CN104531718A - 苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用，从苹果中分离到了MdVHA-B1基因，然后通过两轮PCR搭桥的方法将396位置处的丝氨酸残基突变为丙氨酸得到MdVHA-B1S396A基因；该基因在苹果王林愈伤中过量表达能进一步提高转基因苹果愈伤的表达水平，同时进一步增强转基因苹果愈伤的抗盐等逆境能力。

Description

苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用

一、技术领域

本发明涉及一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用，具体涉及一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A的载体构建及其转基因苹果愈伤在抗盐逆境方面的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

植物一生中经常遭受各种不良环境和病虫害的侵袭，在长期的适应与进化过程中，植物形成了一系列防御反应机制，用来抵抗不良环境的伤害。其中，环境胁迫主要包括各种生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫主要来自昆虫、食草动物、植物病菌等；非生物胁迫种类众多，包括干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等胁迫。为了适应繁杂多变的环境，减少不利环境对机体的伤害，植物体内演化出了涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。

苹果是世界性果品，是温带地区的主要栽培树种。其适应能力较强，果品营养价值较高，耐贮性好，供应周期长，世界上很多国家都将其列为主要消费果品而大力支持。但是在苹果的生长发育过程中，许多非生物胁迫是影响苹果地理分布和产量提高的主要限制因子，尤其是高盐、干旱和低温等，世界苹果生产国都把选育抗盐、抗旱、抗寒等优质苹果新品种作为主要育种目标。由于苹果是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。而苹果愈伤组织是研究植物生长、分化、发育及抗性生理等良好的实验体系，也是植物种质离体保存、细胞工程材料创建以及遗传转化体系建立等重要工作的基础。并且近年来，随着苹果基因组的测序(Velasco等，2010)的完成、以及迅速发展的现代生物技术为解决这些问题开辟了新途径，通过基因工程技术有目的提高果树抗盐、抗旱、抗寒能力，成为果树遗传改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分离和鉴定则为基因工程遗传改良提供了目的基因。

V-ATPase普遍存在于真核细胞中不同内酸性细胞器膜上。它是由两个亚复合体组成的多亚基酶：外部的V1复合体主要负责ATP水解，膜内嵌的V0复合体主要负责质子转运(Gaxiola等,2007)。V-ATPase活性主要取决于复合体的可逆组装和V-ATPase亚基基因的动态表达(Kane,2012；Liberman等,2013)。编码这些V-ATPase亚基的基因被确定与V-ATPase活性正相关，在植物(或细胞)生长发育及对非生物胁迫的响应中发挥至关重要的作用(Gaxiola等,2007；Silva和Gerós,2009；Hu等，2012)。在拟南芥和苹果中，V1亚基VHA-B存在三种亚型(为VHA-B1，VHA-B2和VHA-B3所编码)具有序列和功能上的差异(Gaxiola等,2007)。

目前对V-ATPase亚基基因的研究主要集中在拟南芥、水稻，小麦上等少数模式植物上，而在果树方面研究较少。由于诸多方面的原因，可耕土地面积越来越少，再加上低温、干旱、土壤盐渍化和病、虫害导致果树的种植面积和范围受到严重影响。因此挖掘苹果V-ATPase亚基基因并进行功能研究，为果树抗逆转基因育种提供潜在的有效候选基因，不但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。苹果转基因育种多在苹果砧木上进行，而苹果砧木主要生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。

随着人们对苹果品质的要求越来越高，品种的改良问题成为科研工作者的一项重要任务，因此苹果育种在世界各国果树研究工作中不断得到加强。但是，苹果为多年生木本植物，通过常规育种选育抗性品种周期长。本发明从苹果中分离到了一个V-ATPase亚基基因MdVHA-B1，通过将其396位置处的丝氨酸残基突变为丙氨酸而得到MdVHA-B1S396A基因；将MdVHA-B1S396A基因在苹果愈伤中过量表达表明：它能够进一步提高其抗盐能力。通过实验证明转基因苹果愈伤抗盐能力提高，提供了一种新的、快速的育种途径，尤其是在转基因苹果砧木中，MdVHA-B1S396A基因的发掘不仅能为苹果抗逆基因工程提供新的候选基因，丰富植物抗逆基因工程理论体系，而且对于培育其它植物的抗逆种质材料(包括一年生植物和多年生木本植物)也具有重要的现实意义。

