CN101870964B

CN101870964B - 一种提高sam合成酶表达量的方法

Info

Publication number: CN101870964B
Application number: CN201010181293XA
Authority: CN
Inventors: 熊国裕; 吉春; 周德胜
Original assignee: BEIJING KAWIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd; BEIJING KAWIN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Furui Tiancheng Biotechnology Co ltd; Beijing Kawin Technology Share Holding Co ltd
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2010-05-25
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-05-25
Also published as: CN101870964A

Abstract

本发明提供了一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法。该方法通过选择性添加二价金属离子和絮凝剂，可使工程菌在发酵液中的SAM表达量提高，同时，可以使发酵液浊度下降从而更利于酶的进一步提取制备。

Description

一种提高SAM合成酶表达量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高SAM合成酶表达量的方法，属于生物制药技术领域。

背景技术

中国是人口大国，同时也是“肝炎大国”。据1992年全国病毒性肝炎流行病学调查，全国约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率为3.1％。我国现有2000万例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能转化为肝硬化，甚至肝癌。

腺苷蛋氨酸(SAM)是人体内一种极为重要的中间代谢产物。它可以通过转硫途径生成体内关键的抗氧化及解毒物质——半胱氨酸，再生成另一种关键的抗氧化和解毒物质——谷胱甘肽，解除肝内的氧化物应激状态，从而达到防治肝病的目的。另外SAM还可以促进依赖性脂磷脂的合成，降低胆固醇和磷脂的比例，恢复细胞膜的流动性，促进胆汁的主动转运和甘油酸三脂的分泌。因此SAM对肝内胆汁郁积、各种急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝硬化等肝脏疾病有很好的疗效。SAM于20世纪80年代出现在欧洲医药市场上，1999年美国FDA正式批准SAM上市，使其迅速成为畅销的营养保健品之一，年销售额超过10亿美元。由于其疗机理清楚、效显著、起效快、副作用小，近年来在国内的需求量也越来越大，有广阔的市场前景。

目前，SAM的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。

化学合成法采用S一腺苷同型半胱氨酸(S-adenosythomocysteine)和甲基供体(CH3I)合成，腺苷蛋氨酸有(+)和(一)两种构型，只有(一)构型才有生物活性，但合成产物中含有大量(+)腺昔蛋氨酸，且难以分离。发酵法采用在培养基中添加L-甲硫氨酸，用酵母发酵生产(一)型腺苷蛋氨酸，是60年代至80年代生产腺普蛋氨酸的主要方法。酶促转化法主要利用腺苷蛋氨酸合成酶催化底物L一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔蛋氨酸。酶作为生物催化剂具有快速、专一的特点，因此酶促转化法生产腺苷蛋氨酸具有高效、工艺简单、产品生物活性高且无污染的优势。

腺苷蛋氨酸合成酶又称腺苷甲硫氨酸合成酶，广泛存在于动、植物和微生物体内，随后又有人从大肠杆菌和酵母菌中分离腺苷蛋氨酸合成酶并用于腺苷蛋氨酸的制备，但是腺苷蛋氨酸合成酶在动、植物和微生物体内含量少、酶活性不高，且分离纯化困难，例如400g酵母干细胞只能分离纯化得到8U腺苷蛋氨酸合成酶，比活力为0.05U/mg。大肠杆菌腺苷蛋氨酸合成酶由Mr为43000的4个相同亚基组成，亚基含384个氨基酸残基。酵母的腺苷蛋氨酸合成酶有2种类型，并分别以二聚体和四聚体的形式存在，这2种类型的酶分别由2个不连锁的基因-sam1和sam2所编码；大鼠腺苷蛋氨酸合成酶在大鼠肝脏、肾脏、脑组织种都含有，其中在大鼠肝脏内有高分子量和低分子量2种腺苷蛋氨酸合成酶，高分子腺苷蛋氨酸合成酶Mr为43647，其cDNA克隆与met K有52％同源性。

