CN117025559A - 重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多肽生物合成技术领域。具体公开了重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用。重组脯氨酸羟化酶为如下A1或A2所示的蛋白质：A1氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蛋白质；A2氨基酸序列为SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.1同一性在90％或以上，且与A1具有相同功能的蛋白质。通过该羟化酶与重组胶原蛋白共表达，成功实现了重组胶原蛋白的翻译后羟基化，使其在结构和功能上更趋近于天然胶原蛋白。本发明通过多基因表达增强了该羟化酶的活性，提高了目标蛋白的羟基化率，使得异源生产的胶原蛋白具有优异的促细胞增殖能力。

Description

重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于多肽生物合成技术领域，具体涉及重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
胶原蛋白是一类生物高分子蛋白的总称，是哺乳动物细胞外基质中主要结构蛋白，约占总蛋白含量的25％-30％，广泛地分布于皮肤、关节、骨骼等部位，参与细胞的增值、分化、迁移和信号传递等生理行为，以此起到支撑、修复及抗衰老的作用。加之胶原蛋白拥有良好的稳定性、优异的生物相容性及低免疫原性等优点，使其被广泛应用于临床医学、保健食品、化妆品、生物材料及医疗器械等领域。目前已破解了至少49种胶原蛋白的基因编码，可指导合成的胶原蛋白类型可达28种。其中Ⅰ型和Ⅲ型作为真皮层中最主要的胶原蛋白类型，在医疗美容、护肤、护发产品中被广泛应用。
胶原蛋白富含重复的Gly-X-Y结构域，这些结构域是胶原蛋白形成三螺旋结构的基础，亦是胶原蛋白发挥活性功能的核心要素。其中，X和Y常为脯氨酸或羟脯氨酸，羟脯氨酸羟基能形成强氢键以此稳固三螺旋结构，进而提高胶原蛋白的强度和稳定性。当前，因传统提取方法受来源、分离纯化工艺、病毒感染等问题的限制，借助基因工程技术生产胶原蛋白已是近年来的主要手段。由于，以大肠杆菌为主的原核表达体系无法在翻译后进行近一步加工，使重组胶原蛋白缺乏羟基化及糖基化修饰，而导致产物稳定性和功能性不足，作用效果不理想。动植物细胞虽然具有完备的功能性细胞器，但其培养困难、纯化成本高，且产量低，为大规模生产带来了巨大难度。
目前，虽然已有专利CN102020716A报道了使用毕赤酵母表达人型胶原蛋白的方法，但胶原蛋白发挥功能依赖于其特殊的三螺旋结构，而羟脯氨酸对胶原蛋白形成稳定的三螺旋结构不可或缺，然毕赤酵母细胞自身却无法表达催化脯氨酸羟基化的4-脯氨酸羟基化酶，所以该方法无法形成功能完备的重组胶原蛋白。专利CN104313053A利用杆状病毒在家蚕幼虫中共表达脯氨酸羟化酶与人源Ⅱ胶原蛋白，虽然在一定程度上实现了脯氨酸羟基化，但直接将两个亚基无间隔的连接在同一个质粒中融合表达，使得以α2β2形式构成四聚体的4-脯氨酸羟基化酶(P4H)无法实现有效聚合及三维折叠，从而降低了酶活，影响后续羟基化反应，而且采用病毒侵染昆虫细胞的方式表达蛋白，不仅增加了操作难度，也提高了生产成本。因此迫切需要一种操作方便、成本低且易于生产高生物活性的重组人源胶原蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的第一目的是提供一种重组脯氨酸羟化酶，所述重组脯氨酸羟化酶为如下A1或A2所示的蛋白质：A1氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蛋白质；A2氨基酸序列为SEQ IDNO.1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.1同一性在90％或以上，且与A1具有相同功能的蛋白质。
本发明的第二目的是提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的重组脯氨酸羟化酶。
进一步的，所述核酸分子包括如下a1或a2所示的核酸分子：a1编码区包括SEQ IDNO.2的核酸分子；a2核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核酸分子。
本发明的第三目的是提供一种重组载体，包括上述的核酸分子。
本发明的第四目的是提供上述的重组脯氨酸羟化酶或者核酸分子或者重组载体在蛋白异源表达中提高目标蛋白中脯氨酸羟基化的应用。
本发明的第五目的是提供一种用于羟化重组胶原蛋白的脯氨酸的方法，包括以下步骤：S1、提供细胞，所述细胞表达上述的重组脯氨酸羟化酶；S2、将重组胶原蛋白添加至所述细胞中，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步的，还包括步骤S3、从所述细胞的上清液提取脯氨酸羟基化的重组胶原蛋白。