三、发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用，同时提供了该基因在获得抗逆，尤其是在抗盐的转基因苹果中的应用，并可应用于生产改良其他粮食作物或经济作物。

本发明中提供的苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A来自嘎啦苹果的cDNA。

本发明利用同源克隆获得了苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1，然后采用两轮搭桥PCR的方法获得单位点突变的MdVHA-B1S396A基因，MdVHA-B1S396A基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。具体方法如下：

从经200mM NaCl盐处理24h的嘎啦苹果组培苗中提取总RNA，反转录得到cDNA。利用拟南芥基因组数据库中已发布的拟南芥中V-ATPase亚基基因AtVHA-B1的核苷酸序列，在苹果基因组数据库中blast，找到同源序列(序列号MDP0000945182)，然后设计引物，以嘎啦苹果组培苗cDNA为模板进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain react ion,PCR)。将符合片段大小的PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，并进行测序分析确认，从而获得MdVHA-B1基因的cDNA全长序列。

MdVHA-B1基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1473bp。由此推得，该基因编码491个氨基酸，预测分子量约为54.50kDa。因该基因与拟南芥AtVHA-B1基因同源相似性为92.86％，因此我们将该基因命名为苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1，而将V-ATPase亚基基因MdVHA-B1396位置的Ser突变为Ala后的基因命名为MdVHA-B1S396A(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示)。

MdVHA-B1S396A基因序列如下：

序列表：

(1)SEQ.ID.NO.1的信息

(a)序列特征

长度：1473bp

类型：核酸

拓扑结构：线性

(b)分析类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：苹果(Malus domestica)

(f)序列描述：SEQ.ID.NO.1

<110>山东农业大学

<120>苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用

<160>26

<210>1

<211>1473

<212>cDNA

<213>苹果(Malus domestica)

<400>1

说明：开头下划线的3个碱基ATG为起始密码子，而最后下划线的3个碱基TGA为终止密码子；MdVHA-B1S396A基因的第1186位置处的保护碱基为G(鸟嘌呤)。

(2)SEQ.ID.NO.2的信息

(a)序列特征

编码区长度：491个氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线性

(b)分析类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ.ID.NO.2

说明：MdVHA-B1S396A蛋白的第396位置处的保护氨基酸为A(Ala，丙氨酸)。

本发明提供了位点突变后的苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A基因的在植物中的应用，能够进一步提高转基因植物抵抗盐胁迫的能力。步骤为：

(a)利用未突变的MdVHA-B1基因及单位点突变后的基因MdVHA-B1S396A，将它们的cDNA序列置于花椰菜病毒CaMV 35S启动子之下，构建植物过量表达载体。

(b)采用本领域熟知的方法，如LBA4404农杆菌介导的方法将构建好的表达载体导入植物细胞，得到转基因材料。

本发明涉及一种植物表达载体，包含如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列，用于进一步提高植物抗逆境能力，尤其是抗盐胁迫的能力。

本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，导入方法是本领域人员熟知的LBA4404农杆菌介导转化法，得到抗盐胁迫强的转基因植物。

基于苹果愈伤是一团未分化的细胞组织，具有离体培养再生能力强、遗传转化效率高，生长周期短等优点，成为生物学研究领域利用较多的材料。而木本植物苹果生活周期长，遗传转化效率低，在下述实施例中以苹果愈伤为例对本发明进行了详细的说明，但本发明中含有MdVHA-B1未突变及单位点突变后基因MdVHA-B1S396A的植物表达载体也可以用于转入其他植物，用于提高抗盐胁迫的能力。

