CN104711284B - 转ssu1基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法及鉴定方法，属于培育酵母新菌株的方法。本发明包括：提取和纯化葡萄汁酵母DNA：构建SSU1基因表达载体；葡萄汁酵母转基因；葡萄汁酵母菌株耐硫性测定；PCR筛选转化子；PCR产物测序：灭菌后的含硫葡萄汁发酵试验等。测序表明：候选转化子中均含有转基因特征序列。试验表明：转化子ACY330‑SSU1和A4‑SSU1均能在含15 mg/L亚硫酸钠的基质中很好的发酵。本发明获得了葡萄汁酵母耐硫转基因后代菌株，转化子菌株鉴定的准确率极高。

Description

转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法及鉴定方法

技术领域

本发明属于酵母育种及鉴定方法。

背景技术

在葡萄酒的生产过程中，需要多种抗氧化剂的作用，才能抑制细菌的生长，从而保证葡萄酒的品质与风味。二氧化硫作为最常见的一种抗氧化剂广泛用于酿酒工艺中。然而，酿酒中过高浓度的二氧化硫酸根离子与葡萄产生的游离金属离子结合会形成亚硫酸盐，亚硫酸盐不仅会直接破坏细胞的组织结构，而且还会与一些酶或代谢产物结合，阻碍细胞的正常代谢活动。所以，亚硫酸盐的耐受能力也成为筛选酿酒菌株的重要指标之一。

前人研究表明，在酿酒酵母硫代谢过程中，与耐硫相关的基因SSU1在细胞调节中可作为“硫泵”，从而“提高”酿酒酵母的硫耐受性。这是因为，SSU1基因编码的亚硫酸盐转运蛋白会调节酵母细胞的亚硫酸盐代谢，将对细胞具有毒害作用的亚硫酸盐泵出细胞外，过量的亚硫酸盐可以通过亚硫酸盐转运蛋白运输到细胞外，保证细胞正常生命活动；同时，把过量的亚硫酸盐泵出细胞外也提高了芳香物质硫醇在所酿造的酒种中的含量，形成了酿酒过程中酒品的特殊风味，最终达到提高酒的品质的目的。

葡萄汁酵母与酿酒酵母均属于狭义酿酒酵母属，二者在各性状上极为相似，在“长相思”等酒种酿酒工艺后期，葡萄汁酵母在无氧呼吸产生酒精方面具有更为重要的作用。因而，将过量的亚硫酸盐运输到细胞外，有助于提高葡萄汁酵母的硫耐受性，达到保证细胞正常生命活动；另一方面，提高芳香物质在葡萄酒中的含量等目的，也同样取决于调节酵母细胞的亚硫酸盐代谢。但是，在葡萄汁酵母中，与耐硫相关基因SSU1鲜有报道。

发明内容

本发明旨在以耐硫葡萄汁酵母菌株的SSU1基因为耐硫亲本与其它葡萄汁酵母菌株进行杂交，培育葡萄汁酵母耐硫新菌株，并提供一种转SSU1基因的耐硫葡萄汁酵母转化子的鉴定方法，从而提出一种快速有效地培育葡萄汁酵母耐硫新菌株及有效筛选转化子的鉴定方法。

本发明以上目的通过以下方法实现：

一、转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法

包括以下步骤：

（1）在YPD培养基中培养葡萄汁酵母以扩增细胞，收集该细胞于离心管后破碎，释放内含物，收集DNA；所述YPD培养基是含10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、 20 g/L琼脂、20g/L葡萄糖的固体培养基；

（2）构建葡萄汁酵母SSU1基因表达载体：

以耐硫菌株A9的DNA为模板，扩增SSU1基因，引物为

L1: GCA GGA TCC GCT TAT TTT GCT CAA TTT TCT T；

R1: CAG GTC GAC AAG CCA GTG TTA GCC CAA TC。

用Bam H I和Sal I对PCR产物进行酶切，引物下划线部分为Bam H I的酶切位点和Sal I的酶切位点，其产物与同样经Bam H I和Sal I双酶切的表达载体YEp352连接，构建重组质粒，再将重组质粒电击转化至大肠杆菌DH5α中成为转化子1；

（3）目的基因转化葡萄汁酵母：

制备葡萄汁酵母感受态细胞；在LB培养基中扩大培养转化子1，提取重组质粒；将感受态葡萄汁酵母细胞与重组质粒按体积比（8～10）：1混匀于电击杯中电击，室温静置后加入少量YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h，构建成为目的基因转化葡萄汁酵母的转化子2，即葡萄汁酵母感受态细胞；