近年来随着基因技术的不断发展，不同生物来源的腺苷蛋氨酸合成酶的编码基因已有较多报道(张建国，李新华，袁中一.腺苷甲硫氨酸合成酶的基因及结构研究进展.工业微生物[J].2005，35(3)：39-44)，如大肠杆菌腺苷蛋氨酸合成酶(SAMS)是由met K基因编码，Markham et al最先测定了met K的DNA序列和酶的氨基酸序列，met K长1152bp，编码区上游有明显对称的操纵子序列没变吗383个氨基酸，酶的亚基为41941Da。Chiang et al等通过DEAE-纤维素从酿酒酵母中分离得到两种腺苷蛋氨酸合成酶(sams I和sams II)，它们分别以四聚体和二聚体的形式存在；Cherest et al证明着两种酶分别由两个独立的基因(sam2，sam1)编码。Sam1位于ETH10，长1149bp，编码382个氨基酸，sams II亚基为41800Da；sam2位于ETH2，1152bp，编码384个氨基酸，sams I亚基为42300Da。Saburo H从λgt11文库中分离得到大鼠肝脏MAT1A的cDNA，其编码的亚基为43647Da，大鼠的MAT1A基因是单拷贝，它的转录开始于TATA后29bp处(帽子结构)，启动子位于-1405～-958bp，序列分析表明这个区域和转录因子HP-1、NF-1、HNF-3符合，-193bp～-87bp结合HNF-4，-518bp～366bp结合阻遏物，-958bp～-727bp和-375bp～-193bp结合激活物。另外，很多其它来源的腺苷蛋氨酸合成酶基因，如微生物中枯草芽孢杆菌的SAMS是metE编码的400个氨基酸。

采用基因工程重组技术获得表达腺苷蛋氨酸合成酶的工程菌并将所得工程菌用于不同菌种中通过发酵表达得到腺苷蛋氨酸合成酶已是现有技术中一种较为成熟的技术。陶敏等(陶敏，干信.S-腺苷甲硫氨酸合成酶在大肠杆菌中的表达与克隆.生物技术[J].2006，16(3)：20-22)通过克隆与表达大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因，在大肠杆菌中表达出了具有生物活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。杨静等(杨静，孙进，等.酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达.中国药科大学学报[J].2002，33(3)：253-255)通过构建S腺苷甲硫氨酸合成酶基因工程菌，将构建的工程菌在大肠杆菌中高效表达出了S-腺苷甲硫氨酸合成酶，为酶促转化法生产S-腺苷甲硫氨酸奠定了基础。罗赟星等(罗赟星，袁中一，等.S-腺苷甲硫氨酸合成酶反应条件的优化.工业微生物[J].2008，38(2)：6-10)以带有酿酒酵母基因的甲醇营养型重组毕赤酵母为实验菌株，通过发酵得到了SAM合成酶。

要将酶促合成法应用于工业化生产，大量获得催化用的腺苷蛋氨酸合成酶成为关键。而现有技术中，大量获取催化用的腺苷蛋氨酸合成酶的途径是通过基因工程重组技术获取高效表达腺苷蛋氨酸合成酶工程菌，再将工程菌在不同微生物菌株中发酵表达腺苷蛋氨酸合成酶。本发明采用基因工程重组技术，获得了高效表达腺苷蛋氨酸合成酶的工程菌，在用工程菌发酵表达腺苷蛋氨酸合成酶的基础上，通过在发酵过程中选择性的加入二价金属离子，提高了合成酶在工程菌中的表达量，同时在发酵液中加入了絮凝剂，更有利于后期酶的提取，以更为大规模地制备腺苷蛋氨酸合成酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高SAM合成酶表达量的方法。

具体地，本发明所述的方法为将重组大肠埃希氏菌CGMCC No.2299接种到发酵基础培养基中发酵，其中所述发基础培养基中选择性的加入二价金属离子和絮凝剂。其中重组大肠埃希氏菌株已于2007年12约26被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2299，该菌种已在中国专利申请CN101392230A中公开记载。

本发明中，所加入的二价金属离子为Cu²⁺、Mg²⁺或Zn²⁺中的任意一种，所加入的絮凝剂为磷酸氢二钠和氯化钙。

本发明中，所加入的二价金属离子的量为0.02～0.15g/100ml培养基，所加入的絮凝剂磷酸氢二钠的量为0.2～0.5g/100ml培养基，所加入的絮凝剂氯化钙的量为0.001g～0.005g/100ml培养基