本发明采用农杆菌介导转化的方法对获得的转基因苹果愈伤进行抗盐性分析发现，在苹果愈伤中过量表达MdVHA-B1未突变及单位点突变后基因MdVHA-B1S396A，均能显著提高其抗盐胁迫的能力；并且在苹果愈伤中过量表达单位点突变的MdVHA-B1S396A基因要比过量表达未突变的MdVHA-B1基因的抗盐能力高，说明MdVHA-B1基因氨基酸序列(SEQ.ID.NO.2)396位置处的丝氨酸残基能降低其抗盐性。大多植物一生都生活在各种各样的逆境条件中，另外将上述单位点突变后的基因MdVHA-B1S396A转化苹果、桃树、梨树、杨树等木本植物，或小麦、玉米、水稻等农作物，也能够提高转基因植株的抗逆境能力，提高其产量和品质，具有重大的经济效益和社会价值。

四、附图说明

图1：苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1的染色体定位及其基因组结构。

苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1定位在10号染色体靠近着丝粒的位置；它是由14个外显子和13个内含子组成。

图2：苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1在100mM NaCl处理条件下的表达模式。

从图中可以看出，MdVHA-B1基因受盐胁迫高度诱导，其中在100mM NaCl处理后6小时和9小时表达量最高。

图3：过量表达未突变的MdVHA-B1(MdVHAB1-S)，过量表达单位点突变的MdVHA-B1S396A(MdVHA-B1S396A-S)及抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)基因的转基因苹果愈伤的表达量检测。

从荧光定量PCR结果可以看出，MdVHA-B1基因在过量表达未突变的MdVHA-B1及过量表达单位点突变的MdVHA-B1S396A转基因愈伤中的表达量明显高于野生型；抑制表达MdVHA-B1基因的转苹果愈伤中MdVHA-B1基因的表达量最低。

图4：过量表达未突变的MdVHA-B1(MdVHAB1-S)，过量表达单位点突变的MdVHA-B1S396A(MdVHA-B1S396A-S)，抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)的转基因及野生型苹果愈伤的抗盐性分析。

从图中可以看出，在正常生长条件下，过量表达未突变的MdVHA-B1(MdVHAB1-S)和过量表达单位点突变的MdVHA-B1S396A(MdVHA-B1S396A-S)的转基因苹果愈伤生长状况基本一致，两者都稍好于野生型苹果愈伤，而抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)的转基因苹果愈伤生长相对最弱；当用200mM NaCl处理上述苹果愈伤10天后，结果发现，过量表达单位点突变的MdVHA-B1S396A(MdVHA-B1S396A-S)的转基因苹果愈伤生长要好于过量表达未突变的MdVHA-B1(MdVHAB1-S)的转基因苹果愈伤，前两者都明显好于野生型苹果愈伤，而抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)的转基因苹果愈伤基本不生长甚至死亡。以上结果说明，MdVHA-B1基因能够提高苹果愈伤的抗盐能力，396位置处的丝氨酸残基能适度的降低苹果愈伤的抗盐能力，将这一氨基酸突变为丙氨酸(Ala)后，MdVHA-B1S396A基因的抗盐能力在正常的MdVHA-B1基因的基础上进一步提高。

图5：过量表达未突变的MdVHA-B1(MdVHAB1-S)，过量表达单位点突变的MdVHA-B1S396A(MdVHA-B1S396A-S)，抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)基因的转基因及野生型苹果愈伤在0mMNaCl及200mM NaCl处理条件下V-ATPase的水解活性及H⁺转运活性的检测。

A、V-ATPase水解活性的检测。

V-ATPase水解活性与上述抗盐性分析结果一致，另外，盐能诱导V-ATPase水解活性的提高。

B、在200mM NaCl处理条件下V-ATPase H⁺转运活性的检测。

左图显示，野生型及3个转基因苹果愈伤株系在200mM NaCl处理条件下V-ATPase H⁺转运能力的曲线图；右图是对左边图中V-ATPase H⁺转运能力的量化统计。左图和右图都反映了过量表达单位点突变的基因MdVHA-B1S396A(MdVHA-B1S396A-S)H⁺转运能力最强；过量表达未突变的基因MdVHA-B1(MdVHAB1-S)H⁺转运能力其次；野生型苹果愈伤H⁺转运能力第三；抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)基因的转基因苹果愈伤H⁺转运能力最弱。

