CN105779296B - 一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，包括以下步骤：步骤一、PCR扩增海洋球石藻病毒EhV99B1丝氨酸棕榈酰转移酶；步骤二、重组质粒pMD19‑T‑SPT的制备：PCR电泳产物经DNA回收试剂盒回收后，进行T‑A克隆，所用载体为pMD19‑T，并转化到大肠杆菌Top10感受态细胞；步骤三、重组子pEhux‑SPT的制备：重组质粒pMD19‑T‑SPT以Hind III单酶切获得2613bp的目的基因片段，与经Hind III单酶切的载体pEhux‑I连接，并转化大肠杆菌Top10，筛选得到重组子pEhux‑SPT；步骤四、pEhux‑SPT转化球石藻细胞：采用电击转化法将重组质粒pEhux‑SPT与质粒pEhux‑II共转化球石藻BOF92细胞。本发明构建的基因工程海洋球石藻株，通过病毒SPT基因的过表达从而有效提高了藻细胞中神经酰胺的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋微型浮游植物，尤其是涉及一种高产神经酰胺的基因工程海洋球石藻(Emiliania huxleyi)株的构建方法。
背景技术
近年来，微藻基因工程研究取得了许多重要进展，在微藻产品高值化上具有广泛的应用前景。目前，利用基因工程手段将外源基因转入到微藻细胞中已经有所报道，通过对藻类基因工程的研究，可以从改造的藻体中筛选抗性强且生长快的优良藻种，并把藻类作为新型的生物反应器生产某些具有较大经济价值的生物活性物质。在微藻中表达重要的蛋白、多肽甚至次生产物合成酶系，通过分子生物学技术阻断或修饰代谢途径，以创造具有商业价值的工程藻株和开发高价值微藻产品，推动微藻生物技术产业发展。
目前用于转化藻类的常用方法有：
①玻璃珠法，在待转化的藻细胞样品中加入DNA、玻璃珠和聚乙二醇，短暂涡旋震荡，使细胞产生瞬时空洞，从而使得DNA进入细胞内。该方法的优点是不需要昂贵的专业设备、操作简单、重复性好，缺点是需要使用没有细胞壁的藻株或者制备原生质体。由于微藻细胞壁结构组成的复杂性和多样性，大部分藻株很难获得可存活的原生质体，因此玻璃珠法并不适合用于所有微藻的转化。
②农杆菌侵染法，农杆菌是一种土壤寄生菌，具有感染植物细胞的能力。研究表明，该方法也可以用于真核微藻的转化，具有可以转化有完整细胞壁的微藻细胞T-DNA准确插入宿主基因组中、获得稳定转化子的效率较高等优点。
③基因枪法，将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。该方法具有可以同时穿透细胞质膜和细胞器膜，几乎可以用于转化所有的微藻等优点，但是存在设备要求高、价格昂贵等缺点。
④电击法，在适当的外加电场强度和脉冲时间作用下，细胞膜产生瞬间的可逆性小孔，使附着在质膜上的DNA分子进入细胞内，移去外加电压后，膜孔在一定时间内可以自动修复，不影响或很少影响细胞质的生命活动，从而达到转化的效果。该方法的优点有强度适当的电脉冲对DNA和受体细胞损害较小、操作容易控制、流程简单、没有细胞的种属限制、转化效率较高等。其中比较常用是基因枪法和电转化法。通过现代生物技术(如基因工程、发酵工程及酶工程等)强化活性物质代谢途径，提高其产量已成为海洋生物资源领域新的研究热点。
神经酰胺(Ceramide)是一种新型的生物活性物质，对细胞分化、增殖、免疫、凋亡、衰老等生命活动具有重要调节作用；其特有的生理功效使其成为一种附加值高和市场潜力大的活性成分，在医药、食品、化工特别是高档护肤品以及治疗某些皮肤病的药物开发中具有广阔的应用前景。神经酰胺在生物体中以信号传导分子的形式存在，通常含量极低，一般低于细胞总脂类的1％，目前制备神经酰胺的原料主要为玉米、小麦、魔芋、米糠，但生产成本高，价格昂贵，产量不高。天然神经酰胺产量较低是制约神经酰胺功能性产品开发的瓶颈，迫切需要找到一种安全经济的来源和提高神经酰胺产量的途径。
海洋球石藻是一类单细胞的海洋微型浮游植物，在分类学上隶属于定鞭藻门(Haptophyta＝Prymnesiophyta)，定鞭藻纲(Prymnesiophyceae)，广泛分布于世界范围的近海和大洋水域中。自然海域中，病毒感染海洋浮游植物是一种普遍现象；研究发现，球石藻病毒感染宿主后导致宿主细胞的裂解，并伴随神经酰胺的大量合成，因此该藻及其病毒有望开发成为一种新的生产神经酰胺的天然途径。尽管如此，病毒感染通过什么机制(或代谢途径)促使细胞合成大量的神经酰胺，尚不清楚；病毒感染伴随着神经酰胺的合成，神经酰胺是一类中间产物，导致这种天然的合成途径不能无限制地积累，因此通过构建基因工程藻株，人为调控神经酰胺合成代谢途径将有望解决这一难题。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，本案由此产生。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，本发明将球石藻特异性感染病毒基因组中神经酰胺从头合成途径中的第一限速酶即丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)基因克隆至球石藻真核表达载体，通过病毒SPT基因的过表达从而有效提高基因工程藻细胞中神经酰胺的含量。