优选地，该发酵方法的配方如下：

(1)种子培养基(LB培养基)：蛋白胨∶酵母粉∶氯化钠＝2∶1∶2

(2)发酵基础培养基(g/100ml培养基)：

葡萄糖：1.47 蛋白胨：0.4

酵母粉：0.55 磷酸二氢钾：0.4

磷酸氢二钾：0.3 磷酸氢二钠：0.35

硫酸铵：0.047 硫酸镁：0.05

氯化铵：0.01 硫酸亚铁：0.002

氯化钙：0.002 硫酸锰：0.0007

200mg/ml氧化四环素：0.0125(V/V)

(3)补料培养基(g/100ml培养基)：

葡萄糖：1.12 酵母粉：0.55

硫酸镁：0.035

发酵方法如下：

将含有重组菌的甘油种以1∶100的比例接入一级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。

将一级种子液以1∶20的比例接入二级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。

将二级种子液以1∶6接入种子罐，37℃、溶氧40～60、PH7.0。

当种子罐中菌液的OD600＝1.5～2.0时，按1∶10的比例接入发酵罐中发酵，发酵条件为温度37℃、溶氧60～90、PH7.0。

在大罐开始发酵1个小时后开始以流加的方式补料。

发酵的过程中监控发酵液的PH值、OD600、溶氧、浊度等各项参数，当发酵液的OD600为12～13时，发酵进入平衡期后停止发酵，收集菌体，取样测量目的蛋白的表达量。

采用本发明所述的方法，通过选择性添加二价金属离子和絮凝剂，可以显著提高工程菌种在培养基中的SAM合成酶的表达量，并由于通过添加絮凝剂，使发酵液中的悬浮颗粒聚集沉淀，发酵液的浊度显著下降，有利于下一步酶的提取，对酶促催化腺苷蛋氨酸的工业化生产具有重要意义。

具体是实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。实验中所用到的主要试剂及设备

1、主要材料

所用工程菌：重组大肠埃希氏菌(携带腺苷蛋氨酸合成酶的metK基因)，公司自主构建，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2299，并已在中国专利申请CN101392230A中公开记载。

本次试验所用的蛋白胨、酵母粉购于OXOID公司；葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁购于北京凤礼精求公司；硫酸铵、氯化铵、硫酸亚铁、氯化钙、硫酸锰、氯化钠购于北京化学试剂厂；氧化四环素购于Sigma公司。

2、主要设备

恒温摇床：Infors公司；电泳仪：Bio-Rad公司；紫外投射仪及其成像装置：法玛西亚公司；发酵罐：比欧公司。

实施例1未加二价金属离子和絮凝剂的发酵实验

一、发酵液的配制：

按以下配方分别配制种子培养基、发酵培养基和补料培养基：

(1)种子培养基(LB培养基)：蛋白胨∶酵母粉∶氯化钠＝2∶1∶2

(2)发酵基础培养基(g/100ml培养基)：

葡萄糖：1.47 蛋白胨：0.4

酵母粉：0.55 磷酸二氢钾：0.4

磷酸氢二钾：0.65 硫酸铵：0.047

氯化铵：0.01 硫酸亚铁：0.002

硫酸锰：0.0007

200mg/ml氧化四环素：0.0125(V/V)

(3)补料培养基(g/100ml培养基)：

葡萄糖：1.12 酵母粉：0.55

硫酸镁：0.035

二、发酵过程：

(1)将含有重组菌的甘油种以1∶100的比例接入一级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。

(2)将一级种子液以1∶20的比例接入二级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。

(3)将二级种子液以1∶6接入种子罐，37℃、溶氧40～60、PH7.0。

(4)当种子罐中菌液的OD600＝1.5～2.0时，按1∶10的比例接入发酵罐中发酵，发酵条件为温度37℃、溶氧60～90、PH7.0。

(5)在大罐开始发酵1个小时后开始以流加的方式补料。

(6)发酵的过程中监控发酵液的PH值、OD600、溶氧、浊度等各项参数。

发酵过程如下表所示：

(7)8.5小时后停止发酵，取样用SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳测定其中SAM合成酶的表达量，测定目的酶的表达量占菌体可溶性蛋白的30.8％。实施例2加入Mg²⁺和絮凝剂的发酵实验