进一步的，所述细胞包括真核细胞或原核细胞，所述原核细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌；所述真核细胞为毕赤酵母、酿酒酵母、动物细胞或植物细胞。
本发明的第六目的是提供一种羟基化重组胶原蛋白，采用上述的方法得到的。
本发明的第七目的是提供一种试剂盒，用于脯氨酸的羟基化，其特征在于，所述试剂盒包括如上述的细胞或者上述的重组载体。
本发明的第八目的是提供一种包含上述的羟基化重组胶原蛋白的组合物。
本发明的第九目的是提供一种通过将上述的羟基化重组胶原蛋白交联得到的交联蛋白制品。
本发明的第十目的是提供上述的羟基化胶原蛋白或者组合物或者制品在制备药物、生物材料、组织材料、医疗器械、化妆品或保健品中的应用。
与现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明提供的重组脯氨酸羟化酶包含依次连接的4-脯氨酸羟基化酶α亚基、P2A连接肽和4-脯氨酸羟基化酶β亚基，通过重组脯氨酸羟化酶与重组胶原蛋白共表达，成功实现了重组胶原蛋白的翻译后羟基化，使其在结构和功能上更趋近于天然胶原蛋白。
(2)本发明通过采用多基因表达的方式进一步增强了4-脯氨酸羟基化酶的活性，提高了重组胶原蛋白的羟基化率，使异源生产的胶原蛋白亦拥有了优良的促细胞增殖的能力。
(3)本发明采用毕赤酵母异源表达胶原蛋白是一种操作方便、参数便于控制、细胞增值快、表达蛋白稳定且可分泌至胞外易于纯化、同时具有翻译后修饰功能、成本低廉且适合大规模生产的方法。
附图说明
图1为本发明的重组脯氨酸羟化酶酶促反应原理图；
图2为本发明构建的重组脯氨酸羟化酶的重组质粒的结构示意图；
图3为本发明构建的重组胶原蛋白的重组质粒的结构示意图；
图4为本发明的rhCOL1、rhCOL2电泳图；
图5为本发明的P4H1和P4H2的酶活测定结果图；
图6为本发明的羟基化重组胶原蛋白促增殖作用试验结果图；
图7为本发明的羟基化重组胶原蛋白促增殖作用试验结果数据统计图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂和生物原料均通过商业途径购买。
其中，pfu DNA聚合酶试剂购自北京索莱宝科技有限公司；fastpfu DNA聚合酶试剂购自北京全式金生物技术股份有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Vectro试剂购自北京全式金生物技术股份有限公司；pPIC9K购自赛默飞世尔科技公司；EcoRⅠ购自碧云天生物技术有限公司；同源重组反应试剂(2×Basic Assembly Mix)购自北京全式金生物技术股份有限公司；pPICZαA购自赛默飞世尔科技公司；SMD1168毕赤酵母购自赛默飞世尔科技公司；CCK8试剂购自碧云天生物技术有限公司；Zeocin抗生素购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。
其中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照设备制造厂商所建议的条件。
本发明中英文/缩写说明如下：
YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，配方组成：胰蛋白胨2％、酵母提取物1％、D-葡萄糖(L-Glucose)2％，若要配制固体培养基，再加入1.5％的琼脂粉。
BMGY(Buffered Minimal Glycerol YP Medium)：含甘油的缓冲性完全培养基，配方组成：胰蛋白胨2％、酵母提取物1％、磷酸钾缓冲液(pH 6.0)0.1mol/L、甘油1％、YNB(Yeast Nitrogen Base，酵母氮源基础)1.34％。
BMMY(Buffered Methanol-complex Medium):含甲醇的缓冲性复杂培养基，配方组成：胰蛋白胨2％、酵母提取物11％、磷酸钾缓冲液(pH 6.0)0.1mol/L、甘油1％、YNB(Yeast Nitrogen Base，酵母氮源基础)1.34％、生物素(Biotin)4×10-5％、甲醇1％。
定义与说明：
本发明中所用的术语“同一性”是同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residuegap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本发明中所用的术语“具有相同功能的蛋白质”与本领域技术人员常规理解的含义相同或相似，均是指某一片段的氨基酸序列是完整蛋白或多肽的氨基酸序列的一部分，具备与完整蛋白或多肽相同或相似的功能或活性。本领域普通技术人员应当理解，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biologyof TheGene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。
