CN1916176B - 一种体外酶催化合成腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有酿酒酵母S.cerevisiae来源的腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶2基因的重组表达质粒，利用该重组表达质粒转化宿主菌获得的基因工程菌株，以及利用获得的基因工程菌株发酵生产SAM合成酶，以用于体外催化合成SAM的方法。利用本发明的方法可以实现大规模、低成本、高效率地生产SAM。

Description

一种体外酶催化合成腺苷甲硫氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种腺苷甲硫氨酸合成酶2基因的重组表达载体，转化有该重组表达载体的甲醇利用型毕赤酵母菌株以及利用该菌株发酵产生的腺苷甲硫氨酸合成酶在体外催化合成腺苷甲硫氨酸的方法。

背景技术

腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)是一种存在于所有活细胞中的重要代谢中间体。在生物体内，SAM由腺苷甲硫氨酸合成酶〔EC2.5.1.6〕催化腺苷三磷酸(ATP)和甲硫氨酸(Met)合成，在转甲基、转硫和转氨丙基等代谢途径中起重要作用，并且与多种酶的活性相关。在临床研究中，SAM对肝病、抑郁症、痴呆症、关节炎、帕金森氏病、睡眠紊乱、心脏病和空泡脊髓炎等有显著治疗作用，而且SAM是机体自然形成的物质，易被人体吸收、利用，副作用小，具备成为一流药物的有利条件。自20世纪70年代后期起，SAM分别在欧洲、美国以处方药、非处方药和营养保健品的形式热销。我国人口众多，有相当比例的肝病和关节炎患者，且随着生活节奏加快和工作压力加大，抑郁症患者明显增多。SAM具有显著的治疗和保健功效，副作用小，在我国必将有巨大的应用前景。

SAM的制备主要有化学合成、微生物发酵和体外酶催化合成等方法。化学合成法是将L-高半胱氨酸和甲基供体(CH3I)反应，生成(±)-SAM的混合物。由于该法产率低，反应试剂成本高，并且从混合物中拆分活性型(-)SAM困难，现在基本不采用。微生物发酵法是近年来工业生产SAM的主要途径。通过微生物发酵，尤其向培养基中添加一定量Met，在细胞内积累SAM(Shiozaki S et al.Agric.Biol.Chem.，1984，48(9)：2293～2300；袁中一等，CN 1357630A；袁中一等，CN 1385537A)；然后提取精制，获得SAM。但发酵后SAM的纯化工艺较复杂，且单位发酵体积中产出SAM量较低，所以现在正在开发更利于工业生产的体外酶催化合成法。Cantoni从肝脏提取SAM合成酶，用于体外合成试验(Cantoni GL.J.Bio.Chem.，1953，204：403)；Cross等从组织和酿酒酵母中分离得到SAM合成酶(Cross A et al.Appl.Biochem Biotechnol，1983，8(5)：415-451)。然而动物、植物和微生物中的SAM合成酶含量少、酶活低，分离纯化难，限制了体外酶法催化合成法的工业化。基因工程技术促进了该方法的快速发展。Markham等将含E.coli SAM合成酶基因(met K)的重组质粒转化E.coli K 12，重组菌表达的SAM合成酶含量是野生大肠杆菌的80多倍(Makham GD et al.J.Biol.Chem.，1980，255：9082)；Park等构建了表达酵母SAM合成酶的重组大肠杆菌，重组SAM合成酶在一定条件下反应20h，可使10mmol/L L-Met的转化率达80％(Park J.et al.Bioorg.Med.Chem.，1996，4(12)：2179)。

甲醇利用型酵母Pichia pastoris是近年来迅速发展的表达系统。它可以利用甲醇作为唯一碳源，具有强力的启动子，在大规模发酵中达到高密度的细胞生长和较高的外源基因表达率，特别适合外源基因调控表达。根据酵母利用甲醇的能力，分为以下两种表型：(1)Mut⁺，编码醇氧化酶(AOX)的基因AOX1，可在甲醇限制性培养基上正常生长，如宿主菌GS115；(2)Mut^S或Mut^-，AOX1基因缺失，利用较弱的AOX2基因启动合成AOX，酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢，如宿主菌KM71。野生型甲醇酵母细胞内SAM合成酶和SAM的含量都极低，通过对代谢途径的研究和利用基因工程技术，可对甲醇酵母细胞进行有目的的改造。