五、具体实例方式

以下结合具体实例，对本发明进行详细说明。

实施例1：苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1的克隆。

一)嘎啦组培叶片RNA提取及反转录

1、植物总RNA的提取

用RNAplant plus Reagent试剂盒小规模提取RNA操作步骤(材料一般是含淀粉和糖较多的组织，如苹果组织，样品质量<0.1g)：

取少于0.1g冷冻的研磨过的苹果组织材料，加0.5ml试剂盒提取试剂(4℃)，震荡至彻底混匀；

1)室温放置5分钟。注意：平放离心管，使表面积最大；

2)4℃，12000rpm离心1分钟，上清转入新的无RNA酶的离心管中；

3)加入0.1ml 5M NaCl，温和混匀；

4)加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀；

5)4℃，12000rpm离心10分钟，取上层水相转入新的无RNA酶的离心管中(注意：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可重复步骤4、5一次)；

6)向离心管中加入与步骤5)中上层水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；

7)4℃，12000rpm离心10分钟。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。沉淀中加入1ml浓度为75％的乙醇(沉淀可能很难看见，应小心操作)；

8)4℃，5000rpm离心3分钟。倒出液体，注意不要倒出沉淀。剩余少量的液体短暂的离心，然后用枪头吸出，室温晾干2-3分钟。

9)向离心管中加50μL无RNA酶的水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。如有絮状物，可在室温条件下12000rpm离心1分钟，取上清转入干净的无RNase的离心管中，-70℃保存。

10)在保存前可用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

2、cDNA第一链合成

1)除基因组DNA反应：

42℃,2min.(或室温反应5min)*2，然后4℃保存上述反应液。

*1：可以达到1μg的总RNA用于20μL的反转录反应。

*2：假若反应在室温中进行，反应可以进行约30min左右。

2)反转录反应：

37℃反应15min，然后85℃反应5秒钟，最后产生的RT产物4℃保存。

二)cDNA全长序列的获得

1)MdVHA-B1基因序列的扩增

在苹果基因组数据库中通过比对与拟南芥V-ATPase亚基基因AtVHA-B1同源的核苷酸序列，找到一个同源的序列，序列号为MDP0000945182，利用DNAMAN软件设计引物(MdVHA-B1-F,MdVHA-B1-R)，以实例1步骤一)反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

MdVHA-B1-F：5’-TCTCTTTCTTCCGCTTGGCTC-3’其序列如SEQ.ID.NO.3所示；

MdVHA-B1-R：5’-ACAACCGGGTGACAAGCTAAC-3’其序列如SEQ.ID.NO.4所示；

PCR扩增体系方法同MdSIMYB1专利(专利号201210197919.5)中实例1步骤四)中2)的PCR体系。

PCR反应程序：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性40秒、56℃退火40秒、72℃延伸90秒，进行35个循环；72℃充分延伸10分钟。

PCR反应结束后，PCR产物进行回收、载体连接、转化，在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定后，确定得到未突变的MdVHA-B1基因的cDNA全长序列。

2)MdVHA-B1基因396位置处的丝氨酸突变为丙氨酸

根据实例1步骤二)中1)获得的全长序列，设计搭桥引物进行PCR扩增。第一轮PCR扩增以实例1步骤一)获得的cDNA为模板，利用5’端突变后的一对引物(MdVHAB1S396A-F1/R1)和3’端突变后的一对引物(MdVHAB1S396A-F2/R2)分别进行PCR扩增。第二轮PCR扩增以第一轮的两种PCR产物为模板，以MdVHAB1S396A-F1和MdVHAB1S396A-R2为引物进行第二轮PCR扩增。第一轮PCR和第二轮PCR的扩增反应程序均为：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性40秒、56℃退火40秒、72℃延伸90秒，进行35个循环；72℃充分延伸10分钟。