本发明中所用的术语“异源”意指在正常情况下(即没有人为干预下)不表达某种蛋白质的细胞中表达所述蛋白质。具体而言，术语“异源”也可指相较于在其中进行表达特别是重组表达的细胞而言某个蛋白质或基因所来源的物种。异源蛋白则是源自与在其中进行表达的细胞(即本发明第五方面的方法的细胞)不同的物种的蛋白质。例如，本发明人在酵母细胞中表达了哺乳动物具体而言人的蛋白质，使得这些蛋白质相对于所述细胞是异源的。
本发明第一方面提供的一种重组脯氨酸羟化酶，所述重组脯氨酸羟化酶为如下A1或A2所示的蛋白质：A1氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蛋白质；A2氨基酸序列为SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.1同一性在90％或以上，且与A1具有相同功能的蛋白质。
在具体的实施方式中，重组脯氨酸羟化酶具体为依次连接的4-脯氨酸羟基化酶α亚基、P2A连接肽和4-脯氨酸羟基化酶β亚基，其中4-脯氨酸羟基化酶α亚基(P4HA)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，4-脯氨酸羟基化酶β亚基(P4HB)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，P2A连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
如图1所示，本发明提供的重组脯氨酸羟化酶的酶促反应原理图，该反应依赖于亚铁离子和α-酮戊二酸的氧化酶。其可以利用亚铁离子作为辅因子，在氧气的参与下，可使得多肽底物中含有的脯氨酸羟基化，同时对辅因子α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)进行脱羧，生成琥珀酸和二氧化碳。
本发明第二方面提供的一种核酸分子，为编码本发明重组脯氨酸羟化酶的核酸分子。术语“编码重组脯氨酸羟化酶的核酸分子”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
在具体的实施方式中，上述核酸分子可以是与编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的DNA同源性或序列相同性在90％以上，优选95％以上，更优选99％的DNA。
编码上述重组脯氨酸羟化酶的核酸分子可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得。
在一个实施方案中，编码上述重组脯氨酸羟化酶的核苷酸序列是经密码子优化的。在一些情况下，这可能是必要的，因为大多数氨基酸由超过一种密码子编码，并且密码子使用因生物而异。经转染的基因与宿主细胞之间的密码子使用差异可能会影响核酸构建体的蛋白质表达和免疫原性。通常，对于密码子优化，选择密码子以选择与宿主使用频率平衡的那些密码子。通常，氨基酸密码子的冗余度使得不同的密码子编码一种氨基酸。
本发明提供的一种重组载体，该载体包括上述的核酸分子。
在具体的实施方式中，该载体为外源质粒。例如，将编码上述重组脯氨酸羟化酶的一种或多种核酸克隆到合适的一种或多种表达载体中，表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在具体的实施方式中，为了产生重组脯氨酸羟化酶，可以将编码重组脯氨酸羟化酶的核酸分离，并且将其插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆/或表达，可以使用本领域常规技术完成。宿主细胞是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代，对于载体导入宿主细胞中的方法是公知的，例如以热激的方法将载体导入到宿主细胞中。
在一个实施方案中，宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选的，原核细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，更优选为大肠杆菌；
优选的，真核细胞可以为毕赤酵母、酿酒酵母、动物细胞或植物细胞，更优选为毕赤酵母。
本发明提供的上述重组脯氨酸羟化酶可以在蛋白异源表达中提高目标蛋白中脯氨酸羟基化。
本发明提供的上述核酸分子可以在蛋白异源表达中提高目标蛋白中脯氨酸羟基化。
本发明提供的上述重组载体可以在蛋白异源表达中提高目标蛋白中脯氨酸羟基化。
作为一个实施方案，本申请提供的一种用于羟化重组胶原蛋白的脯氨酸的方法，包括以下步骤：S1、提供细胞，该细胞表达上述的重组脯氨酸羟化酶；S2、将重组胶原蛋白添加至该细胞中，其中，重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
具体而言，“重组胶原蛋白”是通过将Ⅰ型(COL1A1)和Ⅲ型(COL3A1)人源胶原蛋白基因中各自独特的一段经拼接并进行3次串联得到的。其中COL1A1的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；COL3A1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