所述LB培养基是含胰化蛋白胨 10g/L 酵母提取物 5g/L NaCl 10g/L的液体培养基；YEP培养基是含10g/L牛肉浸膏、10g/L酵母粉、5g/L NaCl，PH为7.0的液体培养基；

（4）培养葡萄汁酵母耐硫菌株：

将步骤（3）的转化子2和葡萄汁酵母菌株接种于新鲜的含15mg/L亚硫酸钠的YPD培养基上培养葡萄汁酵母耐硫菌株，该YPD培养基的pH3.5，且含80mM琥珀酸盐。

优选的，所述的提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法是：将步骤（1）所收集的葡萄汁酵母DNA在Agrose胶上电泳，通过紫外检测估算被测葡萄汁酵母DNA的分子量和浓度。

优选的，所述的提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法是：随机挑选步骤（2）的大肠杆菌DH5α转化子进行PCR分析，测序验证转化子1。

二、转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫菌株能力的鉴定方法

随机挑选步骤（3）接种于YPD培养基上的目的基因转化葡萄汁酵母的转化子2，以SSU1为基因扩增引物，组成PCR反应体系，经反应分析鉴定PCR产物；鉴定结果：转化子2只产生一条大小为1712bp的条带；而非转化子不能产生特征条带。

所述的鉴定方法进一步是：

在50mL的锥形瓶中加入30mL的DMDC灭菌且含15mg/L亚硫酸钠的全汁葡萄汁，再按每毫升葡萄汁中加入步骤（4）葡萄汁酵母耐硫菌株的2.5×10⁶个细胞，在温度30℃，摇床转速为100 rpm发酵；鉴定结果：转化子2能在灭菌后的含硫葡萄汁中正常发酵，而非转化子则无法正常发酵；

上述DMDC为3,3-二甲基-4,4-二氨基二环己基甲烷，终浓度为200mg/L。

本发明具有的显著进步和实质性特征是：

本发明以耐硫菌株A9的SSU1基因作为外源基因进行转化，进而从不耐硫葡萄汁酵母菌株ACY330和A4转SSU1基因后代中，在含15 mg/L亚硫酸钠的培养基上各随机挑选5个转化子进行PCR分析，PCR产物测序结果表明：10个候选转化子中均含有转基因特征带，该产物正是导入的目的基因，并非是假阳性产物。进一步，将ACY330转化子、A4的转化子ACY330-SSU1和A4-SSU1和优良酿酒酵母EC1118菌株等进行灭菌后的含15 mg/L亚硫酸钠葡萄汁的小规模发酵试验。结果表明：这些转化子均能在含15 mg/L亚硫酸钠的基质中很好的发酵，成功地培育了新的葡萄汁酵母耐硫菌株。

为此，在本发明中，我们利用了不耐硫亲本基因组DNA中所不包含耐硫菌株A9的SSU1基因特异序列作为标记用于选择转化子，结合含硫培养基培养及灭菌后的含硫葡萄汁中发酵进行筛选，获得了转基因的耐硫葡萄汁酵母菌株，这也是在文献报道中首次用转SSU1基因的方式培育葡萄汁酵母耐硫菌株的报道。

该发明的进步还在于：勿需昂贵而复杂的Southern Blot、 Northern Blot等实验，而只需进行常规的表型平板筛选、PCR、DNA序列测定和小规模发酵，区分转化子与非转化子，可获得真正的转化子以及葡萄汁酵母耐硫转基因后代菌株。这种在分子水平上以DNA序列结合含硫培养基培养及灭菌后的含硫葡萄汁发酵进行筛选的鉴定方法，显著地提高了转化子鉴定的准确率，为选育在酿酒过程中耐硫逆境的酵母以及利用打下了良好的基础。

本发明属于国家自然科学基金项目（项目编号：31360404）及教育部归国人员启动基金项目（项目编号：212209）的资助项目。

附图说明

图1是耐硫亲本A9的SSU1基因序列和氨基酸序列。

图2 是SSU1基因表达载体构建。

图3是用SSU1引物筛选转化子。图中，M为1Kb plus ladder， Invitrogen； 1为耐硫葡萄汁酵母菌株ACY338－SSU1⁺；2为耐硫葡萄汁酵母菌株A4－SSU1⁺；3为耐硫葡萄汁酵母菌株A9；4为非耐硫葡萄汁酵母菌株A4；5为非耐硫葡萄汁酵母菌株ACY338。