在S.cerevisiae细胞中，催化Met和ATP生成SAM的SAM合成酶有两种同功酶即SAM合成酶1和SAM合成酶2，两者氨基酸序列的一致性高达92％。SAM合成酶1负责合成细胞内的大部分SAM，但SAM合成酶1表现出较强的产物抑制现象，在过量Met存在下，它的转录受到抑制；而SAM合成酶2则表现出不同的调控方式，在细胞生长到稳定期前，SAM合成酶2随生长而增加(Thomas D.et al.Mol.Gen.Genet，1991，226：224～232)。

通过α因子分泌表达外源蛋白并在外源蛋白的一端加入6个组氨酸后，目的蛋白可与Ni离子螯合柱特异性结合，并结合固定化技术，将纯化和固定化蛋白一步完成。固定化酶可提高酶的稳定性和利用率，多次使用，催化底物反应，得到高纯度的产物。

随着基因重组、蛋白质表达、分离纯化和固定化酶技术的提高，以及Met、ATP等成本的降低，采用基因工程和酶工程等技术相结合的方法实现高效、经济地酶催化合成SAM会具有很大的工业化前景。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种含有酿酒酵母Saccharomuces cerevisiae来源的腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶2基因的重组表达质粒。

本发明的另一个目的在于提供一种基因工程菌株，该菌株转化有上述腺苷甲硫氨酸合成酶2基因的重组表达质粒。

本发明的又一个目的在于提供一种利用所述基因工程菌株发酵获得的SAM合成酶体外催化合成腺苷甲硫氨酸的方法。

为达到上述目的，本发明根据GeneBank公布的S.cerevisiae来源的SAM合成酶2基因(登陆号M23368)，设计两条专一引物，通过PCR扩增得到SAM合成酶2基因。然后将克隆得到的SAM合成酶2基因装配入甲醇酵母质粒pPIC9K，置于启动子AOX1的控制下，得到重组表达质粒pPIC9K-SAM2。并在SAM合成酶2基因的N端加入对应6个组氨酸的核苷酸序列，便于酶的纯化和固定化。

在获得重组表达质粒pPIC9K-SAM2后，将重组表达质粒酶切线性化，然后经电转化分别转入甲醇利用型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主细胞GS115(Mut⁺)和KM71(Mut^S)。pPIC9K-SAM2中的启动子序列或3’末端序列通过与Pichia pastoris染色体DNA同源重组，使外源的SAM合成酶2基因整合酵母染色体，并在重组细胞内稳定地表达。

宿主菌GS115和KM71在组氨醇脱氢酶基因(his 4)处有突变，阻止了组氨酸的合成。但表达质粒pPIC9K含有his 4基因，弥补了宿主菌his 4的缺陷。因此整合有表达质粒的甲醇酵母细胞能够在缺少组氨酸的培养基中生长，方便地利用缺少组氨酸的培养基筛选得到阳性克隆细胞。

通过对筛选到的转化菌株进行发酵，用分泌出的SAM合成酶催化Met和ATP反应生成SAM，根据同体积的SAM合成酶在相同酶反应条件下产生的SAM量的高低，筛选得到GS115和KM71的两株SAM合成酶高产菌株，分别命名为GS9KS和KM9KS。该两株菌株已于2006年7月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号分别为CGMCC No.1769和CGMCC No.1770。

由于转化宿主菌的重组表达质粒pPIC9K-SAM2含有α因子信号肽序列，能够诱导表达的蛋白分泌到细胞外，并且在SAM合成酶2基因的N端加入了对应6个组氨酸的核苷酸序列，所表达的SAM合成酶中的6个组氨酸能与Ni离子螯合柱特异性结合，因此发酵上清液可用Ni柱纯化除去杂蛋白，并直接将SAM合成酶固定化于在Ni柱上，从而实现酶的纯化和固定化一步完成。