人源Ⅲ型胶原蛋白中GxxGEx序列作为整合素的识别位点，可与细胞膜表面的受体相互作用，从而引导胶原蛋白发挥促进细胞增值等活性功能，故筛选富含此活性位点的人源Ⅲ型胶原蛋白(hCOL3A1)Gly483-Pro512作为研究对象；人源Ⅰ型胶原蛋白(hCOL1A1)Gly932-Ser991肽段特有的Gly-Glu-Arg、Gly-Phe-Pro和Gly-Lys-Glu三螺旋肽结构，直接或间接的发挥着调节细胞部分功能的作用。故本发明采用将hCOL1A1的Gly932-Ser991肽段和hCOL3A1的Gly483-Pro512肽段首尾相连，并进行三次重复后获得重组胶原蛋白COL。
目前，NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已经公布的来源于(Ⅰ型人源胶原蛋白基因和Ⅲ型人源胶原蛋白基因的重组蛋白)的氨基酸序列，经过BLAST比对，大概有38条序列与本申请中的重组胶原蛋白COL序列有50％左右的同源性。
具体的实施方式中，将重组脯氨酸羟基化酶的表达质粒同重组人源胶原蛋白的表达质粒在酵母细胞中进行共表达。首先引入可自剪切的2A肽(P2A)作为连接子，将4-脯氨酸羟基化酶的α亚基和β亚基序列P4HA、P4HB串联并构建到pPIC9K质粒中，实现两个亚基的独立等量表达；而重组胶原蛋白序列则是通过将Ⅰ型(COL1A1)和Ⅲ型(COL3A1)人源胶原蛋白基因中各自独特的一段经拼接并进行3次串联所获得。之后，将重组脯氨酸羟基化酶的表达质粒转入到SMD1168酵母细胞中进行诱导表达，并通过Weatern Blot的方法分别检测引入α、β两个亚基中Flag和HA标签蛋白，以此反映两个亚基的表达情况。将拼接成功的胶原蛋白序列利用密码子优化软件进行优化后，同pPICZαA载体进行连接，构建重组人源胶原蛋白表达质粒pPICZαA-COL，而后电转化到具备表达重组脯氨酸羟基化酶功能的酵母细胞中，经甲醇诱导后，可获得pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB与pPICZαA-COL共表达的羟基化重组胶原蛋白(rhCOL1)。
本发明提供的上述用于羟化重组胶原蛋白的脯氨酸的方法，还包括从上述细胞的上清液提取脯氨酸羟基化的重组胶原蛋白。
在具体的实施方式中，将细胞进行培养，从培养物中获得羟基化重组胶原蛋白。培养基和培养条件对于本领域技术人员来说是公知的，例如使用BMGY、LB、YPD、YNB等培养基进行培养。对于从培养物中获得羟基化重组胶原蛋白，本发明不作任何限制，其可以根据需要进行确定。例如，可采用常规方法分离纯化，进一步的可以使用盐析法、色谱层析法、亲和层析法、酸碱沉淀法、膜分离法等方法中的一种或两种组合，还可以为色谱层析法与膜分离法的组合，还可以为离子交换层析法与膜分离法的组合。
本发明提供的一种羟基化胶原蛋白，采用上述的羟基化方法制备得到。
本发明提供的一种试剂盒，用于脯氨酸的羟基化，其包括上述的细胞或者上述的重组载体。术语“试剂盒”用于本发明意指实施第五方面的方法所必需的试剂、材料和说明中的全部或一些的集合。这包括细胞培养基或缓冲液(均为干燥或液体形式)、一种或多种细胞诱导剂、用于提取蛋白的溶剂和特别是有待羟化的蛋白。另外，设想本文描述的与第五方面的方法有关的全部试剂或材料可以是第七方面的试剂盒的一部分。
本发明提供的一种包含上述的羟基化重组胶原蛋白的组合物。组合物的形式，本申请不作任何限制，其可以根据需要进行确定。
本发明提供的一种通过将上述的羟基化重组胶原蛋白交联得到的交联蛋白制品。由于氨基酸序列中富含精氨酸和赖氨酸，其为交联提供了充足的羧基和氨基，使得胶原蛋白在简单的条件下就能实现充分的交联，大大降低了交联的难度。本申请中的“交联”指的是小分子蛋白或者线性蛋白间以共价键连接成网状或高分子蛋白的过程。
在具体的实施方式中，重组胶原蛋白通过交联后形成的大分子形式。交联后的重组胶原蛋白仍具有Ⅰ型人源胶原蛋白和Ⅲ型人源胶原蛋白的活性功能。
本发明提供了上述的羟基化重组胶原蛋白或者上述的组合物或者上述的制品在制备药物、生物材料、组织材料、医疗器械、化妆品或保健品中的应用。
在具体的实施方式中，以羟基化重组胶原蛋白为原料，制备药物、生物材料、组织材料、医疗器械、化妆品或保健品用于促进人表皮细胞的增殖。
在具体的实施方式中，以包含羟基化重组胶原蛋白的组合物为原料，制备药物、生物材料、组织材料、医疗器械、化妆品或保健品用于促进人表皮细胞的增殖。
在具体的实施方式中，以通过上述的羟基化重组胶原蛋白交联得到的交联蛋白制品为原料，制备药物、生物材料、组织材料、医疗器械、化妆品或保健品用于促进人表皮细胞的增殖。
实施例1:
本实施例提供一种构建表达重组脯氨酸羟化酶的重组质粒。
通过聚合酶链式反应(PCR)，分别获取P4HA、P2A、P4HB，并构建重组质粒pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB。
PCR反应体系(50μL)包括：
反应程序：
1.1重组脯氨酸羟化酶的质粒构建(pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB)
(1)以PMD 18T-P4HA为模板，获取P4HA片段；