图4是葡萄汁酵母菌株及转化子耐硫性测定。

图5是灭菌后的含硫葡萄汁小规模发酵结果。纵标：每24小时测量的发酵减轻的重量，单位g。横标：小时，单位h。

以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明，具体实施方式的实例包括但并不限于所指出的内容。

具体实施方式

材料：非耐硫葡萄汁酵母菌株为ACY338、A4，耐硫葡萄汁酵母菌株为A9，对照酿酒酵母菌株为EC1118，以上菌株均引自新西兰奥克兰大学（引入人:张汉尧,2010年），大肠杆菌DH5α，以上菌株均保存于本实验室。葡萄汁酵母菌株可向奥克兰大学Richard Gardner教授索要。联系方式如下：

Wine Science Programme, School of Biological Sciences, University ofAuckland, Private Bag 92019, Auckland, New Zealand

试剂：引物由上海生物工程公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTPs、RNase购自上海生物工程公司； DNA Marker为1Kb plus ladder，购自 Invitrogen；酵母基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司其他常规试剂为国产分析纯产品。

一、转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫菌株能力

（1）提取和纯化贝酵母DNA：

在YPD培养基中分别培养非耐硫葡萄汁酵母菌株ACY338、A4，以扩增其细胞，收集细胞于离心管，使细胞破碎，释放内含物，使DNA与蛋白质等分离，收集DNA。

其中，YPD培养基是含10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、 20 g/L琼脂、20g/L葡萄糖的固体培养基。

以上步骤（1）对所收集的DNA可以进一步置放在Agrose胶上电泳，以紫外检测仪与标准分子量相比较估算被测DNA的分子量和浓度。

（2）构建葡萄汁酵母SSU1基因表达载体：

以耐硫菌株A9的DNA为模板，扩增SSU1基因，引物为

L1: GCA GGA TCC GCT TAT TTT GCT CAA TTT TCT T；

R1: CAG GTC GAC AAG CCA GTG TTA GCC CAA TC。

注：引物下划线部分分别为BamH I的酶切位点和Sal I的酶切位点。

用BamH I和Sal I对PCR产物进行酶切，产物与同样经BamH I和Sal I双酶切的表达载体YEp352连接，成功构建重组质粒（图2）。用电击转化至大肠杆菌DH5α中，构建含葡萄汁酵母SSU1基因的表达载体，即转化子1。

进一步，将以上步骤（2）用PCR扩增目标基因及测序方法验证转化子1。

（3）葡萄汁酵母转基因：

将感受态葡萄汁酵母细胞与重组质粒在电击杯中按体积比10：1混匀后电击，再室温静置，加入少量YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h，含硫的YPD培养基平板上挑选转化子2。其中，YEP培养基是含10g/L牛肉浸膏、10g/L酵母粉、5g/L NaCl，pH为7.0的液体培养基。

（4）葡萄汁酵母菌株及转化子耐硫性测定：

将不同菌株接种于新鲜的含15mg/L亚硫酸钠的YPD培养基上，该YPD培养基的pH3.5，且含琥珀酸盐，在该YPD培养基上能长起来的为耐硫菌株，不能长起来的为非耐硫菌株。

此外，转化子2 能在耐硫培养基上正常生长，且能在灭菌后的含硫葡萄汁中正常发酵，与优良酿酒酵母菌株EC1118及耐硫葡萄汁酵母菌株A9的发酵能力相差无几，而非转化子则无法正常生长或正常发酵（如图4、5）。

二、转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫菌株能力的鉴定方法

1、以PCR扩增目标基因验证转化子2鉴定葡萄汁酵母耐硫菌株

从不耐硫葡萄汁酵母菌株ACY330和A4转SSU1基因后代中，在含15 mg/L亚硫酸钠的培养基上各随机挑选5个转化子2，共计10个候选转化子 2 进行PCR分析。步骤还包括：

（1）组成PCR反应体系（单位：微升）配方：

2.5 微升 10×PCR buffer (包含 Mg²⁺),

1 微升的 10 mM 前导链引物

1 微升的 10 mM 后导链引物

0.5 微升的10 mM 10 mM dGTP、dATP、dCTP和dCTP

0.2 微升的5U/μL Taq DNA 聚合酶

2 微升 模板DNA

17.8微升 dH₂O

上述PCR反应体系以SSU1为基因扩增引物：L1: GCT TAT TTT GCT CAA TTT TCTT；R1:AAG CCA GTG TTA GCC CAA TC。