一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、PCR扩增EhV99B1丝氨酸棕榈酰转移酶(serine palmitoyltransferase，SPT)：
采用CTAB法提取海洋球石藻病毒EhV99B1基因组，PCR扩增所用引物为：SEQIDNO.1：SPT-F:5’-AAGCTTATGTACACGGCCGTATTCA-3’；SEQIDNO.2：SPT-R：5’-AAGCTTCTATGACAGATACTCAATCATAA-3’；
步骤二、重组质粒pMD19-T-SPT的制备：
PCR电泳产物经DNA回收试剂盒回收后，进行T-A克隆，所用载体为pMD19-T，并转化到大肠杆菌Top10感受态细胞；
步骤三、重组子pEhux-SPT的制备：
重组质粒pMD19-T-SPT以Hind III单酶切获得2613bp的目的基因片段，与经HindIII单酶切的载体pEhux-I连接，并转化大肠杆菌Top10，筛选得到重组子pEhux-SPT；
步骤四、pEhux-SPT转化球石藻细胞：
采用电击转化法将重组质粒pEhux-SPT与质粒pEhux-II共转化球石藻细胞，于含1.5％琼脂的F/50固体培养基中添加终浓度为50ug/ml的草铵膦作为固体选择性培养基进行转化子的筛选，然后转入不含琼脂的液体选择性培养基中培养8-12天，收集藻细胞，经PCR验证获得含有病毒SPT基因的球石藻基因工程藻株。
作为实施例的优选方式，所述步骤一中，PCR扩增反应体系为25μl，含1μl模板DNA、0.5μlGXL DNA Polymerase(购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司)、1μl上游引物SEQIDNO.1(10pmol/μl)、1μl下游引物SEQIDNO.2(10pmol/μl)，2μl dNTP、5μl 5×GXL缓冲液，14.5μl无菌水；PCR的反应条件为：98℃ 10s，60℃ 15s，68℃1min，循环30次后加入rTaq DNA聚合酶及10×PCR buffer 72℃延伸10min，保存于4℃。
作为实施例的优选方式，所述步骤二中，将10μl连接产物，所述连接产物含有4μL回收的SPT基因、1μl pMD19-T载体和5μl solutionI连接酶，加入到200μl的大肠杆菌Top10感受态细胞，置冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min；再加入到含有800μl LB培养基的试管中，37℃，150rpm，培养60min；取200μl培养液涂布至Amp板，Amp浓度为10mg/ml，37℃倒置培养过夜，至克隆长出，进行蓝白斑筛选；挑取白色菌落，采用试剂盒小量提取质粒。
本发明建立的高产神经酰胺海洋球石藻株，可以实现神经酰胺的高产，在基因工程球石藻株细胞中神经酰胺的含量达到78.2fg/cel，为新型神经酰胺类物质的产业化应用奠定了基础。
附图说明
图1是本发明中EhV99B1基因组中SPT基因的PCR扩增结果凝胶电泳图；其中M1为DNA Marker(分子量标记)(TaKaRaλ-Hind III digest 23130，9416,6557,4361,2322,2027,564,125)，1为SPT扩增产物，分子量为2613bp；
图2是本发明中pEhux-I质粒的图谱；
图3是本发明中重组pEhux-SPT质粒的构建图谱；其中M1为DNA Marker(分子量标记)(TaKaRaλ-Hind III digest 23130，9416,6557,4361,2322,2027,564,125)，1为pEhux-SPT质粒，2为Hind III单酶切pEhux-I质粒结果，3为插入片段SPT的正反判断结果；
图4是本发明中重组质粒pEhux-SPT单酶切及SPT基因插入方向验证凝胶电泳图；
图5是本发明中pEhux-II质粒的图谱；
图6是本发明中工程藻株(含重组质粒pEhux-SPT)和野生型藻株细胞中神经酰胺含量的比较结果图。
具体实施方式
实施例1
一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、PCR扩增EhV99B1丝氨酸棕榈酰转移酶(serine palmitoyltransferase，SPT)：