Forward primer 1(SEQ ID NO.9)：
GATTACAAGGATGACGACGATAAGCATCCAGGATTCTTCACTTCCATA；
Reverse primer 1(SEQ ID NO.10)：
AAGTTCGTGGCTCCGCTTCCCTCCAACTCAGACAACGTACA；
按照上述程序进行反应，退火55℃，72℃延伸时间为2分40秒。
(2)PMD 18T-P2A，为模板，获取P2A片段；
Forward primer 2(SEQ ID NO.11)：
CCTTGTACGTTGTCTGAGTTGGAGGGAAGCGGAG CCACGAACTT；
Reverse primer 2(SEQ ID NO.12)：CATAGGCCCG GGGTTTTCTT；
按照上述程序进行反应，退火59℃，72℃延伸时间为30秒。
(3)PMD 18T-P4HB，为模板，获取P4HB片段；
Forward primer 3(SEQ ID NO.13)：
AAGAAAACCCCGGGCCTATGGATGCACCAGAAGAGGAAGACC；
Reverse primer 3(SEQ ID NO.14)：
AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACAATTCATCCTTAACGGCTTTC；
按照上述程序进行反应，退火56℃，72℃延伸时间为2分30秒。
(4)将上述3个PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并纯化回收。
(5)将纯化获得的P4HA和P2A共同作为模板，扩增获得P4HA-P2A重组片段
Forward primer 4(SEQ ID NO.15)：GATTACAAGGATGACGACGATAAGC；
Reverse primer 4(SEQ ID NO.16)：
GGTCTTCCTCTTCTGGTGCATCCATAGGCCCGGGGTTTTCTT；
按照上述程序进行反应，退火56℃，72℃延伸时间为2分50秒。
(6)将重组片段P4HA-P2A采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并纯化回收。
(7)以纯化回收获得的P4HA-P2A和P4HB为模板，扩增获得重组P4HA-P2A-P4HB片段；
Forward primer 4(SEQ ID NO.15)：GATTACAAGGATGACGACGATAAGC；
Reverse primer 5(SEQ ID NO.17):AGCGTAGTCTGGGACGTCGTAT；
按照上述程序进行反应，使用fastpfu DNA聚合酶，设定退火57℃，72℃延伸时间为50秒。
(8)将重组片段P4HA-P2A-P4HB采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并纯化回收。
(9)将纯化回收的重组P4HA-P2A-P4HB片段同pEASY-Blunt Simple CloningVectro进行连接反应，并将之后连接成功的重组载体进行测序鉴定。
反应体系：PCR Product添加0.5-4μL；Vectro 1μL，轻轻混匀，室温(20℃-37℃)反应5分钟，之后置于冰上。
(10)以步骤(9)中测序鉴定成功的载体作为模板，以下述序列为引物，进行PCR反应；
Forward primer 6(SEQ ID NO.18)：
GCTGAAGCTTACGTAGAATTCGATTACAAGGATGACGACGATAAGC；
Reverse primer 6(SEQ ID NO.19)：
CGCGGCCGCCCTAGGGAATTCAGCGTAGTCTGGGACGTCGTAT；
按照上述程序进行反应，使用fastpfu DNA聚合酶，设定退火57℃，72℃延伸时间为50秒。
(11)将上步获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并纯化回收。
(12)将pPIC9K质粒采用EcoRⅠ进行单酶切，反应体系为：
并纯化回收。
(13)将第(11)步骤和第(12)步骤中的产物进行同源重组反应，获得重组4-脯氨酸羟基化酶质粒pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB。其中，同源重组反应体系为：
保存。
(14)以电转化的方式将重组质粒pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB转入酵母感受态。
结果如2图所示，构建完成的重组质粒pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB，约12kbp，质粒上含有AmpR和KanR两种抗性基因。在酵母表达系统中，KanR可发挥抵抗遗传霉素(G-418)的作用，为筛选阳性高拷贝重组子提供了便利，而因质粒中不含有信号肽，重组脯氨酸羟化酶将存在于胞内。
对比例1：
本对比例提供的是分别构建α亚基的表达质粒和β亚基的表达质粒。