（2）PCR反应程序：

①95℃5分钟；②95℃解链30钞；③54℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④35个循环；⑥72℃延伸7分钟。

（3）PCR产物用凝胶成像系统观察结果：

经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5 μg·mL^-1的溴化乙锭，电压为3～5V/cm，照像记录；

（4）PCR产物测序：

获得的序列用Vector NTI软件转化成FASTA格式，并用BLAST与NBCI数据库中的序列进行比对。

葡萄汁酵母菌株及转化子的SSU1基因PCR鉴定结果：10个候选转化子2均含有转基因特征带，且只产生一条大小为1712bp的条带，非转化子不能产生特征条带（见图3）。

2、以灭菌后含硫葡萄汁小规模发酵试验鉴定葡萄汁酵母耐硫菌株

在50mL的锥形瓶中加入30mL的DMDC灭菌全汁葡萄汁，并按15mg/L 加入亚硫酸钠；再在每毫升葡萄汁中加入2.5×10⁶个葡萄汁酵母细胞；温度设置为30℃，摇床转速为100rpm ；发酵进程通过每24小时测量一次其减轻的重量而进行监测；设置一个不加任何酵母细胞的空白对照，及一个加酿酒酵母EC1118细胞的对照。上述DMDC为3,3-二甲基-4,4-二氨基二环己基甲烷，终浓度为200mg/L。各菌株在含硫葡萄汁中小规模发酵的结果如图5所示。

Claims (4)

1.转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法，包括以下步骤：

（1）在YPD培养基中培养葡萄汁酵母以扩增细胞，收集该细胞于离心管后破碎，释放内含物，收集DNA；

所述YPD培养基是含10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、 20 g/L琼脂、20g/L葡萄糖的固体培养基；

（2）构建葡萄汁酵母SSU1基因表达载体：

以耐硫菌株A9的DNA为模板，扩增SSU1基因，引物为

L1: GCA GGA TCC GCT TAT TTT GCT CAA TTT TCT T；

R1: CAG GTC GAC AAG CCA GTG TTA GCC CAA TC；

用Bam H I和Sal I对PCR产物进行酶切，引物下划线部分为Bam H I的酶切位点和Sal I的酶切位点，其产物与同样经Bam H I和Sal I双酶切的表达载体YEp352连接，构建重组质粒，再将重组质粒电击转化至大肠杆菌DH5α中成为转化子1；

进一步，随机挑选步骤（2）的大肠杆菌DH5α转化子进行PCR分析，测序验证转化子1；

（3）目的基因转化葡萄汁酵母：

制备葡萄汁酵母感受态细胞；在LB培养基中扩大培养转化子1，提取重组质粒；将葡萄汁酵母感受态细胞与重组质粒按体积比（8～10）：1混匀于电击杯中电击，室温静置后加入少量YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h，构建成为目的基因转化葡萄汁酵母的转化子2；

所述LB培养基是含胰化蛋白胨 10g/L 酵母提取物 5g/L NaCl 10g/L的液体培养基；YEP培养基是含10g/L牛肉浸膏、10g/L酵母粉、5g/L NaCl，PH为7.0的液体培养基；

（4）培养葡萄汁酵母耐硫菌株：

将步骤（3）的转化子2和葡萄汁酵母菌株接种于新鲜的含15mg/L亚硫酸钠的YPD培养基上培养葡萄汁酵母耐硫菌株，该YPD培养基的pH3.5，且含80mM琥珀酸盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征进一步包括：将步骤（1）所收集的葡萄汁酵母DNA在Agrose胶上电泳，通过紫外检测估算被测葡萄汁酵母DNA的分子量和浓度。

3.一种鉴定方法，其特征是：随机挑选权利要求1或权利要求2之中所述的转化子2，以SSU1基因扩增引物，经反应分析鉴定PCR产物；鉴定结果：转化子2只产生一条大小为1712bp的条带；而非转化子不能产生特征条带。

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征进一步是：在50mL的锥形瓶中加入30mL的DMDC灭菌且含15mg/L亚硫酸钠的全汁葡萄汁，再按每毫升葡萄汁中加入步骤（4）葡萄汁酵母耐硫菌株的2.5×10⁶个细胞，在温度30℃，摇床转速为100 rpm发酵；鉴定结果：转化子2能在灭菌后的含硫葡萄汁中正常发酵，而非转化子则无法正常发酵；

上述DMDC为3,3-二甲基-4,4-二氨基二环己基甲烷，终浓度为200mg/L。