55 60

Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn

65 70 75 80

Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro

85 90 95

Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly

100 105 110

Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro

115 120 125

Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro

130 135 140

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala

145 150 155 160

Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser

165 170 175

Val Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro

180 185 190

Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro

195 200 205

Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly

210 215 220

Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg

225 230 235 240

Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro

245 250 255

Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly

260 265 270

Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu

275 280 285

Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg

290 295 300

Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly

305 310 315 320

Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro

325 330 335

Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys

340 345 350

Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly

355 360 365

Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro

370 375 380

Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn

385 390 395 400

Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly

405 410 415

Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn

420 425 430

Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys

435 440 445

Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly

450 455 460

Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu

465 470 475 480

Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro

485 490 495

Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly

500 505 510

Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg

515 520 525

Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro

530 535 540

Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly

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Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln

565 570 575

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580 585 590

Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly

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Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro

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Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly

645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly

690 695 700

Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser

705 710 715 720

Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala

725 730 735

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly

740 745 750

Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro

755 760 765

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser

770 775 780

Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly

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Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro

805 810 815

Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala

820 825 830

Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly

835 840 845

Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala

850 855 860

Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala

865 870 875 880

Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly

885 890 895

Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu

900 905 910

Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro

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Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly

930 935 940

Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val

945 950 955 960

Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro

965 970 975

Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly

980 985 990

Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro

995 1000 1005

Pro Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro

1010 1015 1020

Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly

1025 1030 1035 1040

Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro

1045 1050 1055

Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala

1060 1065 1070

Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly

1075 1080 1085

Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp

1090 1095 1100

Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro

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Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly

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Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys

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Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe

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1205 1210 1215

Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp

1220 1225 1230

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Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln

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Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly

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Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp

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Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp

1330 1335 1340

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Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr

1395 1400 1405

Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys

1410 1415 1420

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1425 1430 1435 1440

<210> 2

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly

1 5 10 15

Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala

20 25 30

Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn

35 40 45

Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly

50 55 60

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225 230 235 240

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245 250 255

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275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

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370 375 380

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Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro

405 410 415

Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala

420 425 430

Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly

435 440 445

Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly His

450 455 460

Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro

465 470 475 480

Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly

485 490 495

Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn

500 505 510

<210> 3

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtccatctg gtccaagagg tttaccaggt ccaccaggtg ctccaggtcc tcaaggtttt 60