通过聚合酶链式反应(PCR)，分别获取P4HA、P4HB片段，并构建多基因表达重组质粒pPIC9K-P4HA、pPIC9K-P4HB。构建过程基本同实施例1，不同之处如下：
(1)以实施例1中获取P4HA片段为模板，通过通过PCR反应获得P4HA-1片段；
Forward primer 6(SEQ ID NO.18)：
GCTGAAGCTTACGTAGAATTCGATTACAAGGATGACGACGATAAGC；
Reverse primer 7(SEQ ID NO.20)：
CGCGGCCGCCCTAGGGAATTCCTCCAACTCAGACAACGTACAAG；
按照上述程序进行反应，退火54℃，72℃延伸时间为2分40秒。
(2)以实施例1中获取P4HB片段为模板，通过通过PCR反应获得P4HB-1片段；
Forward primer 7(SEQ ID NO.21)：
GCTGAAGCTTACGTAGAATTCGATGCACCAGAAGAGGAAGACC；
Reverse primer 6(SEQ ID NO.19)：
CGCGGCCGCCCTAGG GAATTCAGCGTAGTCTGGGACGTCGTAT
按照上述程序进行反应，退火57℃，72℃延伸时间为2分30秒。
(3)将获得的P4HA-1、P4HB-1片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，并纯化回收。
(4)将上步的两个PCR产物分别同酶切后的pPIC9K质粒进行同源重组反应，获得重组质粒pPIC9K-P4HA、pPIC9K-P4HB，并将两个质粒按照1:1的比例混合均匀，并转入酵母感受态细胞。
实施例2：
本实例提供一种制备羟基化重组胶原蛋白的方法。
采用重组质粒pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB同重胶原蛋白质粒在酵母细胞中进行共表达。
将实施例1构建的重组质粒pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB在SMD1168毕赤酵母细胞内先诱导表达重组脯氨酸羟基化酶，待重组脯氨酸羟基化酶积一定量后，再诱导强启动子控制下的重组胶原蛋白表达。具体过程如下：
2.1、构建重组胶原蛋白的质粒(pPICZαA-COL1A1-COL3A1)
构建过程基本同实施例1，不同之处如下：
(1)以PMD 18T-COL1A1为模板，获取COL1A1片段
Forward primer 8(SEQ ID NO.22)：GGTGAAAAGGGTTCTCCAGG；
Reverse primer 8(SEQ ID NO.23)：
AACCTGGAGCACCTCTTTCTCCAGAAGCACCAGAAGGACCTTG；
按照上述程序进行反应，退火55℃，72℃延伸时间为30秒。
(2)以PMD 18T-COL3A1为模板，获取COL3A1片段
Forward primer 9(SEQ ID NO.24)：
AAGGTCCTTCTGGTGCTTCT GGAGAAAGAGGTGCTCCAGG；
Reverse primer 9(SEQ ID NO.25)：AGGTGCACCTCTTTCTCCAG；
按照上述程序进行反应，退火55℃，72℃延伸时间为30秒。
(3)对上述2个PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并纯化回收。
(4)将COL1A1和COL3A1混合均匀后作为模板，扩增获得重组COL1A1-COL3A1片段；
Forward primer 10(SEQ ID NO.26)：GGTGAAAAGGGTTCTCCAGG；
Reverse primer 10(SEQ ID NO.27)：AGGTGCACCTCTTTCTCCAG；
按照上述程序进行反应，退火54℃，72℃延伸时间为40秒。
(5)后续通过PCR反应完成COL1A1-COL3A1片段的3次重复序列串联，并将其与酶切后的质粒pPICZαA以同源重组的方式进行连接，获得重组胶原蛋白质粒pPICZαA-COL1A1-COL3A1。
结构如图3所示，重组胶原蛋白采用pPICZαA载体进行表达，构建完成的重组质粒约4.4kbp，质粒上含有BLeoR片段，即Zeocin抗性基因，可方便对目标重组子的筛选。α-factor signal为信号肽，可引导目标蛋白分泌表达，利于后续对重组胶原蛋白的纯化。
2.2、毕赤酵母感受态的制备
(1)将-80℃保存的SMD1168毕赤酵母解冻后，接种至无抗性的YPD平板上，30℃培养24-48h；挑毕赤酵母SMD1168单菌落接种于5mL无抗性YPD液体培养基中，置于30℃摇床中活化培养36-48h。
(2)按1:100比例将活化的酵母菌液转接于100mL新鲜的YPD液体培养基中，30℃摇床中培养至OD 600值为1.2-1.5，之后6000×g，4℃离心6min。
(3)弃上清，用10mL酵母电转缓冲液和250μL浓度为1M二硫苏糖醇(DTT)将菌体沉淀重悬。并在30℃摇床中轻摇30min后，4℃，6000×g离心6min，弃上清。
(4)用冰浴的15mL 1M山梨醇重悬酵母菌体，6000×g，4℃离心6min，重复此步骤2遍。
