CN102533574A - 一种低产尿素黄酒酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过“自克隆”手段构建低产尿素黄酒酵母工程菌及其构建方法。本发明的工程菌中精氨酸酶基因(CAR1)被破坏，从而降低黄酒酵母对精氨酸的代谢，减少黄酒醪液中尿素的含量，进而降低黄酒中氨基甲酸乙酯(EC)的含量。采用本基因工程菌发酵后，尿素含量可降低73％，氨基甲酸乙酯含量也会大幅降低。

Description

一种低产尿素黄酒酵母工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及发酵和生物技术领域。涉及一种低产尿素黄酒酵母工程菌的构建方法，采用“自克隆”技术，不属于转基因范畴，具有工业应用前景。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，以下简称EC)是被国际癌症研究机构(IARC)确认的人类可能致癌物质(2A类)；美国国家毒理计划早已将其列入“有理由预料引起癌症的物质”名单。EC广泛存在于发酵食品(酱油、乳酪、酸牛奶等)与酒精饮料(各种蒸馏酒与酿造酒)中，对消费者是造成极大威胁。目前，世界各国非常重视EC的研究与控制。1985年加拿大政府的卫生与福利组织规定了各类酒中EC的限量标准：佐餐葡萄酒30μg/L，强化葡萄酒100μg/L，蒸馏酒150μg/L，水果白兰地400μg/L，日本清酒100μg/L。1987年美国FDA也规定了EC的限量标准：佐餐葡萄酒15μg/L，强化葡萄酒60μg/L。2002年联合国粮农组织规定葡萄酒中EC含量不得超过20μg/L。黄酒是我国的特产，国外对黄酒的限量标准参照日本清酒，即100μg/L。受多方面因素影响，目前我国仍没有制定有关EC的限量标准，黄酒、葡萄酒等发酵酒中EC含量问题非常突出。

黄酒中的EC主要来源于尿素与乙醇的自发反应而形成，其生成量受尿素的浓度、乙醇含量、反应温度、反应时间和pH值等因素影响。黄酒中的尿素主要是在发酵过程中由酵母菌代谢所产生。酵母菌细胞内精氨酸经精氨酸酶(CAR1)催化，水解生成EC的前体物质——尿素和鸟氨酸。酵母菌在生长繁殖和进行酒精发酵时，合成的大量尿素除了满足自身菌体需要外，多余的尿素被分泌到体外，进入发酵醪液与乙醇自发反应形成EC。

目前，控制与降低黄酒中EC含量的措施有：(1)适当调整工艺参数，比如降低煎酒温度以及缩短煎酒时间等。傅建伟等申请的发明专利(专利号：CN102161956A)通过改变黄酒酿造工艺在一定程度上降低了黄酒中尿素的含量。(2)添加酸性脲酶至压榨后的酒中以去除尿素，进而减少EC的形成量。周建弟等研究了利用酸性脲酶降低黄酒中尿素含量的条件，在一定条件下可以降低黄酒中约80％的尿素。(3)进行酵母菌株改良育种以筛选得到低产甚至不产生尿素的酵母菌株，进而大幅度减少EC的形成量。王德良等申请的发明专利(专利号：CN101550401)采用化学诱变的方法进行了低产尿素黄酒酵母的筛选，产尿素量降低了50％左右。对黄酒而言，前两项措施虽然有一定效果，但都不显著。而且，改变煎酒温度和时间会给黄酒带来生物稳定性风险，并影响成品酒的风味；酸性脲酶依赖从日本进口，价格昂贵，而且会增加染菌风险；采用诱变的方法进行菌株选育，工作量大，筛选结果不可预见，而且诱变后菌株自身的安全性不可控制。应用基因工程手段构建出具有生物安全性的食品级低产或不产尿素黄酒酵母工程菌进行黄酒生产，可以从根本上解决黄酒中的EC问题。

通过自身克隆技术构建酵母工程菌，目的基因来源于出发菌株自身，不引入任何外源DNA片段，因此不属于转基因范畴，这种酵母工程菌更容易被企业和消费者接受，有实际应用前景。“自克隆”技术由于具有生物安全的优点，目前已成为对工业微生物，尤其食品微生物进行遗传改良的首选技术，该技术在选育优良性能啤酒酵母和葡萄酒酵母方面已经取得了明显的成效。2006年1月，美国食品药品管理局(FDAUSA)和加拿大健康署(Health Canada)已批准1株利用“自克隆”手段构建的低产尿素工业葡萄酒酵母(商品名wine yeast ECMo01)应用于工业化葡萄酒生产。使用该工程酵母生产的霞多丽葡萄酒中的EC含量较出发菌株下降了89.1％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是采用“自克隆”技术构建低产尿素的黄酒酵母工程菌，以期为工业上解决黄酒中氨基甲酸乙酯含量偏高问题提供有效的参考方法。酿酒酵母CUP1基因编码铜金属硫蛋白，在酵母细胞中参与过量铜的解毒作用。每个野生型二倍体酵母基因组中含有2个CUP1基因，酵母只能在Cu²⁺小于3mM的培养基中生长；而重组转化子增加了CUP1基因的拷贝数，能在Cu²⁺为3-7mM的培养基中生长。本发明利用CUP1基因，通过“自克隆”技术破坏黄酒酵母精氨酸酶基因(CAR1)，构建低产甚至不产尿素的黄酒酵母，以达到显著降低黄酒中EC形成的目的。