通过使合成SAM的反应混合液(含D，L-Met和ATP)循环经过Ni柱，固定化在柱上的SAM合成酶催化Met和ATP合成SAM。

本发明的有益效果可归纳如下：

1、本发明首次构建了含有Saccharomuces cerevisiae来源的SAM合成酶2基因的重组表达质粒；经验证，该重组表达质粒pPIC9K-SAM2转化宿主菌后，转化菌发酵获得的SAM合成酶的酶活相比未转化的宿主菌提高了几十倍至上百倍。

2、本发明利用甲醇酵母高密度生长，高生物累积量的特点，将来源于S.cerevisiae的SAM合成酶2基因置于启动子AOX1的调控下；且pPIC9K含有α因子信号肽序列，属于分泌型质粒，能使甲醇酵母细胞重组表达SAM合成酶，并分泌到胞外，从而克服了现有的生产SAM方法中，酵母细胞内SAM含量很高但单位发酵体积中产出SAM低的缺点。工程菌分泌表达的SAM合成酶产量达200mg/L。

3、本发明在目的蛋白的N端加入了6个组氨酸的组氨酸标签，能与Ni²⁺特异性结合，因此将发酵后的培养液离心去除菌体后，可直接用Ni离子螯合柱快速、高效地纯化目的蛋白，并同时将SAM合成酶固定在Ni柱上，从而实现酶的纯化和固定化一步完成，不仅大大简化了纯化步骤，而且固定化酶的形式有利于提高酶的稳定性和利用率，固定化SAM合成酶被反复用于催化Met和ATP合成SAM。

4、本发明将反应底物由现有技术的L-Met改进为更廉价的D，L-Met，从而显著降低了生产成本。

5、本发明提供的方法可高效、大规模地生产SAM合成酶，并方便快捷地纯化、固定化此酶，增强酶的稳定性，提高酶的利用率，低成本、高效率地生产SAM。

附图说明

图1为重组表达质粒pPIC9K-SAM2的构建示意图。

图2为重组菌生产胞外SAM合成酶对应甲醇诱导时间的生产曲线。

具体实施方式

以下结合附图，以具体实施例对本发明作进一步的说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明所构建的转化有含有S.cerevisiae来源的SAM合成酶2基因的重组表达质粒pPIC9K-SAM2的SAM合成酶高产菌株GS9KS和KM9KS已于2006年7月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏号分别为CGMCC No.1769和CGMCC No.1770。

实验材料和方法

1、菌株和试剂

P.pastoris宿主菌GS115(his 4)和KM71(his 4)、酵母表达质粒pPIC9K均为Invitrogen公司产品。E.coli菌株DH12S用以进行克隆步骤。

T₄DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和限制性内切酶均购自Takara公司。细胞溶解酶购于Sigma公司。DNA胶回收试剂盒和质粒DNA抽提试剂盒购自上海博大生物公司。其他试剂均为市售分析纯试剂。

2、培养基

YPD(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)，RDB(1mol/L山梨醇，20g/L葡萄糖，13.4g/LYNB，4×10^-4g/L生物素，0.05g/L氨基酸)，BMGY(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，13.4g/LYNB，4×10^-4g/L生物素，10g/L甘油)，BMMY(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，13.4g/LYNB，4×10^-4g/L生物素，0.5％甲醇)