(5)用6mL 1M山梨醇重悬酵母菌体，平均分装至6个1.5mL离心管中，6000×g，4℃离心6min。
(6)弃上清，每个1.5mL离心管中的菌体用50μL山梨醇重悬，置于冰上或4℃冰箱中留待下一步实验。
2.3、电穿孔转化酵母感受态细胞
将制备好的酵母感受态细胞和酶切线性化的重组质粒pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB(5-10μg)轻轻混匀后注入预冷的电击杯中，混匀，置冰上5min。以1500V/25nf/193Ω的条件电击转化细胞。电击后迅速加1mL预冷的1M的山梨醇于电击杯中，置于冰上孵育2min。严格无菌条件下，将电击杯中的菌液转移至无菌1.5mL离心管中，置于30℃摇床低速振荡培养1～2h使电击转化后的酵母细胞恢复活力。常温条件下，将上步已恢复活力的酵母细胞进行6000×g离心5min，弃500μL上清后重悬，取200μl涂布于葡萄糖培养基(MD)平板上，30℃培养2-3天，直至长出肉眼可见单菌落。即可得到同时有P4HA和P4HB表达的酵母菌株。
2.4、阳性酵母重组子的鉴定
挑取MD平板上长出来的酵母单菌落至液体YPD培养基中，于30℃摇床振荡培养过夜；取50μL酵母菌液进行8000×g离心10min，弃掉上清；加入50μL裂解液(Lysis Bufferfor Microorganism to Direct PCR)，80℃热变性15min。低速离心后取上清作为模板，以5’AOX和3’AOX引物进行PCR鉴定目的基因是否整合至酵母基因组。
5’AOX引物(SEQ ID NO.28)：GACTGGTTCCAATTGACAAGC；
3’AOX引物(SEQ ID NO.29)：GCAAATGGCATTCTGACATCC；
按照上述PCR程序进行反应，使用fastpfu DNA聚合酶，设定退火56℃，72℃延伸时间为2分钟。反应完成后，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2.5、重组脯氨酸羟基化酶的表达
将经鉴定确认为阳性的酵母重组菌接种到BMGY培养基中，30℃摇床振荡培养至OD600处于2.0-3.0范围。10000×g离心10min，弃上清，用无菌BMMY培养基重悬酵母菌体，之后转移至培养瓶中，于30℃振荡培养。每隔24h按照1％的比例添加甲醇进行目的蛋白的诱导表达，诱导72h。在温度4℃条件下，10000×g离心10min，弃沉淀，取上清。对转入了多基因重组表达质粒pPIC9K-P4HA-P2A-P4HB的酵母菌诱导，取上清液进行Weatern Blot检测，分别用Flag抗体和HA抗体检测表达P4HA亚基和P4HB亚基的情况，验证成功表达重组脯氨酸羟基化酶P4H1。
2.6、羟基化重组胶原蛋白的表达及纯化
将线性化的重组质粒pPICZαA-COL1A1-COL3A1通过电转化(同上述2.3)到步骤2.3中得到的酵母感受态细胞中。之后取200μl涂布于含500μg/mL zeocin的YPD平板中，30℃培养2-3天，直至长出肉眼可见单菌落。挑取平板上长出来的酵母单菌落至含zeocin抗性的YPD培养基中，对本次转化获得的阳性重组子进行基因鉴定。将鉴定确认的阳性重组菌进行培养，并每隔24h按照1％的比例添加甲醇进行目的蛋白的诱导表达，诱导72h。在温度4℃条件下，10000×g离心10min，弃沉淀，向上清中加入终浓度为0.2M的NaCl和终浓度为20mM的咪唑，于4℃下静置过夜。按照上步条件再次进行离心，上清以低流速流过已平衡的填有Ni2+介质的层析柱，用双蒸水洗涤层析柱3次，之后采用20mM Binding Buffer冲洗4个柱体积，接着使用含不同咪唑浓度的Elution Buffer洗脱蛋白，直至无杂蛋白为止。
本实施例制备得到的重组胶原蛋白命名为rhCOL1。对纯化获得的羟基化重组胶原蛋白rhCOL1进行SDS-PAGE电泳检测。
对比例2：
本对比例提供一种制备羟基化重组胶原蛋白的方法。
本实施例提供的羟基化重组胶原蛋白的制备方法基本同实施例2，不同之处，本对比例采用对比例1构建的重组质粒pPIC9K-P4HA、pPIC9K-P4HB同重胶原蛋白质粒在酵母细胞中进行共表达。具体过程如下：
将对比例1获得的重组质粒pPIC9K-P4HA、pPIC9K-P4HB，1:1的比例混合均匀，参照2.3电穿孔转化酵母感受态细胞的实验过程，将混合重组质粒，转入酵母感受态细胞。其中，重组质粒pPIC9K-P4HA、pPIC9K-P4HB共表达重组脯氨酸羟基化酶P4H2。
本实施例制备得到的重组胶原蛋白命名为rhCOL2。对纯化获得的羟基化重组胶原蛋白rhCOL2进行SDS-PAGE电泳检测。
结果如图4所示，图中最左侧为蛋白Marker，位于25kDa处的两条单一条带为重组蛋白rhCOL1和rhCOL2纯化后获得的目标片段，其与目标序列理论分子量相匹配。
为了更好说明本申请提供的重组脯氨酸羟化酶的结构特点和功能效果，还进行了如下研究：
实施例3：
重组脯氨酸羟化酶的酶活测定。
本实验通过测定羟基化重组胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，进一步反映重组脯氨酸羟化酶的活性，以每分钟内形成1nmol羟脯氨酸酶的数量为重组脯氨酸羟化酶的一个活性单位。