本发明构建低产尿素黄酒酵母工程菌的方法由以下步骤组成：

(1)黄酒酵母CAR1基因及CUP1基因的获取

在Internet公开的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)标准菌株基因组序列数据库

(http://www.yeastgenome.org/)中，查找CAR1基因和CUP1基因序列，设计合适的引物

(CAR1-a：TACCGATGATTCTGAGAAGAAAGAAG；CAR1-b：

GAATTTATTGGGGATTGTATCTGCTG；CUP1-a：

TCAGGAAGATCTATACGTGCATATGTTCATGTATG；CUP1-b：

ACTGAGAGATCTTGATCTGTTGTACTATCCGCTTC)，以黄酒酵母基因组DNA为模板，分别PCR扩增出CAR1基因和CUP1基因。进一步通过亚克隆入T载体(Takara，日本)及DNA测序实验验证了所获基因的正确性。所述黄酒酵母来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 30395。

(2)CAR1-CUP1-CAR1同源重组基因盒的构建

利用DNA限制性内切酶BglII以及DNAT4连接酶，以CUP1和CAR1基因为分子操作对象，首先将CAR1基因T克隆入pMD18-T simple载体，构建出pMD18-T simple-CAR1质粒，然后通过BglII酶切及连接酶连接，将CUP1基因亚克隆入pMD18-T simple-CAR1质粒，构建出pMD18-T simple-CAR1-CUP1-CAR1质粒。在CUP1基因上下游的CAR1基因同源臂内分别设计引物，获得含有CUP1基因并带有CAR1侧翼序列的基因盒。构建的基因盒经PCR和测序验证，CUP1两侧同源臂的长度分别为557bp和569bp。

(3)低产尿素黄酒酵母工程菌的构建及筛选

用步骤(2)获得的线形CAR1-CUP1-CAR1基因盒转化出发菌株，以含5mM硫酸铜的选择培养基平板筛选转化子并通过PCR及测序进行验证。具体操作是利用PCR及乙醇沉淀法制备CAR1-CUP1-CAR1线形基因盒，利用酵母感受态制备试剂盒制备感受态细胞，采用醋酸锂转化法将线形基因盒转化入出发菌株感受态细胞内，使其在酵母基因组中CAR1位点发生同源重组，以含5mM硫酸铜的选择性培养基平板筛选重组转化子。在CAR1基因位点上游和下游设计引物，对转化子进行PCR鉴定。野生型CAR1基因位点基因序列长度为2914bp，CAR1基因被破坏后基因序列长度为3182bp。

为验证本发明构建的黄酒酵母工程菌，以筛选获得的CAR1基因敲除的工程菌为研究对象，以出发菌株为对照，分别考察其胞内精氨酸酶活力、产尿素水平、综合发酵性能及遗传稳定性。

附图说明

图1为PCR扩增CUP1和CAR1基因的琼脂糖凝胶电泳结果，A为CUP1基因(1008bp)，B为CAR1基因(2578bp)；M为DNA分子量标准，1和2均为平行样品。

图2为黄酒酵母转化子PCR鉴定结果。M为DNA分子量标准，K1-K6为酵母转化子的PCR鉴定结果。

具体实施方法

实施例1酵母基因组DNA提取

取1份经过培养的干样品(0.01g)，用真菌DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，详细步骤参照说明书。得到的粗DNA用核酸蛋白定量仪检测后存于-20℃备用。

实施例2CUP1基因及CAR1基因的获得

分别合成扩增CUP1基因和CAR1基因的引物，见下表：

25μL反应体系包括：模板DNA 0.5μL，引物各0.4μM，dNTPs 0.2mM，rTaq酶2.5U，Tris-HCl(pH 8.3)10mM，KCl 50mM，MgCl₂1.5mM，ddH₂O补足25μL。

反应程序分别为：

CAR1基因：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃2min30s，30个循环；72℃5min。CUP1基因：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。PCR扩增结果如图1所示，图中A：CUP1基因；B：CAR1基因。