一、发酵液的配制：

(1)种子培养基(LB培养基)(％)：蛋白胨∶酵母粉∶氯化钠＝2∶1∶2

(2)发酵基础培养基(g/100ml培养基)：

葡萄糖：1.47 蛋白胨：0.4

酵母粉：0.55 磷酸二氢钾：0.4

磷酸氢二钾：0.3 磷酸氢二钠：0.35

硫酸铵：0.047 硫酸镁：0.05

氯化铵：0.01 硫酸亚铁：0.002

氯化钙：0.002 硫酸锰：0.0007

200mg/ml氧化四环素：0.0125(V/V)

(3)补料培养基(g/100ml培养基)：

葡萄糖：1.12 酵母粉：0.55

硫酸镁：0.035

二、发酵过程：

(3)将二级种子液以1∶6接入种子罐，37℃、溶氧40～60、PH7.0。

(5)在大罐开始发酵1个小时后开始以流加的方式补料。

(6)发酵的过程中监控发酵液的PH值、OD600、溶氧、浊度等各项参数。发酵过程如下表所示：

(7)8.5小时后停止发酵。8.5小时后停止发酵，取样用SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳测定其中SAM合成酶的表达量，测定目的酶的表达量占菌体可溶性蛋白的41.4％，相对未加Mg²⁺的表达量提高了10.6％，同时发酵液浊度下降了7.8，有利于酶的提纯。

实施例3加入Zn²⁺和絮凝剂的发酵实验

重复实施例2的步骤，所不同的是发酵基础培养基中，所加入的Zn²⁺的量为0.15g/100ml培养基，所加入的絮凝剂磷酸氢二钠的量为0.2g/100ml培养基，所加入的絮凝剂氯化钙的量为0.001g/100ml培养基，其它条件相同。

8.5小时后停止发酵，8.5小时后停止发酵，取样用SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳测定其中SAM合成酶的表达量，测定目的酶的表达量占菌体可溶性蛋白的36.7％，相对实施例1(未加入此二价金属离子)，SAM合成酶的表达量提高了5.9％；8小时后的浊度为12.2，下降了6.5。

实施例4加入Cu²⁺和絮凝剂的发酵实验

重复实施例2的步骤，所不同的是发酵基础培养基中，所加入的Cu²⁺的量为0.03g/100ml培养基，所加入的絮凝剂磷酸氢二钠的量为0.5g/100ml培养基，所加入的絮凝剂氯化钙的量为0.005g/100ml培养基，其它条件相同。

8.5小时后停止发酵，8.5小时后停止发酵，取样用SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳测定其中SAM合成酶的表达量，测定目的酶的表达量占菌体可溶性蛋白的38.1％，相对实施例1(未加入此二价金属离子)，SAM合成酶的表达量提高了7.3％；8小时后的浊度为13.7，下降了5.0。

Claims

1.一种提高SAM合成酶表达量的方法，其特征在于将重组大肠埃希氏菌CGMCC No.2299接种到发酵基础培养基中发酵，其中所述发基础培养基中加入二价金属离子和絮凝剂，所述二价离子为Cu²⁺、Mg²⁺或Zn²⁺中的一种，所述絮凝剂为磷酸氢二钠和氯化钙，所述二价金属离子的加入量为0.02～0.15g/100ml培养基，所述絮凝剂的加入量为磷酸氢二钠0.2～0.5g/100ml培养基，氯化钙为0.001～0.005g/100ml培养基。

2.根据权利要求1所述的提高SAM合成酶表达量的方法，其中所述二价金属离子为Mg²⁺，Mg²⁺加入量为0.05g/100ml培养基，所述磷酸氢二钠的加入量为0.35g/100ml培养基，所述氯化钙的加入量为0.002g/100ml培养基。

3.根据权利要求1所述的提高SAM合成酶表达量的方法，其中所述二价金属离子为Zn²⁺，Zn²⁺的加入量为0.15g/100ml培养基，所述磷酸氢二钠的加入量为0.2g/100ml培养基，所述氯化钙的加入量为0.001g/100ml培养基。

4.根据权利要求1所述的提高SAM合成酶表达量的方法，其中所述二价金属离子为Cu²⁺，Cu²⁺的加入量为0.03g/100ml培养基，所述磷酸氢二钠的加入量为0.5g/100ml培养基，所述氯化钙的加入量为0.005g/100ml培养基。