采用CTAB法提取海洋球石藻病毒EhV99B1基因组，PCR扩增所用引物为：SEQIDNO.1：SPT-F:5’-AAGCTTATGTACACGGCCGTATTCA-3’；SEQIDNO.2：SPT-R：5’-AAGCTTCTATGACAGATACTCAATCATAA-3’；
PCR反应体系为25μl，含1μl模板DNA、0.5μlGXL DNA Polymerase(购于TaKaRa广州瑞真生物技术有限公司)、1μl上游引物SEQIDNO.1(10pmol/μl)、1μl下游引物SEQIDNO.2(10pmol/μl)，2μl dNTP、5μl 5×GXL缓冲液，14.5μl无菌水；PCR的反应条件为：98℃10s，60℃15s，68℃1min，循环30次后加入rTaq DNA聚合酶及10×PCR buffer 72℃延伸10min，保存于4℃；
SPT的PCR扩增后的产物鉴定：用设计的启动子基因特异性引物SPT-F和SPT-R进行PCR，扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，可见大小约2613bp的特异性扩增片段，与预期大小相符；
步骤二、重组质粒pMD19-T-SPT的制备：
PCR电泳产物经DNA回收试剂盒回收后，进行T-A克隆，所用载体为pMD19-T，并转化到大肠杆菌Top10感受态细胞；
将10μl连接产物，所述连接产物含有4μL回收的SPT基因、1μl pMD19-T载体和5μlsolutionI连接酶，加入到200μl的大肠杆菌Top10感受态细胞，置冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min；再加入到含有800μl LB培养基的试管中，37℃，150rpm，培养60min；取200μl培养液涂布至Amp板，Amp浓度为10mg/ml，37℃倒置培养过夜，至克隆长出，进行蓝白斑筛选；挑取白色菌落，采用试剂盒小量提取质粒；
采用Hind III单酶切后电泳分析并进行测序鉴定，测序结果如序列表1所示，证明启动子序列正确，得到了含有目的基因片段的重组质粒pMD19-T-SPT。
步骤三、重组子pEhux-SPT的制备：
重组质粒pMD19-T-SPT以Hind III单酶切获得2613bp的目的基因片段，与经HindIII单酶切的载体pEhux-I连接，pEhux-I质粒图谱如图2所示，并转化大肠杆菌Top10，筛选得到重组子pEhux-SPT；
重组子pEhux-SPT质粒构建图，如图3所示。该重组质粒酶切结果如图4，其中M1为DNA Marker(分子量标记)(TaKaRaλ-Hind III digest 23130，9416,6557,4361,2322,2027,564,125)，1为pEhux-SPT质粒，2为Hind III单酶切pEhux-I质粒结果，3为插入片段SPT的正反判断结果，即SPT上游引物和FAT2的下游片段进行PCR扩增，如果可以扩增出3200bp大小的片段，说明是正向插入；如果扩增出来没有条带，则说明是反向插入。
步骤四、pEhux-SPT转化球石藻细胞：
采用电击转化法将重组质粒pEhux-SPT与质粒pEhux-II，pEhux-II质粒图谱如图5所示(该质粒作用为便于观察转化效果)共转化球石藻细胞，于含1.5％琼脂的F/50固体改良培养基(如下表1所示)中添加终浓度为50ug/ml的草铵膦作为固体选择性培养基进行转化子的筛选，然后转入不含琼脂的液体选择性培养基中培养8-12天，收集藻细胞，经PCR验证获得含有病毒SPT基因的球石藻基因工程藻株。
表1 f/50改良培养基
实施例2海洋球石藻细胞中神经酰胺含量的测定
分别培养野生型和基因工程球石藻株，一周后收集藻细胞沉淀，加入2mL的裂解液(氯仿：甲醇，1：2)，超声波破碎直至细胞完全裂解。采用Bligh和Dyer法抽提去球石藻细胞的总脂类。向每1mL微藻样品中，依次加入3.75mL裂解液，1.25mL氯仿，1.25mL超纯水，充分混匀；4℃10000rpm离心5min充分分层，收集下相；加入2.25mL的洗涤液(水：氯仿：甲醇＝2.25:1.25:2.5，充分混匀，至分层，取上相)；将下相用氮吹仪吹干，所得沉淀即为海洋球石藻总脂类粗提物。