实施例3CAR1-CUP1-CAR1基因盒的构建

同源重组基因盒的构建包括以下步骤：

(1)pMD8-T simple-CAR1质粒的构建

a扩增出CAR1基因，方法同实施案例2，电泳检测并回收纯化，得到的基因用核酸蛋白定量仪检测后用于T克隆。

b制备大肠杆菌Top10感受态细胞：将过夜培养的大肠杆菌按1∶100接入液体LB培养基再次活化2.5h；加1mL活化好的菌液于1.5mL离心管，4℃10000rpm离心1min；加入900μL0.1mol/LCaCl₂充分混匀，4℃10000rpm离心1min；加入100μL0.1mol/LCaCl₂充分混匀，冰浴，备用。

c在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为10μL。

16℃反应4h；反应结束后全量加入100μLTop10感受态细胞中，冰浴放置30min；42℃热击90s后，再冰浴3-5min；加入1mL预热的LB液体培养基，37℃振荡60min；在含有Amp的平板上培养，形成单菌落；挑取单菌落，使用PCR方法确认插入片段的长度大小；将鉴定正确的转化子送上海生工生物工程有限公司测序。

(2)pMD18-T simple-CAR1-CUP1-CAR1质粒的构建

a扩增CUP1基因方法同实施案例2，提取pMD18-T simple-CAR1质粒，使用上海生工生物工程有限公司的质粒小量抽提试剂盒进行提取。

b获得的CUP1基因和质粒纯化后使用BglII酶进行酶切，酶切体系如下：

CUP1基因酶切体系：

载体酶切体系：

37℃反应4h，将酶切产物纯化。

c载体酶切纯化后，进行去磷酸化处理，使用割胶回收试剂盒切胶回收。

d连接反应体：CUP1基因14μL；载体2μL；10×T4DNALigase buffer 2.5μL；T4DNA ligase1μL；up to 25μL。16℃反应过夜。

e转化制备好的感受态细胞，在含有Amp的平板上培养，PCR鉴定单菌落。将PCR鉴定正确的转化子送上海生工生物工程有限公司进行测序。

实施例4菌株转化实验

设计引物扩增出待转化的基因盒，转化黄酒酵母。转化方法采用LiAC/ss-Carrier DNA/PEG化学方法，包括以下步骤：

(1)将酵母接入YPD培养基中，过夜摇床培养至细胞达到1-2×10⁸/mL。

(2)用新鲜预热的培养基稀释细胞至2-5×10⁶/mL，再次培养细胞进行两次分裂约4h，此时细胞浓度达到2×10⁷/mL。

(3)离心收集酵母细胞，用无菌水洗涤两次。

(4)将细胞悬浮于TE/LiAC溶液中，30℃静置培养15min。

(5)取100μL上述步骤制备好的感受态，加入线性DNA(100ng/5μL)、鲑鱼精DNA(50μg/5μL)、PEG/TE/LiAC(300μL)并充分混匀。

(6)将混合物于30℃下静置培养30min。

(7)42℃热击20min，结束后离心15s，去除PEG混合液。

(8)将细胞悬浮在无菌水中，涂布含有5mM硫酸铜的选择性培养基。

(9)30℃培养3-4天至长出单菌落，挑取单菌落进行PCR鉴定。

获得的基因盒，转化酵母后得到的黄酒酵母工程菌的鉴定结果如图2所示。

实施例5工程菌株与出发菌株的小型发酵试验比较两者尿素含量

利用大米醪培养液(浓度14°Bx)以工程菌株和出发菌株分别进行小试规模黄酒发酵，利用尿素检测试剂盒检测两者发酵液中尿素的含量，发现工程菌株相较出发菌株尿素含量不超过出发菌株的三分之一(为8.26mg/L)；利用固相微萃取和气质联用(SPME-GC-MS)法检测两者酒液中EC含量，发现工程菌株相较出发菌株有大幅下降(64.2μg/L)。实验结果表明构建的工程菌株具有明显的低产尿素效果，利用其发酵生产的黄酒EC含量低，而且对黄酒的风味基本无影响，具有实际工业应用潜力。

虽然本发明已以较佳实例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种低产尿素黄酒酵母工程菌，其特征在于其基因组中精氨酸酶基因中插入自身的CUP基因。

2.权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于所述黄酒酵母为野生型二倍体菌株。

3.权利要求1所述黄酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于以黄酒酵母基因组DNA为模板，扩增出CUP1和CAR1基因，构建出CAR1-CUP1-CAR1基因盒，转化黄酒酵母，获得不含外源基因的黄酒酵母工程菌。

4.权利要求1所述黄酒酵母工程菌应用于降低黄酒致癌物氨基甲酸乙酯的含量。

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