MdVHAB1S396A-F1：5’-ATGGCTGTTTCACAAAACAATC-3’其序列如SEQ.ID.NO.5所示；

MdVHAB1S396A-R1：5’-ATAACTGATTTGATACATCATC-3’其序列如SEQ.ID.NO.6所示；

MdVHAB1S396A-F2：5’-GATGATGTATCAAATCAGTTAT-3’其序列如SEQ.ID.NO.7所示；

MdVHAB1S396A-R2：5’-TCAATTAGCGGTGTCTCTGCTG-3’其序列如SEQ.ID.NO.8所示；

PCR反应结束后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳、PCR产物回收、载体连接、转化、测序(具体步骤参见申请号为201210197919.5的专利中实例1步骤四)中的1)。得到未突变的MdVHA-B1基因及396位点的丝氨酸突变为丙氨酸的MdVHA-B1S396A基因序列全长。MdVHA-B1S396A的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。测序正确的单克隆，质粒小提试剂盒分别提取pMD18-T-MdVHA-B1及单位点突变pMD18-T-MdVHAB1S396A的质粒DNA，-20℃保存，用于后续功能验证实验。

实施例2：苹果MdVHA-B1基因染色体定位及其基因组结构

利用拟南芥基因组数据库中已发布的拟南芥中V-ATPase亚基基因AtVHA-B1的核苷酸序列，在苹果基因组数据库中blast，找到同源序列(序列号为MDP0000945182)。MdVHA-B1基因的染色体定位利用苹果网站(http://genomics.research.iasma.it/)基因组数据库；而基因组的结构预测利用(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)数据库(附图1)：苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1定位在10号染色体靠近着丝粒的位置；它是由14个外显子和13个内含子组成。

实例3：MdVHA-B1基因对盐胁迫的响应

(1)将生长状况较好的苹果嘎啦组培苗，用100mM NaCl分别处理0h、1h、3h、6h、9h、12h和24h后分别取样，于液氮中迅速固定，分别提取RNA并反转录得到各样品的cDNA。

(2)在MdVHA-B1基因的5’非编码区设计特异引物MdVHAB1(RT)-F,MdVHAB1(RT)-R及苹果的内参引物Md18S-F、Md18S-R。

Md18S-F：5’-AAACGGCTACCACATCCA-3’其序列如SEQ.ID.NO.9所示；

Md18S-R：5’-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’其序列如SEQ.ID.NO.10所示；

MdVHAB1(RT)-F：5’-TCTCTTTCTTCCGCTTGGCTC-3’其序列如SEQ.ID.NO.11所示；

MdVHAB1(RT)-R：5’-ACAACCGGGTGACAAGCTAAC-3’其序列如SEQ.ID.NO.12所示；

(3)用实例3步骤1)中所得的cDNA为模板，用苹果内参引物Md18S-F和Md18S-R调整这些cDNA模板，使各cDNA模板浓度一致。

反应程序为：94℃预变性4分钟；循环参数为94℃变性25秒、56℃退火25秒、72℃延伸30秒，运行25个循环；72℃后延伸l0分钟。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上做电泳分析，用Lab Ass istantTM Gel 3000Series凝胶成像分析仪检测条带亮度，据结果将cDNA稀释至适当倍数，使其浓度一致。

(4)用浓度一致的cDNA模板进行半定量RT-PCR，检测嘎啦组培苗经100mM NaCl处理不同时间后MdVHA-B1基因的表达差异。

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性25秒、58℃退火25秒、72℃延伸35秒，运行32个循环；72℃后延伸10分钟。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测分析。结果显示MdVHA-B1基因经100mM NaCl胁迫处理后表达上调，表明该基因受盐胁迫诱导(附图2)。

实施例4：MdVHA-B1及MdVHA-B1S396A基因表达载体的构建

一)MdVHA-B1及MdVHA-B1S396A基因过量表达载体的构建

为研究MdVHA-B1和MdVHA-B1S396A基因的功能，将分别包含有MdVHA-B1和MdVHA-B1S396A基因编码区在内的1473bp片段正确插入表达载体PBI121上。