3、常规分子生物学操作

酵母基因组DNA的抽提，酵母细胞转化，基因克隆按奥斯伯等的方法(奥斯伯等.1995，精编分子生物学实验指南，第三版)进行。

实施例1、甲醇酵母重组分泌表达SAM合成酶2质粒pPIC9K-SAM2的构建

1、PCR扩增SAM合成酶2基因

根据GeneBank中公布的S.cerevisiae来源的SAM合成酶2基因(登陆号M23368)，设计两条专一引物：

5’引物：AATGAATTCACCATGCATCATCATCATCATCATGCCAAGAGCAAAACT；

3’引物：TAAGCGGCCGCAGCCTAGCATAAAGAAA；

设计的基因5’端引物包含了核糖体结合位点，同时引入了一个EcoR I酶切位点，以及对应6个组氨酸的核苷酸序列(该序列对应的6个组氨酸称为组氨酸标签，能够与Ni离子螯合柱特异性结合，因此发酵上清液可利用Ni离子螯合柱纯化除去杂蛋白，并直接将SAM合成酶固定在Ni柱上)。

基因3’端引物包含了终止密码子TAG附近的序列，并引入了一个Not I酶切位点。

抽提S.cerevisiae基因组染色体总DNA(奥斯伯等，1995，精编分子生物学实验指南，第三版)，以S.cerevisiae染色体DNA为模板，加入一定量的引物、Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，进行PCR扩增，反应条件如表1：

表1

PCR产物经1％琼脂糖电泳检验后，采用上海博大生物公司PCR产物回收试剂盒回收1200bp的PCR扩增片段。

2、重组表达质粒的构建

用EcoR I和Not I双酶将SAM2基因从PCR扩增片段中切出，经测序验证，其序列与GeneBank中发表的SAM2基因序列完全相同。

将获得的SAM2基因装配入经EcoR I和Not I双酶切的甲醇酵母质粒pPIC9K(带有AOX1启动子，α因子分泌信号肽，组氨醇脱氢酶基因以及卡那霉素抗性基因)，得到重组表达质粒pPIC9K-SAM2。

图1显示了重组表达质粒pPIC9K-SAM2的构建过程。

实施例2、表达外源SAM合成酶2重组细胞的构建

1、电转化甲醇酵母细胞的制备

分别接种GS115和KM71于50ml YPD培养基，28～30℃培养至OD₆₀₀为1.3～1.5，4℃、1500g离心10min，菌体沉淀用50ml冷冻无菌水、25ml冷冻无菌水和2ml 1M冷冻山梨醇各洗一次，每次洗后均4℃、1500g离心10min并收集菌体，最后将离心后细胞用100μl 1M冷冻山梨醇重悬，即获得电击感受态细胞。

2、重组表达质粒pPIC9K-SAM2电转化感受态酵母细胞

将构建好的重组表达质粒pPIC9K-SAM2约10μg用Sac I酶切线性化，乙醇沉淀回收线性化DNA并溶解于10μl无菌水中，同时将空载体pPIC9K质粒用相同的酶切线性化并回收作对照。

将上述线性化DNA分别与80μl GS115和KM71电转化细胞混合，采用Bio-Rad电转化仪GenePulser电击转化，电转化条件为：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω。

电转后立即向电转化杯中加入1ml 1M预冷的山梨醇，并将转化产物转移到无菌微量离心管中，取200～600μl涂布于RDB平板，28～30℃培养直到出现单菌落。

3、PCR鉴定含有外源SAM合成酶2基因的重组酵母细胞

从RDB平板上挑单菌落，用10μl水重悬，然后加入5μl 5U/μl的细胞溶解酶溶液，30℃保温10min，再浸泡在液氮中1min。

以处理过的酵母细胞为模板，加入一定量的引物(5’AOX1引物和3’AOX1引物)、Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，进行PCR扩增。

其中：5’AOX1引物：GACTGGTTCCAATTGACAAGC；

3’AOX1引物：GCAAATGGCATTCTGACATCC；

反应条件如表2所示：

表2

PCR产物经1％琼脂糖电泳检验，GS115(Mut⁺)重组菌有1692bp和2200bp两条带；KM71(Mut^S)重组菌有3600bp一条带，均与理论值相吻合。