将等量的羟基化重组胶原蛋白rhCOL1、rhCOL2分别与氯胺T溶液混合均匀，于室温静置反应20min后，向其中加入二甲氨基苯甲醛(DMAB)，置于60℃水浴中孵育20min，取出，室温静置15min，吸取200μL反应液于96孔板或微量玻璃比色皿中，测定560nm处吸光值。
结果如图5所示，rhCOL1中羟脯氨酸含量明显高于rhCOL2，重组脯氨酸羟基化酶P4H1的酶活要比重组脯氨酸羟基化酶P4H2的酶活高，表明当实现4-脯氨酸羟基化酶两个亚基的独立等量表达时可获得高催化活性的重组脯氨酸羟化酶，进而增大胶原蛋白中羟脯氨酸的含量，提高胶原蛋白的活性。
实施例4
重组胶原蛋白对人表皮细胞的增殖作用。
取出处于对数生长期的表皮细胞，0.25％胰酶消化后，用DMEM高糖培养基制成密度为2×104个/mL的细胞悬液，吸取100μL加入到96孔培养板中，置于培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h。待96孔板中细胞完全贴壁后，分别向实验组1和实验组2中加入已由DMEM高糖培养基稀释成0.1mg/mL的rhCOL1和rhCOL2样品，对照组加入等体积的DMEM高糖培养基，空白组为无细胞的培养基。之后，将培养板置于培养箱中孵育，分别在24h、48h、72h时向每组孔中加入10μL CCK-8溶液，每孔重复3次，于培养箱内孵育1-4h，使用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度，并计算rhCOL1和rhCOL2在不同时间点对表皮细胞的增殖率。
结果如图6和图7所示，表明羟基化重组胶原蛋白rhCOL1和rhCOL2均具有生物活性，对人表皮细胞表现出不同程度的促增殖作用，但是rhCOL1对人表皮细胞表现出的促增殖作用则明显优于rhCOL2，表现出高生物活性。证明重组脯氨酸羟化酶以多基因表达的方式同胶原蛋白在毕赤酵母中共表达，可以明显提高重组胶原蛋白的活性，更好的发挥功能。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种重组脯氨酸羟化酶，其特征在于，所述重组脯氨酸羟化酶为如下A1或A2所示的蛋白质：A1氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蛋白质；A2氨基酸序列为SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.1同一性在90％或以上，且与A1具有相同功能的蛋白质。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的重组脯氨酸羟化酶。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括如下a1或a2所示的核酸分子：a1编码区包括SEQ ID NO.2的核酸分子；a2核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核酸分子。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求2-3中任一项所述的核酸分子。
5.如权利要求1所述的重组脯氨酸羟化酶或者如权利要求2-3中任一项所述的核酸分子或者如权利要求4所述的重组载体在蛋白异源表达中提高目标蛋白中脯氨酸羟基化的应用。
6.一种用于羟化重组胶原蛋白脯氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提供细胞，所述细胞表达如权利要求1所述的重组脯氨酸羟化酶；S2、将重组胶原蛋白添加至所述细胞中，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括步骤S3、从所述细胞的上清液提取脯氨酸羟基化的重组胶原蛋白。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述细胞包括真核细胞或原核细胞，所述原核细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌；所述真核细胞为毕赤酵母、酿酒酵母、动物细胞或植物细胞。
9.一种羟基化重组胶原蛋白，其特征在于，采用如权利要求6-8任一项所述的方法得到的。
10.一种试剂盒，用于脯氨酸的羟基化，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求6中所述的细胞或者如权利要求4中所述的重组载体。
11.一种包含如权利要求9中所述的羟基化重组胶原蛋白的组合物。
12.一种通过将权利要求9中所述的羟基化重组胶原蛋白交联得到的交联蛋白制品。
13.如权利要求9中所述的羟基化重组胶原蛋白或者如权利要求11中所述的组合物或者如权利要求12中所述的交联蛋白制品在制备药物、生物材料、组织材料、医疗器械、化妆品或保健品中的应用。
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