(1)利用DNAMAN等软件，根据分离出的MdVHA-B1和MdVHA-B1S396A基因的核苷酸序列(SEQ.ID.NO:1)，设计带酶切位点的引物EMdVHA-B1-F/R和MdVHA-B1S396A-F/R)，以实施例1中提取并保存的pMD18-T-MdVHA-B1及单位点突变pMD18-T-MdVHAB1S396A的质粒DNA为模板，进行PCR反应。

EMdVHA-B1-F：5’-GAATTCATGGCTGTTTCACAAAACAATC-3’其序列如SEQ.ID.NO.13所示；

划横线部分为EcoRⅠ酶切位点；

EMdVHA-B1-R：5’-GGATCCTCAATTAGCGGTGTCTCTGCTG-3’其序列如SEQ.ID.NO.14所示；

划横线部分为BamHⅠ酶切位点；

EMdVHA-B1S396A-F：5’-GAATTCATGGCTGTTTCACAAAACAATC-3’其序列如SEQ.ID.NO.15所示；

划横线部分为EcoRⅠ酶切位点；

EMdVHA-B1S396A-R：5’-GGATCCTCAATTAGCGGTGTCTCTGCTG-3’其序列如SEQ.ID.NO.16所示；

划横线部分为BamHⅠ酶切位点；

(2)PCR反应结束后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳、PCR产物回收、载体连接、转化、测序。质粒小提试剂盒提取其质粒DNA，用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，鉴定正确后用于后面的实验。

(3)用EcoRⅠ和BamHⅠ两个内切酶，同时双酶切(实例4步骤一)中的2)所得质粒DNA与pBI121质粒，回收MdVHA-B1和MdVHA-B1S396A的片段和pBI121载体片段，用T4连接酶将二者连接起来。筛选阳性克隆进行测序，从中选择正确的重组子pBI121-MdVHA-B1和pBI121-MdVHA-B1S396A。

(4)用构建好的重组子pBI121-MdVHA-B1和pBI121-MdVHA-B1S396A转化农杆菌LB4404感受pBI121-MdVHA-B1S396A单克隆用于后面苹果愈伤的转化。

实例5：转基因愈伤的获得

(1)苹果王林愈伤组织的培养：苹果王林愈伤培养基为MS+1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，调pH至5.8左右。为了保证王林愈伤细胞的活性，要每2周继代一次，继代2-3次后，将生长状态极佳的王林愈伤，转入100ml上述新的苹果王林愈伤液体培养基中悬浮振荡培养(100rpm)，25(±1)℃黑暗中培养。注：苹果王林愈伤液体培养基除不含琼脂粉外，其它组分与苹果王林愈伤培养基相同；

(2)苹果愈伤组织的准备：准备侵染用的苹果王林愈伤，每隔2周左右继代一次；

(3)浸染：将待侵染的农杆菌菌体沉淀悬浮于MS液体培养基中，使终浓度OD600为0.5-0.6；将苹果王林愈伤移入上述菌液中浸泡20min左右，用无菌滤纸吸去表面菌液，转移至苹果王林愈伤培养基中，室温暗培养2-4d；

(4)洗菌：将侵染2-4d的王林愈伤用灭菌水(含250mg/L的头孢霉素)洗3-5次，洗掉残存的农杆菌；

(5)筛选：把洗完菌的愈伤铺在王林愈伤筛选培养基上(含250mg/L的头孢霉素和30mg/L的卡那霉素)；新长出的愈伤，用含250mg/L的头孢霉素和30mg/L的卡那霉素王林愈伤筛选培养基筛选至少3次；

(6)检测：对筛选出的抗性愈伤组织提取DNA，检测是否为转基因的苹果王林愈伤。然后，转MdVHA-B1和MdVHA-B1Ser396A基因的苹果王林愈伤用于后续抗盐能力的鉴定。注：材料消毒处理、侵染、接种等都在超净工作台上进行。