4、高拷贝重组菌的筛选

重组菌株对于G418的抗性程度大致与载体的拷贝数相关，因此，利用带有卡那霉素抗性基因的表达质粒，如pPIC9K，可根据G418抗性的强弱筛选多拷贝重组菌株。

在生长出电转化细胞的RDB平板上，加入1ml无菌水，用涂布棒耙下菌体。重悬菌液，离心。倾去上清，0.5ml无菌水再重悬。适当稀释后取100μl涂布含有G418(0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5mg/ml)的YPD平板，30℃培养4～6天。

将筛选出的G418抗性菌株接种到YPD培养基中，于30℃培养16～18小时。然后以1％的接种量接种到50ml BMGY培养基中，28～30℃培养至OD600为2～6，室温、3000g离心5min，菌体沉淀用10ml BMMY重悬，28～30℃继续培养，每24小时补加甲醇至终浓度为0.5％。

诱导至第160小时取菌液，4℃、10000g离心20min，上清是粗酶液。通过比较来源于不同转化菌株的SAM合成酶在相同酶液体积和相同酶反应条件下产生的SAM的量分别筛选出GS115和KM71的高产菌株，具体酶反应见实施例7。

通过以上步骤筛选得到GS115和KM71的两株SAM合成酶高产菌株，分别命名为GS9KS和KM9KS。该两株菌株并已于2006年7月31日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCC No.1769和CGMCC No.1770。

实施例3、重组菌株GS9KS的发酵

将筛选出来的GS9KS高产菌接种到3ml YPD试管中，28～30℃，300r/min培养过夜，以1％的接种量接入200ml BMGY培养基中，28～30℃培养至OD600为2～6，室温3000g离心5min，菌体沉淀用40ml BMMY重悬，28～30℃继续培养，每24小时补加甲醇至终浓度为0.5％。

诱导过程中每隔约24小时取菌液，4℃、10000g离心20min，取上清粗酶液，以实施例7的方法催化合成SAM，然后以实施例8的方法测定SAM合成酶的产量，以甲醇诱导时间对SAM合成酶产量作图，结果如图2所示。

由图2的结果可见，连续诱导约160小时SAM合成酶产量达到最高，约为49mg/L。

实施例4、重组菌株KM9KS的发酵

将筛选出来的KM9KS高产菌接种到3ml YPD试管中，28～30℃，300r/min培养过夜；以1％的接种量接入200ml BMGY培养基中，28～30℃培养至OD₆₀₀为2～6，室温下3000g离心5min，菌体沉淀用40ml BMMY重悬，28～30℃继续培养，每24小时补加甲醇至终浓度为0.5％。

诱导过程中每隔24小时取菌液，于4℃、10000g离心20min，取上清粗酶液，以实施例7的方法催化合成SAM，然后以实施例8的方法测定SAM合成酶的产量，以甲醇诱导时间对SAM合成酶产量作图，结果如图2所示。

由图2的结果可见，同样是连续诱导约160小时，SAM合成酶产量达到最高，约为200mg/L。

实施例5、SAM合成酶的纯化和固定化

分别取GS9KS和KM9KS两菌株发酵后的菌液，于4℃、15000g离心20min，取上清，用1M碱性Tris调节pH值到7.5，再次4℃、15000g离心30min。

上清粗酶液用结合缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.9)适当稀释后上Ni离子螯合柱，然后分别用6倍柱体积的结合缓冲液和4倍柱体积的洗涤缓冲液(20mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.9)冲柱。

由于转化菌株的重组表达质粒pPIC9K-SAM2上加入了6个组氨酸的组氨酸纯化标签(对应6个组氨酸的核苷酸序列)，因此SAM合成酶可特异性地结合在Ni离子螯合柱上面，从而实现SAM合成酶的纯化和固定化一步完成，偶联效率为97.9％。

实施例6、固定化酶催化反应合成SAM

在37℃下，使合成SAM的反应混合液(20mM D，L-Met，26mM ATP，8mM还原型谷胱甘肽，52mM MgCl₂，300mM KCl，100mM Tris，用KOH调至pH为8～9)循环经过Ni柱，柱内的固定化SAM合成酶催化Met和ATP合成SAM，具体反应式如下：