将提取获得的总脂类粗提物用于神经酰胺含量分析：采用ELSD-HPLC法测定细胞细胞中神经酰胺含量，色谱柱:ZORBZX Eclipse XDB-18，4.6mm×250mm，5μm，流动相:甲醇，柱温:35℃，流速:0.8ml/min，蒸发光散射检测器漂移管的温度：50℃，氮气流速：2.5L/min，检测灵敏度：5；预先用50倍柱体积的流动相平衡色谱柱，将样品稀释至合适的浓度，用0.2μm微孔滤膜过滤于Waters自动进样瓶中，根据设置的色谱参数进样；通过浙大智达N2000色谱工作站软件对数据进行处理；精确称取标准品50μg、100μg、200μg、400μg和800μg溶解于1mL、v/v＝5:1的氯仿/甲醇溶液中，将标准液用0.2μm微孔滤膜过滤于Waters自动进样瓶中，根据设置的色谱参数进样；每个浓度标准液进样3次，对其进样的标准液浓度和出峰面积作双对数曲线绘制标准曲线；采用上述建立起来的蒸发光散射检测器-高效液相色谱法检验提取获得的总粗脂，根据标准曲线换算出每个细胞神经酰胺含量。如图6结果显示，野生型球石藻细胞中神经酰胺含量为35.6fg/cell，而基因工程球石藻株细胞中神经酰胺的含量达到78.2fg/cell，是野生型藻细胞的2.19倍，说明EhV99B1-SPT的过表达显著促进了球石藻细胞中神经酰胺的合成。本发明建立的高产神经酰胺海洋球石藻株为实现新型神经酰胺类物质的产业化应用奠定了基础。
本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、PCR扩增EhV99B1丝氨酸棕榈酰转移酶：
采用CTAB法提取海洋球石藻病毒EhV99B1基因组，PCR扩增所用引物为：SEQ ID NO.1：SPT-F:5’-AAGCTTATGTACACGGCCGTATTCA-3’；SEQ ID NO.2：SPT-R：5’-AAGCTTCTATGACAGATACTCAATCATAA-3’；
步骤二、重组质粒pMD19-T-SPT的制备：
PCR电泳产物经DNA回收试剂盒回收后，进行T-A克隆，所用载体为pMD19-T，并转化到大肠杆菌Top10感受态细胞；
步骤三、重组子pEhux-SPT的制备：
重组质粒pMD19-T-SPT以Hind III单酶切获得2613bp的目的基因片段，与经Hind III单酶切的载体pEhux-I连接，并转化大肠杆菌Top10，筛选得到重组子pEhux-SPT，其中，pEhux-I质粒图谱为：
步骤四、pEhux-SPT转化球石藻细胞：
采用电击转化法将重组质粒pEhux-SPT与质粒pEhux-II共转化球石藻细胞，于含1.5％琼脂的F/50固体培养基中添加终浓度为50ug/ml的草铵膦作为固体选择性培养基进行转化子的筛选，然后转入不含琼脂的液体选择性培养基中培养8-12天，收集藻细胞，经PCR验证获得含有病毒SPT基因的球石藻基因工程藻株。
2.如权利要求1所述的一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，所述PCR扩增反应体系为25μl，含1μl模板DNA、0.5μl GXL DNA Polymerase、1μl上游引物SEQ ID NO.110pmol/μl、1μl下游引物SEQ ID NO.210pmol/μl，2μl dNTP、5μl5×GXL缓冲液，14.5μl无菌水；PCR的反应条件为：98℃10s，60℃15s，68℃1min，循环30次后加入rTaq DNA聚合酶及10×PCR buffer72℃延伸10min，保存于4℃。
3.如权利要求1所述的一种高产神经酰胺基因工程海洋球石藻株的构建方法，其特征在于：所述步骤二中，将10μl连接产物，所述连接产物含有4μL回收的SPT基因、1μl pMD19-T载体和5μl solutionI连接酶，加入到200μl的大肠杆菌Top10感受态细胞，置冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min；再加入到含有800μl LB培养基的试管中，37℃，150rpm，培养60min；取200μl培养液涂布至Amp板，Amp浓度为10mg/ml，37℃倒置培养过夜，至克隆长出，进行蓝白斑筛选；挑取白色菌落，采用试剂盒小量提取质粒。
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| 三角褐指藻( Phaeodactylum tricornutum)通用转化载体的构建;郑国庭 等;《生物学杂志》;20120831;第29卷(第4期);第2.1.5节、第2.1.5.8节、第2.2.1节、第2.3.2节最后一段 |
| 海洋球石藻病毒（Coccolithovirus）丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）基因克隆、表达及其与宿主神经酰胺合成之间的关系;刘旭宏;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20140215;第8页右栏第1段和图4、第1.2-1.3节 |
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