实例6：转基因苹果愈伤抗盐能力分析

为了确定转基因苹果愈伤的功能，我们对转基因苹果愈伤进行抗盐能力分析。

(1)过量表达未突变的基因MdVHA-B1(MdVHAB1-S)，过量表达单位点突变的基因MdVHA-B1S396A(MdVHAB1S396A-S)，野生型(WT)及抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)基因的转基因苹果愈伤的表达量。

通过抗生素(含100mg/L卡那霉素)筛选后的苹果愈伤转化细胞团，提取DNA,用35S-F(SEQ.ID.NO.17)和EMdVHA-B1-R(SEQ.ID.NO.14)为引物筛选转基因细胞团，对获得的转基因苹果愈伤细胞团提取RNA，进行荧光定量PCR检测，检测这些转基因细胞团中MdVHA-B1基因的表达水平。结果显示，MdVHA-B1基因在过量表达未突变的MdVHA-B1及过量表达单位点突变的MdVHA-B1S396A转基因愈伤中的表达量明显高于野生型；抑制表达MdVHA-B1基因的转苹果愈伤中MdVHA-B1基因的表达量最低(附图3)。然后这些细胞团进行后续转基因功能验证实验。

35S-F:5'-CGCACAATCCCACTATCCTT-3'其序列如SEQ.ID.NO.17所示

(2)转基因的苹果愈伤生长2周后，进行抗盐能力鉴定：

将生长状况良好的过量表达未突变的基因MdVHA-B1(MdVHAB1-S)，过量表达单位点突变的基因MdVHA-B1S396A(MdVHAB1S396A-S)及抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)基因的转基因及野生型苹果愈伤分别播于0mM NaCl和100mM NaCl苹果愈伤培养板上，置于暗处室温培养10天后，观察苹果愈伤细胞团的生长状况。结果显示，0mM NaCl处理上述苹果愈伤10天后，过量表达未突变的MdVHA-B1(MdVHAB1-S)和过量表达单位点突变的MdVHAB1S396A的转基因苹果愈伤生长状况基本一致，两者都稍好于野生型苹果愈伤，而抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)的转基因苹果愈伤生长相对最弱；而用200mM NaCl处理上述苹果愈伤10天后，过量表达单位点突变的MdVHA-B1S396A(MdVHAB1S396A-S)的转基因苹果愈伤生长要好于过量表达未突变的MdVHA-B1(MdVHAB1-S)的转基因苹果愈伤，前两者都明显好于野生型苹果愈伤，而抑制表达MdVHA-B1(MdVHAB1-AS)的转基因苹果愈伤基本不生长甚至死亡(附图4)。以上结果说明，MdVHA-B1基因能够提高苹果愈伤的抗盐能力，396位置处的丝氨酸残基适度的降低苹果愈伤的抗盐能力，将这一氨基酸突变为丙氨酸(Ala)后，其抗盐能力在正常的MdVHA-B1基因的基础上进一步提高。

实例7：转基因苹果愈伤V-ATPase水解酶活和H⁺转运酶活的分析

(一)液泡膜的提取

(1)分别取30g野生型，转MdVHA-B1和MdVHA-B1S396A基因苹果王林愈伤材料，加入200mL提取缓冲液，冰上充分研磨提取。提取缓冲液组分：0.2％BSA(w/v)，1％脱脂酪蛋白(w/v)，1％PVP(w/v)，5mM DTT，5mM EDTA，0.25M葡萄糖，0.25M果糖，1mM PMSF，20mMβ-巯基乙醇，用抗坏血酸调pH至8.2；

(2)用100μm的尼龙膜过滤，弃沉淀，保留上清；

(3)8000×g离心20min，移除高密度的细胞器；

(4)上述产生的上清液进一步的在100，000×g下离心40min，弃上清，保留沉淀；

(5)沉淀重新用20mL的混合液悬浮，100，000×g下离心40min。混合液组分：0.3M山梨醇，0.2％BSA(w/v)，0.5％PVP(w/v)，1mM EDTA，0.2M KCl，5mM DTT，1mM PMSF，25mM BTP-Mes(pH＝7.5)；