经过3次连续循环反应测定，固定化SAM合成酶的活力回收率为39.5％，比活力约是游离酶的40.4％。

实施例7、SAM合成酶活性的测定

设定反应体系1ml，其中有20mM D，L-Met，26mM ATP，8mM还原型谷胱甘肽，52mM MgCl₂，300mM KCl，100mM Tris，用KOH调至pH为8～9。加入适量SAM合成酶粗酶液(发酵上清液)催化反应，并同时以不加入D，L-Met的反应作空白对照。在37℃温育60min后，加入1ml 20％的高氯酸溶液终止反应。离心除去沉淀，上清为含有SAM的混合液。

实施例8、高压液相色谱(HPLC)法定量SAM

SAM分子中的硫原子带有正电荷，这个特性使其可以用HPLC的离子交换柱分析检测，具体测定条件如下：

采用强阳离子型离子交换柱Hypercil 10SCX(4.6×250mm)，流动相为0.5M甲酸铵(pH4.0)，流速2.0ml/min，检测254nm光密度。SAM保留时间约30min，受室温和pH的影响会轻微波动，前后偏差1min左右。

采用外标法，根据以不同浓度的SAM标准品峰面积绘制的标准曲线为样品(实施例7获得的上清含SAM混合液)中的SAM定量，结果如表3所示。

表3、重组菌和野生菌SAM合成酶产量及酶活力的比较

由表3的结果可见，转化菌株GS9KS和KM9KS的酶活力分别达到0.228克SAM/小时/升发酵上清液和0.932克SAM/小时/升发酵上清液，而未转化的宿主菌的酶活则均小于0.005克SAM/小时/升发酵上清液，转化菌株的酶活力提高了45倍和186倍以上。

综上所述，本发明所构建的含有酿酒酵母Saccharomuces cerevisiae来源的SAM合成酶2基因的重组表达质粒pPIC9K-SAM2，转化宿主菌后，能够使转化菌株分泌的SAM合成酶的活力得到非常显著的提高，并且可以实现大规模的生产SAM合成酶；由于其使用的合成SAM的底物是以D，L-Met替代L-Met，而且采用固定化酶的形式，因而可以实现大规模、低成本、高效率地生产SAM。

Claims (11)

1.一种甲醇利用型巴斯德毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)，其特征在于，该菌株经G418抗性筛选，高拷贝地转化有一种含有酿酒酵母(Saccharomuces cerevisiae)来源的腺苷甲硫氨酸合成酶2基因的重组表达质粒，分泌表达腺苷甲硫氨酸合成酶，且该菌株的保藏号为CGMCC No.1769或CGMCC No.1770。

2.一种体外催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、利用权利要求1所述的菌株发酵产生腺苷甲硫氨酸合成酶；

B、在体外利用获得的腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物Met和ATP合成腺苷甲硫氨酸，反应式如下：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述底物Met为D，L-Met。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括将发酵液中的腺苷甲硫氨酸合成酶进行纯化和固定化的步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纯化和固定化是一步完成。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述纯化和固定化一步完成是通过将发酵液离心后，以上清粗酶液上Ni离子螯合柱，然后分别用结合缓冲液和洗涤缓冲液固定腺苷甲硫氨酸合成酶并洗去杂蛋白。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述用于体外催化合成腺苷甲硫氨酸的腺苷甲硫氨酸合成酶为固定化酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述固定化酶是固定化于Ni离子螯合柱上。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述催化合成反应是使含有Met和ATP的反应混合液循环经过固定有腺苷甲硫氨酸合成酶的Ni离子螯合柱。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含有Met和ATP的反应混合液的组成为：20mM D，L-Met，26mMATP，8mM还原型谷胱甘肽，52mM MgCl₂，300mM KCl，100mM Tris，并用KOH调至pH为8～9。

11.如权利要求7～10中任一项所述的方法，其特征在于，所述催化合成腺苷甲硫氨酸的反应的温度为37℃。

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