caaggtcctc ctggtgaacc aggtgaacct ggtgcttctg gtcctatggg tcctagaggt 120

ccacctggac caccaggcaa aaatggtgat gatggtgaag ctggtaagcc aggtagacca 180

ggtgagagag gtcctccagg accacaaggt gctagaggat tgccaggtat gaagggtcac 240

agaggtttct ctggtttgga tggtgctaag ggtgatgctg gtcctgctgg acctaaaggt 300

gagccaggat ctccaggtga aaatggtgca cctggtcaaa tgggaccaag aggtctgcct 360

ggtgaaaggg gtagacccgg tgctcctgga cctgctggtg ccagaggtaa tgatggtgca 420

actggcccac caggtcctac tggtccagct ggccctcctg gtccatccgg acctcaaggc 480

ccaggcggac cacctggtcc aaagggtaat tctggtgagc ctggcgctcc aggttcaaaa 540

ggtgatactg gtgctaaagg cgaaccagga ccagttggtg ttcaaggacc tccaggtcca 600

gccggtgaag agggtaaaag aggtgctagg ggagaacctg gtcctacagg tttgcccgga 660

cctcctggcg aaagaggtgg tcccggtagt agaggtgctg ctggcgaacc tggaaaagct 720

ggtgaacgtg gtgtaccagg acctgccggt aaagacggtg aggctggtgc acaaggacca 780

cctggacctg caggacccgc tggtgaaaga ggcgaacaag gtcctgccgg ttctccaggt 840

ttccaaggac cagcaggccc acctggcgaa gccggtaaac ccggtgaaca aggtgttcca 900

ggcgctcccg gaccaagtgg tgcaagaggt gagaggggtt ttccaggcga aaggggtgtt 960

cagggtccac ctggtcctgc cggaccaagg ggtgctaatg gtgctcctgg taacgacggt 1020

gcaaaaggtg acgcaggacc aaaaggcgat aggggagatg caggtcctaa gggtgctgat 1080

ggatcaccag gtaaggacgg tgttagaggt agagttggtc ctcctggacc atctggtaat 1140

gctggccctc caggacctcc tggtcctgcc ggcaaagaag gtggtaaagg acctagaggc 1200

gaaactggac cagccggcag acctggtgaa gttggtccac ctggacctcc aggtcctgct 1260

ggcgagaaag gttctcctgg tgctgacggt ccagctggtg ccccaggtac tcctggtcca 1320

cagggtccac aaggtcccag aggtgataag ggtgaaactg gtgagcaagg tgacagaggt 1380

atcaagggac atagaggatt ttccggttta cagggaccac caggaccacc tggaagtcct 1440

ggtgaacaag gtccttctgg tgcttcagga cctgctggcc caagaggtcc accaggatct 1500

gctggtgctc ctggaaaaga tggtttgaac 1530

<210> 4

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaatactact attgccagca ttgctgctaa agaagaaggg gtatctctcg agaaaagaga 60

ggctgaagct tacgtagaat tcggtccatc tggtccaaga ggtttaccag gtccaccagg 120

tgctccaggt cctcaaggtt ttcaaggtcc tcctggtgaa ccaggtgaac ctggtgcttc 180

tggtcctatg ggtcctagag gtccacctgg accaccaggc aaaaatggtg atgatggtga 240

agctggtaag ccaggtagac caggtgagag aggtcctcca ggaccacaag gtgctagagg 300

attgccaggt atgaagggtc acagaggttt ctctggtttg gatggtgcta agggtgatgc 360

tggtcctgct ggacctaaag gtgagccagg atctccaggt gaaaatggtg cacctggtca 420

aatgggacca agaggtctgc ctggtgaaag gggtagaccc ggtgctcctg gacctgctgg 480

tgccagaggt aatgatggtg caactggccc accaggtcct actggtccag ctggccctcc 540

tggtccatcc ggacctcaag gcccaggcgg accacctggt ccaaagggta attctggtga 600

gcctggcgct ccaggttcaa aaggtgatac tggtgctaaa ggcgaaccag gaccagttgg 660

tgttcaagga cctccaggtc cagccggtga agagggtaaa agaggtgcta ggggagaacc 720

tggtcctaca ggtttgcccg gacctcctgg cgaaagaggt ggtcccggta gtagaggtgc 780

tgctggcgaa cctggaaaag ctggtgaacg tggtgtacca ggacctgccg gtaaagacgg 840

tgaggctggt gcacaaggac cacctggacc tgcaggaccc gctggtgaaa gaggcgaaca 900

aggtcctgcc ggttctccag gtttccaagg accagcaggc ccacctggcg aagccggtaa 960

acccggtgaa caaggtgttc caggcgctcc cggaccaagt ggtgcaagag gtgagagggg 1020

ttttccaggc gaaaggggtg ttcagggtcc acctggtcct gccggaccaa ggggtgctaa 1080

tggtgctcct ggtaacgacg gtgcaaaagg tgacgcagga ccaaaaggcg ataggggaga 1140

tgcaggtcct aagggtgctg atggatcacc aggtaaggac ggtgttagag gtagagttgg 1200

tcctcctgga ccatctggta atgctggccc tccaggacct cctggtcctg ccggcaaaga 1260

aggtggtaaa ggacctagag gcgaaactgg accagccggc agacctggtg aagttggtcc 1320

acctggacct ccaggtcctg ctggcgagaa aggttctcct ggtgctgacg gtccagctgg 1380

tgccccaggt actcctggtc cacagggtcc acaaggtccc agaggtgata agggtgaaac 1440

tggtgagcaa ggtgacagag gtatcaaggg acatagagga ttttccggtt tacagggacc 1500

accaggacca cctggaagtc ctggtgaaca aggtccttct ggtgcttcag gacctgctgg 1560

cccaagaggt ccaccaggat ctgctggtgc tcctggaaaa gatggtttga actaagcggc 1620

cgc 1623

Claims

1.重组人源Ⅰ型胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ No.2所示。

2.编码重组人源Ⅰ型胶原蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ No.3所示。

3.包含权利要求2的基因的重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒，其核苷酸序列如SEQ No.4所示。

4.权利要求3所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒的构建方法，其特征在于，通过将权利要求2所述的基因双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I 和Not I间构建而成。

5.重组人源Ⅰ型胶原蛋白表达菌株，其为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201，保藏编号为CGMCC No.16461。