(6)液泡膜的纯化：将上一步的沉淀重新悬浮在浓度为0-30％一系列梯度的蔗糖溶液(包含5mM DTT和5mM BTP-Mes，pH调至7.5)中，100，000×g下离心2h；

(7)步骤6)中会出现分层，收集界面中的液泡膜，用20mL的清洗液重悬，清洗液组分：0.3mM甘露醇，0.5mM EDTA，5mM DTT，10mM BTP-Mes(pH 7.5)；

(8)100，000×g下离心40min，弃上清，保留沉淀；

(9)上一步产生的沉淀重新悬浮在20mL贮藏液中，然后液氮速冻，超低温保存；贮藏液组分：20％甘油(v/v)，0.5mM EDTA和10mM BTP-Mes(pH＝7.5)。

(二)液泡膜蛋白质含量的测定(Bradford法)

(1)标准曲线的制作

25μg/mL BSA母液的配制：称取2.5mg BSA，加入0.5mL上述膜蛋白提取缓冲液，用ddH2O定容至100mL，然后按下表制作一系列的BSA梯度液。从每个系列BSA梯度液中分别取4mL，加入1mL的考马斯亮蓝溶液，轻摇混匀，室温下静置5min，然后测定595nm处的光谱吸收值。以光谱吸收值和蛋白浓度作图绘制标准曲线。

(2)样品蛋白质含量的测定

取上述膜蛋白提取缓冲液20μL，加ddH2O至4mL，参照上述方法测样品的浓度值，根据上述标准曲线计算样品蛋白质的含量。

(三)液泡膜H⁺-ATPase水解活性的测定

反应体系为：

37℃水浴中反应30分钟，反应结束后加入2.5mL的终止液[0.1％SDS，0.7mM H2SO4(比重为1.84g/mL)，0.5％(NH4)2MoO4]和150μL 10％(w/v)的Vc，60min后(出现沉淀)，取上清用分光光度计在660nm处比色，测定反应液中的无机磷含量。

(四)液泡膜H⁺-ATPase H⁺转运活性的测定

液泡膜蛋白提取液在25℃恒温箱内孵育5min。然后按下列反应体系进行酶促反应，反应液总体积1mL中含20mM MES-KOH(pH＝7.0),140mM KCl,3mM ATPNa2,30mM吖啶橙,0.05％Brij58,50mg液泡膜蛋白。加入3mM MgSO4启动反应.反应4min后加入5μM短菌杆肽D,破坏质子跨膜梯度。用日立4010荧光分光光度计测定荧光猝灭，吖啶橙激发波长495nm,发射波长530nm，测定温度均为22℃。

(五)结果分析

V-ATPase水解活性及H⁺转运活性与上述抗盐性分析结果一致，另外，盐能诱导V-ATPase水解活性及H⁺转运活性的提高(附图5)。

根据上述技术，从苹果中分离到了一个V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A，通过在苹果愈伤中转基因功能分析发现：MdVHA-B1S396A基因能够提高苹果愈伤的抗盐能力。MdVHA-B1基因396位置处的丝氨酸残基适度的降低苹果愈伤的抗盐能力，将这一氨基酸突变为丙氨酸(Ala)后，MdVHA-B1S396A抗盐能力在正常的MdVHA-B1基因的基础上进一步提高。说明MdVHA-B1基因396位置处的丝氨酸能很大程度影响植物的抗盐胁迫应答反应。将该单位点突变的基因MdVHA-B1S396A转化小麦、玉米、棉花等一年生农作物，或苹果、梨等多年生木本植物，可提高其抗盐胁迫能力，从而提高其产量和品质，具有重要的经济效益和社会效益。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种苹果MdVHA-B1单个位点突变后的MdVHA-B1S396A基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2.如权利要求1所述的苹果MdVHA-B1S396A基因在提高苹果愈伤抗盐胁迫能力中的应用。